Name: 研究蛋白质功能和改变的蛋白的表达由源抗体干扰和三维重建中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习利用Chariot肽介导的抗体干扰技术调控哺乳动物细胞蛋白质表达的方法。该技术通过三维重建分析海马神经元结构，为神经科学研究提供即时可控的蛋白功能研究新途径。

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本研究工作部分得到了加拿大卫生研究院/加拿大脆性X综合征研究基金会合作项目对RD的资助、杰罗姆·勒琼基金会对RD的资助、德国埃尔朗根-纽伦堡大学临床研究跨学科中心对RD的资助，以及德国研究基金会对RD和RE的资助。作者谨此感谢Ingrid Zenger在细胞培养维护方面的技术支持，同时感谢M. Wegner教授提供pCMV5-FLAG载体。作者还特别感谢Nadja Schroeder在视频拍摄过程中给予的有益协助。

1. 储备溶液
<ol>
	<li>将冻干的活性基序粉末重悬于无菌 H2O至终浓度为2 µg/µl。轻轻振荡混匀。</li>
	<li>制备小份 aliquot（例如， 每份12 µl，每个反应需要2 µl，于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 细胞的制备
<ol>
	<li>在24孔板中接种哺乳动物细胞（如HEK293细胞或原代神经元），每孔加入500 µl含抗生素的生长培养基。 
	注意：使用神经元时，应以低密度接种细胞，并仅使用24孔板中的中间两行。每个孔均需保留一个对应的空孔，用于孵育期间盛放培养基（步骤4.2）。操作神经元时，务必确保细胞在体外环境（非培养箱内）停留时间不超过几分钟。</li>
	<li>在适当条件下培养细胞（湿润环境，5% CO₂）2 并在 37 °C 条件下培养至细胞汇合度约为 50%。 
	注意：使用神经元时， 将细胞培养至所需发育阶段，每周两次更换约25–50%的培养基。培养基：Neurobasal培养基（含1× B27、5 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素；参见参考文献16）。</li>
</ol>
3. Chariot 复合物的形成
<ol>
	<li>每个反应中，将0.1–2 µg的目的蛋白（POI）或相应抗体，以及对照蛋白或对照抗体，分别用50 µl PBS稀释。 
	注意：该技术也可用于由预先结合的一抗和二抗组成的复合物（参见“代表性结果”部分的图1）。混匀后离心。</li>
	<li>每个样品中，用单独的离心管将2 µl Chariot储存液加入50 µl PBS中稀释，以避免Chariot发生自聚集。混匀后离心。</li>
	<li>通过移液将稀释后的目的蛋白或抗体（步骤3.1）转移至Chariot稀释液中。混匀后离心。</li>
	<li>室温孵育30分钟（形成Chariot-POI复合物）。</li>
</ol>
4. 细胞转染
<ol>
	<li>稀释&#160;将Chariot复合物（步骤3.4）加入100 µl预热的生长培养基（37 °C，无添加物）中。移除培养基，用预热的1×PBS洗涤细胞一次。 
	注意：使用神经元时，不要丢弃培养基，需重复利用。将培养基置于37 °C保存。洗涤时使用含有0.5 mM MgCl₂的PBS2 和 CaCl2. 
	建议：在孵育培养板时（步骤 4.5），在空孔中保留培养基。</li>
	<li>将Chariot复合物溶液（步骤4.1）加入细胞中，轻轻摇动细胞以确保溶液均匀分布。在标准条件下（步骤2.2）培养细胞1小时。加入血清至终浓度为10%。当使用神经元时， 加入步骤4.1的培养基，继续培养细胞1至2小时。 
	注意：最佳孵育时间取决于货物分子的大小和特性，可能需要根据经验进行调整。以下建议可作为参考指南：对于肽类，通常1小时已足够；对于蛋白质，建议1-2小时；对于抗体，建议2小时；而对于神经元的抗体转染，则建议4小时。</li>
	<li>按常规方法处理细胞以进行分析。请注意：该技术适用于采用固定化处理方案的实验，也适用于活细胞成像实验。</li>
</ol>
5. 成像
<ol>
	<li>使用激光扫描显微镜，以大约 0.25–0.5 µm 的间距对目标细胞和/或细胞区室进行 z 轴层扫成像。具体的层间距离取决于待重建结构的大小，需根据实际情况单独确定。</li>
</ol>
6. 重建
<ol>
	<li>在以下步骤中，使用 Esc 键在“选择”和“导航”模式之间切换，按住 Cntr&#160;键并单击以选择多个对象，按住 shift&#160;键以剪切对象（参见步骤 6.10）。</li>
	<li>在 Imaris 中打开 lsm 文件。</li>
	<li>对每个通道使用“显示调整”功能，调整图像对比度，直至最亮的结构达到饱和。请注意，此调整不会影响表面重建，仅用于辅助实验人员进行图像阈值设定。</li>
	<li>点击“添加新表面”图标，将弹出一个向导窗口。</li>
	<li>选择：仅分割感兴趣区域。然后进入下一步。</li>
	<li>调整选框的边界以匹配您感兴趣的对象。请注意，图像具有三维结构，因此还需在 z 轴平面上进行调整。如果选框的矩形形状未能准确贴合目标对象，可旋转对象和/或扩大选框，确保所有需要的结构均被包含在内。不需要的对象可在后续步骤中移除（参见步骤 6.10）。完成后继续。</li>
	<li>选择合适的通道。表面区域细节级别或球体直径应根据待重建结构的大小进行设置。&#160; 根据信号特征，可选择“绝对强度”或“局部对比度”方法。&#160; 通常情况下，对于弥散性信号，“局部对比度”效果更佳。无论采用何种方法，均需针对每种信号或感兴趣结构分别调整参数。</li>
	<li>使用“阈值设定”工具重建感兴趣结构。</li>
	<li>点击绿色箭头按钮完成重建。</li>
	<li>使用铅笔工具进一步调整对象，按需剪切并删除表面。剪切操作仅能在南北方向进行，因此需倾斜图像以实现对目标对象的准确剪切。</li>
	<li>通过选择“统计”、“详细统计”和“平均值”，获取每个表面的体积、面积和强度测量数据。</li>
	<li>（可选步骤）如需观察颜色编码的统计结果（参见图 2E 和F），请选择相应表面的颜色选项卡，并将显示模式由“基础”更改为“统计编码”，系统将显示多个可选参数。</li>
</ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantoro%2C+MR+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22">Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease</a>. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).</li>
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<li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种研究蛋白质表达水平在剂量依赖性方式下调控细胞功能重要性的实验方案。该方案可在多种哺乳动物细胞类型（包括海马神经元）中实现对蛋白质表达的精细调控，从而促进在细胞水平上对蛋白质功能进行深入研究。
尽管RNA干扰是一种众所周知的下调目的基因（POIs）的策略，但它也存在一些缺点（参见14）。不仅高效且高特异性序列的筛选可能耗时且成本高昂，而且细胞内转录本的生成过程也可能导致不可预知的结果，因为有毒RNA构建物的积累、核输出机制的超负荷以及内源性RNA干扰加工系统的饱和，均可能引发脱靶效应或导致干扰效率低下。此外，大量外源性RNA干扰载体也可能诱发非特异性效应，并干扰细胞稳态。
另一方面，抗体一旦进入细胞，无需细胞内源性机制进一步加工，可立即发挥效应，因此不仅支持节省时间的实验设计，还可用于研究即时的细胞过程。尽管抗体也可能存在非特异性的脱靶效应，但随着越来越多经过充分表征且高度特异性的抗体问世，这一替代方案值得考虑。由于将大分子复合物递送入细胞仍是一个主要障碍，近年来已发展出多种转染技术，包括R8...

对蛋白质表达的严格调控对于每个生物体控制自身发育以及响应环境信号至关重要。因此，在进化过程中产生了多种机制，以精确调控真核细胞在其生命过程中任意时刻所含约20,000个基因编码的每种蛋白质的表达水平。这些调控机制发生在蛋白质合成的不同阶段，范围从染色质结构、转录和RNA加工的调控，到翻译后蛋白质修饰、转运和降解的调控。
因此，基础分子机制的功能障碍以及蛋白质表达水平的改变与多种疾病（如癌症或智力障碍）相关，这并不令人意外。事实上，考虑到神经元发育和哺乳动物大脑功能所具有的显著复杂性，这些精密系统对蛋白质表达变化的敏感性在多种已知的智力缺陷疾病中得以体现，包括阿尔茨海默病和帕金森病（AD 和 PD），以及自闭症谱系障碍（ASD），例如脆性 X 染色体综合征（FXS）。后者疾病的特征是多种蛋白质的广泛异常表达，其原因是丢失了一种单一的翻译调控蛋白——FMRP（脆性 X 智力低下蛋白）1-4。此外，最近研究发现，影响 Variable charge x linked protein A（VCXA）的染色体重排与智力障碍相关；VCXA 是一种通过修饰 mRNA 加帽来调控 mRNA 稳定性和翻译的蛋白质5，而截至目前，在认知障碍患者中尚未发现点突变6,7，这表明所观察到的精神功能损害源于 VCXA 表达水平的改变及其靶蛋白表达的失调。与这些发现一致，一项研究探讨了基因的de novo拷贝数变异是否与 ASD 相关，结果证实新发的基因重复和缺失是 ASD 的重要风险因素8，从而支持了蛋白质表达水平升高或降低可能导致智力障碍的观点。
值得注意的是，最近的研究进一步提供了证据，表明特定蛋白质的表达水平被精确调控，以防止因蛋白质含量过高而导致其发生聚集，且几乎没有安全余量9。因此有研究提出，即使蛋白质表达量轻微增加，也足以诱发阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等疾病9。尽管参与蛋白质表达调控的分子机制多种多样，提示在这些发现背景下可能存在复杂的调控机制，但一项针对超过5,000个哺乳动物基因表达水平的研究10表明，自然界更倾向于一种更为简约的调控策略：细胞中蛋白质的丰度主要在翻译水平上进行调控10，这说明RNA可用性的调控主要作用在于对蛋白质表达进行精细调节。
因此，研究目的蛋白（POIs）的剂量不仅对于理解蛋白的内源性功能至关重要，而且对于多种疾病的研究以及治疗策略的开发也具有重要意义。为此，过去几十年已发展出多种利用RNA干扰来调控POI剂量的策略。尽管RNA干扰被广泛用于研究蛋白功能，并且已应用于癌症、眼部疾病以及抗病毒治疗的临床试验中11-13，但该策略在实施过程中可能遇到一些困难，甚至导致其无法实现。例如，介导基因沉默的“种子序列”因依赖同源性而相对较短，容易引发脱靶效应。由于高效序列较为稀少，且需从成千上万种候选序列中筛选（综述见14），寻找合适序列的过程可能耗时且昂贵，但结果仍可能不尽如人意。
另一种策略是利用抗体直接靶向目标蛋白（POI）。在此，我们展示了使用蛋白载体Chariot&#160;（由Active Motif公司生产）以降低细胞内蛋白的可用性，并结合三维重建技术研究蛋白在敲低后的功能。
Chariot 的活性基序本身是一种 2.8 kDa 的多肽，可用于将多肽、蛋白质和抗体穿过哺乳动物细胞的膜进行转运15。该多肽通过疏水相互作用与目的蛋白（POIs）形成非共价结合的大分子复合物，随后 Chariot-POI 复合物以非依赖内体的方式被细胞内化。重要的是，研究表明 Chariot 既不会影响被转运蛋白在细胞内的定位，也不会产生细胞毒性作用或影响其运载物的生物学活性15。

<table><tbody><tr><td>Chariot</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life technologies</td><td>21103-049</td><td>使用前预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life technologies</td><td>17504044</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life technologies</td><td>25030-149</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td>n.a.</td><td>价格昂贵，但无可匹敌</td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

通过抗体干扰和三维重建研究蛋白质功能及异常蛋白质表达的作用

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

严格调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。因此，近年来的研究开发了多种工具，用于靶向哺乳动物细胞系甚至动物模型中的蛋白质表达，包括RNA干扰和抗体干扰技术。尽管过去二十年中，前一种策略受到了广泛关注，但介导抗体货物穿过细胞膜进入细胞的肽段&#160;却受到较少关注。在本论文中，我们提供了一种详细的实验方案，介绍如何在人胚胎肾细胞以及原代海马神经元中利用一种名为Chariot的肽载体进行抗体干扰实验，并进一步展示了三维重建技术在分析蛋白质功能中的应用。我们的研究结果表明，Chariot可能因其含有核定位信号，特别适用于靶向定位于胞体和细胞核内的蛋白质。值得注意的是，在应用于原代海马神经元培养时，该试剂被分离的神经元出乎意料地良好耐受。

以下段落展示了使用Chariot转染试剂和抗体干扰技术对目的蛋白（POI，即Simiate；更多细节请参见16,17）实现功能性敲低的典型实验结果。研究结果表明，Simiate表达水平降低会损害转录活性，并以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡；当使用较高剂量的抗体（> 1 µg 抗体）时，最终导致超过99%的细胞死亡率（该发现此前已发表于16）。本文中，我们将详细展示所采用的技术与实验方案，并进一步说明如何利用Chariot试剂对原代培养的离体海马神经元进行转染。
为了研究Chariot肽是否能够有效介导抗体的递送，特别是这些抗体在操作过程中是否仍保持功能活性，我们在HEK293细胞中表达FLAG-Simiate 24小时，随后利用与Chariot偶联的rbαSimiate-gtαrbAlexa568大分子转染细胞（图1）。HEK293细胞对FLAG-Simiate表达良好，该蛋白定位于细胞胞体及细胞核内（图1A）。在此条件下，FLAG...

调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，而且也是在细胞模型中研究蛋白质功能的重要策略。本文介绍的方案展示了抗体干扰技术在哺乳动物细胞（包括原代海马神经元）中的应用，并演示了如何利用三维重建技术研究蛋白质功能。

严格调控蛋白质表达不仅对所有现存生物至关重要，也是研究蛋白质功能的重要策略……

以下实验的总体目标是以高效且严格控制的方式研究蛋白质功能以及蛋白质表达改变所起的作用。该目标通过应用抗体来减少细胞中可利用的功能性蛋白质数量来实现。为达到这一目的，将抗体与一种名为Chariot的肽偶联，该肽可介导物质穿过细胞膜。接下来，对目标细胞结构进行成像并重建三维结构，以评估处理的效果。结果表明，Chariot 肽类特别适用于通过抗体干扰来靶向核内蛋白。与 RNA 干扰等现有方法相比，该技术的主要优势在于：导入细胞内的抗体可立即发挥作用，且研究者可通过调整抗体剂量严格控制干扰程度。尽管该方法可用于研究多种细胞类型中蛋白质的功能，但其在原代神经元培养物中靶向蛋白质的应用尤为引人关注，因为原代神经元对处理非常敏感，却能很好地耐受Chariot转染试剂。准备时，将冻干的Chariot肽粉用无菌水重悬，浓度为每微升2微克。轻轻敲击管壁，使粉末充分溶解混匀。然后制备小量的工作液分装，每次反应仅需两微升，并将分装样品储存在20摄氏度。接下来，通过将细胞接种至含有抗生素的半毫升培养基的24孔板中，为转染准备哺乳动物细胞。当使用神经元时，仅将细胞接种在中央两行，且接种密度要低。空的孔板后续有用。动作要快，培养的神经元离开培养箱的时间不应超过几分钟。在神经元达到所需的发育阶段之前，每周更换两次培养基，每次更换约四分之一到一半。非神经元培养物应在细胞达到 50% 汇合度时使用。以下步骤以六个测试样本和六个对照样本为例进行说明。针对每种货物，将0.1至2微克的样品用50微升1×PBS稀释。预先结合的一抗和二抗大分子复合物也可作为货物使用。将溶液轻轻涡旋混匀，随后进行短暂离心。然后，每个反应中将两微升 Chariot 储存液加入 50 微升 PBS 中进行稀释。为防止 Chariot 自行聚集，每个样品需使用独立的离心管。现在，将已准备好的蛋白质加入 Chariot 稀释液中混合。混合并离心合并的蛋白质。室温孵育样品30分钟，以形成Chariot载体复合物。最佳蛋白肽用量取决于所用的载体和细胞类型。因此，该用量应通过实验确定。提前将不含添加剂的培养基以及含有0.5毫摩尔氯化镁和氯化钙的1×PBS预热至37摄氏度。现在，开始将制备好的Chariot复合物用100微升培养基稀释。移除培养板中细胞的培养基，并转移至空孔中以备重复使用。随后用 500 微升预热的 1× PBS（含钙、氯化镁）溶液轻柔洗涤细胞。将含有 Chariot 复合物的培养基加入细胞中，轻轻摇动培养板，以确保溶液均匀分布。迅速将细胞放回培养箱，并等待一小时后再进行后续操作。对于神经元，孵育一小时后，将保存的培养基转移至孔中。对于所有其他细胞，加入血清至终浓度为10%。培养的神经元非常敏感，例如对培养基温度和pH的变化敏感。因此，应使用预热的溶液轻柔地洗涤和转染这些细胞，并尽快放回培养箱中。根据转染的载体和细胞类型，继续孵育所需的时间。孵育结束后，按照常规方法对细胞进行后续分析处理。固定方案以及活体成像均适用于该技术。使用配备63倍物镜的激光扫描显微镜时，应以约0.25至0.5微米的间距采集图像，以便获得足够细节的Z轴层叠图像，同时避免光漂白。精确的层间距离取决于待重建结构的大小，需根据具体情况单独确定。进行图像重建时，在 Imaris 中打开 LSM 文件。使用该软件时，按 Escape 键可在“选择”和“导航”模式之间切换。此外，按住 Control 键可同时选择多个对象。使用显示调整功能，进入每个通道并调节对比度，直至最亮的结构达到饱和。此调整不会影响表面重建，但有助于图像的阈值分割。如果需要重建的对象分布在不同的文件中，请使用“编辑”和“添加切片”功能将相应文件合并。接下来，单击“添加新表面”图标，然后选择“仅分割感兴趣区域”。现在，调整选择框的边距以贴合目标对象。调节矩形的形状和倾斜角度，直到所有需要的结构均位于框内。需要在Z平面的每幅图像中调整选区。不需要的物体可随后去除。接下来，选择一个合适的通道。接下来，使用阈值工具重建目标结构。表面区域细节级别（即球体直径）应根据待重建的结构进行设置。根据信号特征，可选择使用绝对强度或局部对比度。通常，局部对比度对弥散性信号的处理效果更佳。由于该信号的特性，采用局部对比度来重建细胞核内的蛋白质结构。无论何种情况，都需要针对每种感兴趣的信号或结构单独调整参数设置。单击屏幕底部的绿色箭头完成重建。然后使用铅笔工具进一步调整对象。仔细将重建结果与原始信号进行比较，根据需要倾斜图像以切割并去除表面，确保切割工具能够准确发挥其作用。现在，通过选择“统计”、“详细统计”和“平均值”来测量每个表面的体积、面积和强度。如果需要，可通过选择相应表面的“颜色”选项卡，并将选定选项从“基础”更改为“统计编码”，从而生成颜色编码的统计结果。使用“拍摄快照”工具，可获取用于发表的图片。若需重建同一区域内的多个物体，可使用“存储参数”功能保存相关信息。通过Chariot肽将Simiate抗体导入HEK293细胞后，可特异性检测到Simiate的表达。施用后，Simiate抗体复合物进入细胞体及细胞核，并与黄色箭头所示的FLAG-Simiate特异性共定位。Simiate 抗体以剂量依赖性方式在 HEK293 细胞中诱导了大量细胞凋亡，而对照抗体则无此效应。鉴于神经元细胞对毒性作用极为敏感，该技术被应用于原代海马神经元培养物，结果显示，与模拟处理（mock）或未处理细胞相比，Chariot 处理的细胞中神经元存活率未受影响。按照相同的处理方案，约 83% 的细胞中可见山羊抗豚鼠 Alexa568 抗体复合物，这些复合物在细胞胞体和细胞核中均有分布，程度各异。这些观察结果通过三维分析得到了进一步支持，且与HEK293细胞的实验结果一致。因此，Chariot技术可成功用于转染分离的原代海马神经元。一旦掌握，若操作得当，该技术可在3至6小时内完成。Chariot 与目的蛋白形成复合物约需 40 分钟。使用这些复合物转染细胞需要 70 分钟，另需 1 至 4 小时，具体时间取决于货物分子的大小和特性。完成该步骤后，可进一步采用其他方法更详细地分析蛋白质功能，例如活细胞成像、运动性分析、检测分析和电生理记录。

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