使用 TiO₂ 光催化在水相环境中对蛋白质和细胞进行光图案化

以下实验的总体目标是利用二氧化钛的光催化活性，对细胞培养支架进行表面改性。该过程首先在玻璃盖玻片上沉积一层薄薄的二氧化钛，然后用八甲基环四硅氧烷（Octa dessaline）进行涂层，从而使整个表面具有疏水性。第二步，将基底浸入含有血清白蛋白的细胞培养基中，以封闭表面。

白蛋白吸附到表面，使表面不能支持细胞黏附。接着，将样品转移至含有胶原蛋白的水溶液中，并使用聚焦的紫外光照射该表面。这使得胶原蛋白分子选择性地吸附到被紫外光照射的区域，从而使该区域能够支持细胞黏附。

该过程可重复进行，以实现多种蛋白质或细胞类型的图案化。本视频中，我们展示了如何通过紫外光照射选择性地修饰 PC 12 细胞的黏附区域。当我们意识到二氧化钛光催化已作为自清洁玻璃窗的商业应用，可在光照下分解表面有机污染物时，便提出了该方法的设想，该实验将由我实验室的一名研究生共同负责。

首先使用金刚石刻写笔对盖玻片进行编号，编号方式应有助于确保样本的正确面朝上。然后先用流动的双蒸水冲洗盖玻片进行初步清洁，再将其浸入piranha溶液中10分钟。10分钟后，用双蒸水冲洗盖玻片八次，并在氮气流下吹干。

接下来，将二氧化钛靶材装入射频溅射系统中，然后使用聚酰亚胺胶带将洁净的盖玻片固定在样品托上，将样品托放入溅射腔室，并对腔室抽真空，直至压力降至 2.0 × 10⁻⁴ 帕斯卡。随后向腔室内通入氩气，并在保持快门关闭的情况下，将沉积压力设定为 4.0 mTorr。逐步将射频功率升高至 70 瓦。

然后打开快门，溅射15分钟，以获得厚度为120至150纳米的薄膜。首先，将玻璃烧杯和镊子放入烘箱中，在120摄氏度下干燥30分钟。接着，将盖玻片放入等离子体反应器中，以100标准毫升/分钟的氧气流速，在200瓦功率下用氧气等离子体处理二氧化钛表面5分钟，以形成更具亲水性的表面。

然后取出样品，浸入双蒸水中，以确认表面具有超亲水性，并在氮气流下将表面彻底干燥。接着，将样品、干燥的烧杯和镊子放入充满氮气的手套袋中，配制浓度为一毫摩尔的八氯三氯乙烯甲苯溶液。将样品在室温下浸入该溶液中一小时，以在二氧化钛表面形成自组装单分子层。

然后依次用甲苯、丙酮、乙醇对样品进行洗涤，以去除任何相位分子，每种溶剂各处理五分钟。最后用新鲜的重蒸水处理五分钟。随后将样品在新鲜的重蒸水中清洗四次，并在氮气流下干燥样品表面。

将包被的盖玻片浸入70%乙醇中5分钟以进行灭菌。随后用无菌的双蒸水冲洗样品两次。接着，将样品放入35毫米培养皿中，并加入2毫升PC 12生长培养基。

在37摄氏度、CO2缓冲培养箱中孵育样品至少三小时，期间培养基中的血清白蛋白会吸附到盖玻片表面。等待过程中，设置倒置荧光显微镜：首先打开弧光灯，然后插入紫外滤光立方体，并将物镜旋转至20倍放大倍数。

使用紫外强度计测量光强度，并计算达到200焦耳/平方厘米剂量所需的照射时间。接着，使用镜台测微尺，通过调节视场光阑将待照射区域的直径设定为200微米。在3小时孵育后，向覆盖盖玻片的培养基中补充200微升浓度为3.0毫克/毫升的IV型胶原蛋白。

然后将35毫米培养皿转移至显微镜载物台上，利用划痕标记将显微镜聚焦到样品表面。用200焦耳/平方厘米的剂量对盖玻片区域进行紫外光照射。随后更换培养基，加入2毫升含神经生长因子（NGF）但不含IV型胶原的新鲜生长培养基，并将样品重新放回培养箱中。

在15毫升锥形管中收集培养的NGF诱导分化的PC 12细胞，于150 × g离心4分钟。随后吸除上清液，加入1毫升生长培养基。使用血细胞计数板，通过轻柔吹打将细胞重悬。

计数细胞密度，并将 3.0 × 10⁵ 个细胞加入含有经修饰盖玻片的 35 毫米培养皿中。在 XC 两种修饰表面培养一至两天后，将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中继续孵育一至两天。使用显微镜确认细胞仅在盖玻片的紫外光照射区域贴壁并生长。

然后向培养细胞的培养皿中加入67 µL的IV型胶原蛋白，使胶原蛋白的终浓度为100 µg/mL，并设置显微镜用于表面图案化。将培养皿置于显微镜载物台上，将照射区域定位在当前细胞位置附近。以200 J/cm²的剂量用紫外光照射盖玻片。

照射后，更换为不含胶原的培养基，并将样品放回培养箱中，尽量在30分钟内完成单个样品的处理。这是一张溅射沉积二氧化钛薄膜的横截面扫描电子显微镜图像。根据观察，该薄膜的厚度估计约为150纳米。

此处还可观察到所沉积的二氧化钛薄膜具有良好的平整性。通过原子力显微镜进一步分析表明，表面的均方根粗糙度仅为 0.2 纳米。IV 型胶原蛋白溶液会优先吸附至经紫外光照射的区域，在该区域，白蛋白已被激光移除。

为了展示该方法的多功能性，其他蛋白质（如纤维蛋白）也已采用相同技术实现了图案化。此处细胞生长在盖玻片上经 XC 二重图案化处理的区域，紧邻虚线所界定的区域。该盖玻片最近在原位接受了两次紫外照射，并包被了 IV 型胶原蛋白。

在接下来的五天内，细胞增殖并迁移以覆盖新编码的区域。本文介绍的方法可用于在培养条件下任意操控细胞，并有望用于排列多种类型的细胞，构建复杂的共培养系统。