Name: 制备及个体表征和多载药物理截留聚合物胶束 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习使用溶剂浇铸法制备和表征载药聚合物胶束，评估其载药稳定性、粒径分布及体外释放特性。该方法可快速生成稳定的胶束系统，为难溶性药物递送提供可靠平台。

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本研究得到了美国药学教育协会新任药学教师研究奖计划（AACP New Pharmacy Faculty Research Award Program）、俄勒冈州医学研究基金会新研究者资助（Medical Research Foundation of Oregon New Investigator Grant）、俄勒冈州立大学启动基金、以及太平洋大学药学院启动基金的资助。

1. 通过溶剂浇铸法制备单药及多药负载胶束
<ol>
	<li>称取1 mg多西他赛（DTX）或1 mg依维莫司（EVR），或为制备双药微胶束（DDM）同时称取每种药物各1 mg。</li>
	<li>称取15 mg PEG2000-b-PLA1800 或 PEG4000-b-PLA2200，用于单药或双药微胶束的制备。</li>
	<li>将药物（单药或双药）与聚合物溶于0.5 ml乙腈中，并转移至5 ml圆底烧瓶中。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪在减压条件下蒸发药物-聚合物的乙腈溶液，形成均匀分布药物的聚合物薄膜。设定旋转蒸发仪转速为100 rpm，水浴温度为40 oC，先在260 mbar真空度下蒸发5分钟，随后将真空度降至100 mbar继续蒸发3分钟。</li>
	<li>用0.5 ml去离子水在50 oC下重新水化药物-聚合物薄膜，并轻轻振荡烧瓶以形成微胶束。</li>
	<li>将所得的微胶束溶液经0.2 µm尼龙滤膜过滤，除去未溶解的药物或杂质，收集滤液至1.5 ml离心管中。</li>
</ol>
2. 使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）评估胶束中的药物载量和稳定性
<ol>
	<li>采用C8色谱柱进行RP-HPLC分析，柱温保持在40 °C，流动相为含0.1%磷酸和1%甲醇的乙腈/水（62/38），等度洗脱模式，流速为1 ml/min，进样体积为10 µl。</li>
	<li>将新制备的胶束（第1节）用流动相稀释100倍后进行RP-HPLC分析，以测定初始载药量。将未稀释的单个胶束和DDM在室温（25 oC）下保存48小时，再用流动相新鲜配制1:100稀释样品，重新进行RP-HPLC分析，以评估24小时内胶束中药物的稳定性。</li>
	<li>分别在227 nm和279 nm处监测DTX和EVR的色谱峰，其保留时间分别为1.7分钟和5.7分钟。所有测量均重复三次。数据以平均值±标准差的载药量形式表示。</li>
</ol>
3. 通过动态光散射（DLS）评估胶束粒径
<ol>
	<li>将新制备的胶束（如第1节所述）按1:20的比例用去离子水稀释，得到终浓度为1.5 mg/ml的聚合物溶液。</li>
	<li>在25 °C条件下，使用He-Ne激光器（633 nm）以173°角测量散射光强度。所有测量前需预平衡2分钟。</li>
	<li>所有测量重复三次。数据以Z均粒径平均值±标准差（SD）表示，并提供粒径分布的多分散指数（PDI）。</li>
</ol>
4. 评估 体外 单个胶束和DDM的药物释放
<ol>
	<li>按照第1节所述制备单独的胶束和DDM。将2.5 ml胶束溶液加入分子量截留值（MWCO）为7,000 g/mol的3 ml透析盒中。 
	注意：选择此MWCO是为了使游离药物及未结合的聚合物分子能够自由扩散出透析盒，从而确保达到漏槽条件。</li>
	<li>将透析盒置于2.5 L的10 mM pH 7.4磷酸盐缓冲液中（通过稀释200 mM储备液配制），每3小时更换一次缓冲液以维持漏槽条件。整个实验过程中保持缓冲液温度为37 oC。</li>
	<li>在0、0.5、1、2、3、6、9、12、24和48小时时，从透析盒中取出150 µl溶液，并补充150 µl新鲜缓冲液。</li>
	<li>按照第2节建立的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析样品，测定药物浓度。使用统计软件，基于单相指数关联的简单扩散模型对药物释放数据进行曲线拟合。</li>
	<li>根据曲线拟合结果，计算每种药物在单独胶束或DDM中达到50%释放所需的时间（t1/2）。所有测量均需进行四次重复。</li>
</ol>

<ol><li>Yokoyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+as+a+new+drug+carrier+system+and+their+required+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-drug+loaded+polymeric+micelles+for+simultaneous+delivery+of+poorly+soluble+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs.</a> J Control Release. 140, 294-300 (2009).</li>
<li>Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+block+copolymers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic block copolymers for drug delivery.</a> J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).</li>
<li>Oerlemans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+in+anticancer+therapy%3A+targeting%2C+imaging+and+triggered+release%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release.</a> Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-in-1+polymeric+micelle+nanocontainer+for+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs.</a> Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).</li>
<li>Hasenstein, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+Triolimus%3A+a+novel+multidrug-loaded+micelle+containing+Paclitaxel+Rapamycin%2C+and+17-AAG%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG.</a> Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).</li>
<li>Mazzaferro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalent+sequential+binding+of+docetaxel+to+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin.</a> Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).</li>
<li>Iwase, Y., Maitani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+in+vivo+evaluation+of+liposomal+everolimus+for+lung+carcinoma+and+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma.</a> Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).</li>
<li>Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+effect+of+docetaxel+and+everolimus+as+individual+and+dual-drug-loaded+micellar+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers.</a> Pharm Res. 31, 660-669 (2014).</li>
<li>Xu, W., Ling, P., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles%2C+a+promising+drug+delivery+system+to+enhance+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs.</a> J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).</li>
<li>Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29-block-poly%28L-amino+acid%29+micelles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于聚合物胶束具有多功能性，并能递送多种疾病状态下的疏水性药物，其在药物递送中的应用正不断拓展。因此，在用于细胞培养或动物实验之前，制备和表征这些制剂所需的技术是确定药物与聚合物最佳配对的关键第一步。PEG-b-PLA 是用于药物递送的优良两亲性嵌段共聚物。然而，亲水和疏水嵌段的长度在药物包封和稳定性方面起着重要作用，并且取决于所选择掺入的特定药物。因此，在启动其他研究之前，可能需要使用多种嵌段共聚物进行初步研究，以确定药物与聚合物的最佳配对。
胶束制备的溶剂浇铸法已有充分文献记载，是一种可重复的方法。旋转蒸发仪的实际条件需要通过改变水浴温度、旋转蒸发时间、转速和真空压力，针对混合物进行优化。最终应得到一层透明、连续且无气泡的薄膜，并能在去离子水中迅速溶解。
通过DLS评估时，均匀的胶束溶液应呈现单峰分布，如所提供的数据所示。胶束的尺寸由聚合物的分子量决定，而不受载药量的影响。这一点可通过DLS数据得到证实：分子量较高的PEG4000-b-PLA2200</s...

由亲水和疏水结构域组成的具有重复结构的两亲性嵌段共聚物可自发自组装形成被称为聚合物胶束的三维大分子组装体。这些结构具有被亲水性外壳包围的内部疏水核心。疏水核心能够通过疏水相互作用以物理包埋方式或通过化学偶联至聚合物主链的方式负载疏水性药物。1 使用这类嵌段共聚物形成用于药物递送的胶束具有多种优势，包括可包载难溶性药物、改善所包载药物的药代动力学特性，以及聚合物本身具备的生物相容性和/或生物可降解性，使其成为传统增溶剂的安全替代选择。2 聚合物胶束的另一优势在于其胶体粒子尺寸介于15–150 nm3之间，适合用于注射给药。因此，在过去20年中，聚合物胶束已成为难溶性药物尤其是抗癌药物递送的可行系统。3,4
目前有五种用于癌症治疗的聚合物胶束制剂正处于临床试验阶段。4 临床试验中的四种胶束为基于聚乙二醇（PEG）的二嵌段共聚物，而最后一种则是含有聚环氧乙烷的三嵌段共聚物。这些胶束的尺寸范围为20 nm至85 nm。使用基于PEG的聚合物的优势在于其良好的生物相容性，并且根据第二嵌段的不同，还可能具备生物可降解性。近年来，基于聚乙二醇的新药物递送系统阻断-聚乳酸（PEG-b-PLA）聚合物胶束已用于多种抗癌药物的联合递送。PEG-b-PLA 胶束具有生物相容性和可生物降解性。这些载有多药的胶束在不同癌症模型中表现出协同抑制作用 体外 和 体内2,5,6 并符合当前化疗中联合使用多种药物以防止耐药性产生并降低毒性的主流模式。因此，制备和表征这些胶束药物递送系统在癌症及其他疾病状态中的应用引起了广泛关注。
在下述工作中，我们概述了一种逐步制备此类胶束并在特定疾病状态下对其进行评价前进行表征的方法。本研究选择了两种水溶性差的抗癌药物——多西他赛（DTX）和依维莫司（EVR）作为模型药物。DTX 和 EVR 均为水溶性差的化合物，其固有水溶性分别为 1.9 和 9.6 µg/ml。7,8 本实验方案中采用两种不同分子量的 PEG-b-PLA 嵌段共聚物作为构建载药聚合物胶束的基本单元，分别为 PEG2000-b-PLA1800 （3,800 Da）和 PEG4000-b-PLA2200（6,200 Da）。因此，PEG-b-PLA 胶束可作为 DTX 和 EVR 单独或联合给药时的一种独特纳米载体平台。制备与表征这些胶束所需的试剂/材料及设备列于表1中。

<table><tbody><tr><td>PEG2000-b-PLA1800</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/2000</td><td>订购时可指定PLA的分子量</td></tr><tr><td>PEG4000-b-PLA2200</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/4000</td><td>订购时可指定PLA的分子量</td></tr><tr><td>多西他赛</td><td>LC Laboratories</td><td>D-1000</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>依维莫司</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4040</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-AX0145-1</td><td>HPLC级；4 L</td></tr><tr><td>圆底烧瓶&amp;nbsp;</td><td>Glassco/VWR</td><td>89426-496</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>RV 10 Control旋转蒸发仪</td><td>IKA Works</td><td>8025001</td><td>旋转蒸发仪</td></tr><tr><td>配备DAD检测器的岛津HPLC</td><td>Shimadzhu</td><td></td><td>反相高效液相色谱（RP-HPLC）</td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer透析盒，截留分子量7000</td><td>Thermo Scientific, Inc</td><td>66370</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4，200 mM</td><td>VWR</td><td>100190-870</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Malvern NanoZS</td><td>Malvern Instruments, UK</td><td></td><td>动态光散射（DLS）</td></tr><tr><td>尼龙滤膜</td><td>Acrodisc/VWR</td><td>28143-242</td><td>13 mm；0.2&amp;micro;M</td></tr><tr><td>磷酸，NF级</td><td>Spectrum Chemical/VWR</td><td>700000-626</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com&lt;/a&gt;</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 Rapid Resolution色谱柱&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>866953-906</td><td>4.6 &amp;times;75 mm，3.5 &amp;#956;m</td></tr></tbody></table>

单药与多药负载的物理包埋型聚合物胶束的制备与表征

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

两亲性嵌段共聚物，如聚乙二醇-阻断-聚乳酸（PEG-b-PLA可在其临界胶束浓度以上于水性环境中自组装形成胶束，其结构具有由疏水内核和亲水外壳组成的核壳结构。这些胶束的内核可用于包载如多西他赛（DTX）和依维莫司（EVR）等疏水性、水溶性差的药物。在应用前，对胶束结构及药物负载能力进行系统表征至关重要。 体外 和 体内 可开展相关研究。本方案的目标是提供必要的表征步骤，以获得标准化的胶束产品。DTX 和 EVR 的固有溶解度分别为 1.9 和 9.6 µg/ml。通过溶剂浇铸法可制备上述胶束，使 DTX 和 EVR 的水溶性分别提高至 1.86 和 1.85 mg/ml。在室温下对胶束中药物稳定性进行 48 小时评估，结果显示溶液中仍保留 97% 以上的药物。采用动态光散射法评估胶束粒径，表明其粒径小于 50 nm，且取决于聚合物的分子量。在 pH 7.4、37 ℃ 的沉降条件下，通过透析法评估胶束的药物释放行为。 o在48小时内，曲线拟合结果表明药物释放遵循一级动力学过程，说明其释放机制为扩散驱动。

在 PEG4000-b-PLA2200 或 PEG2000-b-PLA1800 中，成功制备了单独的 DTX 或 EVR 胶束，以及 DTX 和 EVR 共载 DDM 在 PEG-b-PLA 胶束中的制剂（图 1）。
DTX、EVR 和 DDM 在 PEG4000-b-PLA2200 或 PEG2000-b-PLA1800 中 48 小时内的稳定性相似（图 2）。EVR 在 PEG4000-b-PLA2200 和 PEG2000-b-PLA1800 中的初始载药量分别为 1.86 和 1.87 mg/ml。而 DTX 在 PEG<s...

本实验方案的目的是描述由两亲性嵌段共聚物组成的胶束药物递送系统中，对物理包埋的难溶性药物进行制备和表征的方法。

两亲性嵌段共聚物（如聚乙二醇-嵌段-聚乳酸，PEG-b-PLA）可在其临界胶束浓度以上自组装形成胶束。

以下实验的总体目标是概述在疾病状态下评估载药微球之前，制备和表征载药微球的逐步操作流程。首先采用溶剂浇铸法制备微球，以获得可重复的微球用于研究。第二步是评估微球的载药稳定性及粒径，以确定微球负载并维持临床相关浓度的能力。接下来，测定药物从My细胞中的释放速率，以确保在评估体内稳定性之前，My细胞具有适当的体外释放特性。结果表明，通过本文所述的评估技术，可重复地制备出稳定的My细胞，从而为针对多种疾病状态的药物递送提供一个平台。与平衡载药或透析等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够更快地制备肌球蛋白，并实现可重复的药物载量和粒径控制。该技术的应用前景涉及多种疾病的治疗或诊断，因为纳米药物提供了超越传统剂型的可能性。通常，初学者尽管面对的是较为简单的方法，仍可能在操作中遇到困难，原因在于仍需进行释放度研究，而无法准确评估突释效应。本次实验操作将由我的研究生Shaman Duke以及合作者Deepa共同示范。首先，精确称取1毫克DTX、1毫克EVR以及15毫克Peg 4,000-b-PLA 2200，用于制备双药载药微球（DDM）。称量完成后，将药物与聚合物溶于0.5毫升乙腈中，随后将溶液转移至5毫升圆底烧瓶中，通过旋转蒸发仪在减压条件下蒸发乙腈-药物-聚合物溶液，形成一层均匀的药物分散聚合物薄膜。随后，用预热至 50 °C 的 0.5 毫升去离子水重新水化药物聚合物薄膜，并将烧瓶置于 50 °C 水浴中轻轻振荡，以形成胶束。将所得溶液转移至离心管中，在 7,200 × g 条件下离心 3 分钟。用注射器吸取溶液，并通过 0.2 微米尼龙滤膜将所得胶束溶液过滤至新的 1.5 毫升离心管中，以去除未溶解的药物或杂质。此时，采用 C18 色谱柱，在 40 °C 条件下以乙腈-水为流动相进行等度洗脱的反相高效液相色谱（HPLC）分析。在进行反相 HPLC 分析前，将新制备的胶束溶液按 1:100 的比例用乙腈稀释，以测定初始载药量。将未稀释的细胞在室温下保存 48 小时后，制备新鲜的稀释样品，通过反相高效液相色谱法重新评估，并确定药物在细胞中 48 小时内的稳定性。在 227 和 279 纳米波长下分别监测 DTX 和 DVR 的色谱峰，其保留时间分别为 1.7 和 5.7 分钟。以载药量的平均值 ± 标准差形式呈现数据。接下来，将新制备的细胞与去离子水按1:20的比例稀释，使最终聚合物浓度为1.5毫克/毫升。将溶液转移至比浊杯中，进行动态光散射测量。在173度方向测量氦氖激光的散射强度，以确定散射情况。以平均 Z 平均粒径 ± 标准差表示数据，并同时提供粒径分布的多分散指数（PDI）。按照前述方法制备 DDM 后，将 2.5 毫升的菌液加入截留分子量为 7,000 克/摩尔的 3 毫升透析盒中。将透析盒置于 2.5 升 10 毫摩尔、pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，按以下时间间隔进行操作。吸取 150 微升溶液，并加入 150 微升新鲜缓冲液进行替换。每 3 小时更换一次缓冲液，以确保同步条件。采用反相高效液相色谱法分析样品，以确定药物浓度曲线。使用统计软件 D-T-X-E-V-R，基于单相指数关联的简单扩散模型拟合药物释放数据，DDM 在 PEG 2000-PLA 1800 或 PEG 2000-PLA 2200 中 48 小时内的稳定性相似。所有我的细胞在室温下 48 小时后仍保留了初始载药量的 97% 或以上。根据动态光散射结果，所有我的细胞均呈现单峰分布，PDI 值均小于 0.2。根据数据，DTX从单个髓细胞和DDM中释放48小时后约为60%。EVR从单个髓细胞和DDM中的释放率分别为60%和50%。此处展示了药物从单个髓细胞和DDM中释放50%所需的时间以及拟合优度数据。除EVR单个细胞外，我所有细胞的曲线拟合优度均高于0.950，这表明一级释放假设可较好地近似解释药物从单个我细胞及DDM中的释放行为。一旦掌握，这些技术可常规应用于大量药物与聚合物库中我细胞的研究，耗时仅数小时至数周。在执行该操作时，重要的是务必在接触细胞培养或动物模型之前，对我细胞进行充分表征。此外，也可对其他递送系统（如脂质体递送系统）进行评估或表征，以探讨药物递送系统在治疗疗效中所起作用的相关问题。观看本视频后，您应能充分了解在评估疾病状态下相关细胞的药物负载能力之前，如何制备和表征载药细胞。

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