研究蛋白质功能和改变的蛋白的表达由源抗体干扰和三维重建中的作用

以下实验的总体目标是以有效和严格控制的方式研究蛋白质功能和改变的蛋白质表达的作用。这是通过应用抗体来减少细胞可用的功能性蛋白的数量来实现的。为了实现这一目标，抗体与一种名为 Chariot 的肽偶联，该肽介导穿过细胞膜的通道。

接下来，对感兴趣的细胞结构进行成像和 3D 重建，以评估治疗效果。结果表明，Chariot 肽特别适合通过抗体干扰靶向核蛋白。与 RNA 干扰等现有方法相比，该技术的主要优点是穿梭到细胞中的抗体立即生效，并且研究人员可以通过调整抗体剂量来严格控制干扰的程度。

虽然这种方法可以深入了解许多细胞类型中的蛋白质功能，但它对于靶向原代神经元培养物中的蛋白质特别有趣，这些细胞对治疗非常敏感，但对 Chariot 的耐受性非常好。在制备过程中，将冻干的 Chariot 肽粉以 2 μg/μL 的浓度重悬于无菌水中。小心敲击试管，将粉末混合成溶液。

然后准备小的工作等分试样，每个反应只需要 2 微升，并将等分试样储存在 20 摄氏度。接下来，将哺乳动物细胞接种到装有半毫升含抗生素培养基的 24 孔板中，以制备用于转染的哺乳动物细胞。使用神经元时，仅在两个中心行中以低密度接种细胞。

空井在以后很有用。要快。培养的神经元离开培养箱的时间不应超过几分钟。

在神经元处于所需的发育阶段之前，每周两次交换大约四分之一到一半的培养基。当细胞汇合度为 50% 时，应使用非神经元培养物。以下过程显示了 6 个检验和 6 个对照样本。

对于每批货物，每个样品制备 0.1 至 2 μg 稀释液，溶于 50 μL 1X PBS 中。预结合的一抗和二抗的大分子复合物也可用作货物。将溶液与温和的涡旋混合，然后进行短暂的离心。

然后为每个反应在 50 微升 PBS 中稀释 2 微升 Chariot 储备溶液。每个样品使用单独的试管，以防止 Chariot 的自结合。现在，将制备好的蛋白质混合在 Chariot 稀释液中。

混合并旋转组合的蛋白质。将样品在室温下孵育 30 分钟，以形成 Chariot 货物复合物。最佳蛋白肽量取决于所使用的货物和细胞类型。

因此，这个量应该根据经验来确定。提前将一些不含添加剂的生长培养基以及含有 0.5 毫摩尔氯化镁和氯化钙的 1X PBS 预热至 37 摄氏度。现在，首先，用 100 微升培养基稀释准备好的 Chariot 复合物。

从铺板的细胞中取出培养基，并转移到空孔中重复使用。然后用 500 μL 预热的 1X PBS、钙、氯化镁溶液轻轻洗涤细胞。将携带 Chariot 复合物的培养基涂在细胞上，轻轻摇动板以确保溶液均匀分布。

快速将细胞放回培养箱中，等待一小时后再进行。对于神经元，孵育一小时后，将保存的培养基转移到孔中。对于所有其他细胞，添加血清至终浓度为 10%培养的神经元非常敏感，例如对培养基温度和 pH 值的变化。

因此，应用预热的溶液轻轻洗涤和转染这些细胞，并尽快放回培养箱中。根据需要继续孵育，具体取决于转染的货物和细胞类型。孵育后，像往常一样处理细胞以进行后续分析。

固定方案以及实时成像都与该技术兼容。使用带有 63 倍镜头的激光扫描显微镜，在大约 0.25 至 0.5 微米的距离内拍摄图像，以获得足够细节的 Z 轴堆栈，同时避免漂白。精确的层距取决于要重建的结构的大小，需要单独确定。

对于映像重建，请在 Imaris 中打开 LSM 文件。使用此软件，Escape 按钮用于在"选择"和"导航"之间切换。此外，还可以通过按住 Ctrl 键来选择多个对象。

使用 Display Adjustment（显示调整），进入每个通道并调整对比度，直到最亮的结构达到饱和。此调整不会影响表面构造，但有助于对图像进行阈值设置。如果要重建的对象包含在不同的文件中，请使用 Edit and Add Slices 功能来合并相应的文件。

接下来，单击 Add New Surfaces 图标，然后选择 Segment only a Region of Interest。现在，调整选择框的边距以适合感兴趣的对象。调整矩形的形状和倾斜度，直到所有需要的结构都在盒子内。

需要在整个 Z 平面上调整每张图像中的选区。以后可能会删除不需要的对象。接下来，选择合适的渠道。

要继续，请使用阈值工具重建感兴趣的结构。应设置表面积细节级别或球体直径，以匹配正在重建的结构。根据信号特性，可以使用绝对强度或局部对比度。

通常，局部对比度更适合漫射信号。由于该信号的特性，局部造影剂用于重建细胞核内的蛋白质。在任何情况下，都需要为每个感兴趣的信号或结构单独调整设置。

单击屏幕底部的绿色箭头完成重建。然后使用 Pencil 工具进一步调整对象。仔细地将重建与原始信号进行比较，并根据需要通过倾斜图像来剪切和删除表面，以便 Cut 工具可以准确地达到其目的。

现在，通过选择 Statistics（统计数据）、Detailed statistics（详细统计数据）和 Average Values（平均值）来测量每个表面的体积、面积和强度。如果需要，可以通过选择相应表面的 颜色 选项卡并将所选选项从 Base 更改为 Statistic Coded 来生成颜色编码的统计数据。使用拍摄快照工具，可以拍摄照片以供发布。

如果要重建同一区域内的多个对象，则可以使用 Store Parameters 函数来保存信息。HEK293 细胞中表达的 Simiate 抗体通过通过 Chariot 肽穿梭到细胞中的 Simiate 抗体特异性检测。Simiate 抗体组合在应用后进入胞体和细胞核，在那里它们与 FLAG-Simiate 特异性共定位，如黄色箭头所示。

Simiate 抗体以剂量依赖性方式诱导 HEK293 细胞大量凋亡，而对照抗体没有作用。鉴于神经元细胞对毒性作用非常敏感，该技术被应用于原代海马培养物，在比较模拟或未处理和 Chariot 处理的细胞时，对神经元的活力没有影响。遵循相同的应用方案，在大约 83% 的细胞中观察到山羊抗豚鼠 Alexa568 抗体组合，它们不同程度地出现在胞体和细胞核中。

这些观察结果得到了 3D 分析的进一步支持，这与 HEK293 细胞的结果一致。因此，Chariot 技术可以成功地用于转染解离的原代海马神经元。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到六个小时内完成。

Chariot 和目标蛋白质的复合物形成大约需要 40 分钟。用这些复合物转染细胞需要 70 分钟，根据货物的大小和特性，需要额外的 1 到 4 小时。在此程序之后，可以执行其他方法以更详细地分析蛋白质的功能，例如实时成像和运动测定、分析和电生理记录。