Name: 从富集组织及消化细胞外基质蛋白的成肽质谱分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习从组织中富集细胞外基质蛋白并进行肽段质谱分析的方法。该技术通过去细胞化处理分离ECM成分，结合蛋白质组学分析揭示正常与病变组织的基质组成特征。

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作者感谢Amanda Del Rosario博士和Guillaume Carmona博士对本文手稿的审阅。本研究得到了美国国防部&#160;DOD创新奖（W81XWH-14-1-0240&#160;，授予ROH）；美国国家癌症研究所（U54 CA126515/CA163109）；麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所；霍华德·休斯医学研究所（ROH为该研究所研究员）；以及部分来自美国国家癌症研究所对麻省理工学院科赫综合癌症研究中心的支持基金（P30-CA14051）的资助。AN获得了霍华德·休斯医学研究所和麻省理工学院路德维希癌症研究中心的博士后奖学金。

注意：该操作可在新鲜或速冻组织上进行。我们建议在解剖时用 PBS 灌注血管丰富的组织，以清除红细胞和血浆蛋白。不建议对固定组织进行该操作，因为固定处理（即， 化学交联会干扰脱细胞过程，并可能显著影响后续的质谱分析。在整个操作过程中，建议使用低吸附性离心管和移液器吸头，以最大程度回收蛋白质和多肽。
1. 组织或肿瘤的脱细胞处理
注意：实验开始前，准备好所有试剂，并向每种缓冲液的所需体积中加入蛋白酶抑制剂（随细胞组分蛋白提取试剂盒提供）。除缓冲液CS需在室温保存以防止SDS沉淀外，所有缓冲液和样品在实验过程中均应保持在冰上。&#160; 
注意：本方案通过一系列不同pH值、含有不同盐浓度和去污剂的缓冲液进行逐步孵育，从而依次提取细胞内蛋白，并富集不溶性细胞外基质（ECM）蛋白（图1，表1；有关本处详述商品试剂盒的替代方法，参见讨论部分）。&#160; 下述试剂体积适用于100 mg组织或肿瘤（见表1），需根据实际情况进行相应调整。
<ol>
	<li>使用组织匀浆器将100 mg组织在含有蛋白酶抑制剂的500 μl缓冲液C中匀浆，直至组织完全破碎并获得均一的悬浮液。 
	注意：将脱氧核糖核酸酶I（终浓度：200 μg/ml，按制造商说明书重悬）和核糖核酸酶A（终浓度：20 μg/ml，按制造商说明书重悬）加入缓冲液N中。</li>
	<li>细胞内可溶性蛋白的逐级提取
	<ol>
		<li>胞质蛋白的提取。&#160; 将匀浆液在4 °C下于试管旋转仪上孵育20分钟。保留少量等分试样（10 μl至20 μl）用于后续的蛋白质印迹分析（参见预期结果部分和图2）。</li>
		<li>在4 °C下以16,000 × g离心匀浆液20分钟。将上清液收集至洁净试管中，此即为蛋白质印迹分析中的胞质（C）组分。迅速冷冻该组分并储存在-80 °C。</li>
		<li>洗涤步骤：将沉淀物重悬于400 μl含蛋白酶抑制剂的缓冲液W中，在4 °C下于试管旋转仪上孵育20分钟。在4 °C下以16,000 × g离心20分钟，弃去上清液。</li>
		<li>提取核蛋白：将沉淀物重悬于150 μl含蛋白酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶I和核糖核酸酶A的缓冲液N中，在4 °C下于试管旋转仪上孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C下以16,000 × g离心样品30分钟，将上清液收集至洁净试管中。重复此步骤一次：第二次离心后，将上清液与前次上清液合并，此即为蛋白质印迹分析中的核（N）组分。迅速冷冻该组分并储存在-80 °C。然后，按照步骤1.2.3进行洗涤。</li>
		<li>提取膜蛋白：将沉淀物重悬于100 μl含蛋白酶抑制剂的缓冲液M中，在4 °C下于试管旋转仪上孵育30分钟。在4 °C下以16,000 × g离心样品30分钟。</li>
		<li>将上清液收集至洁净试管中：此即为蛋白质印迹分析中的膜（M）组分。迅速冷冻该组分并储存在-80 °C。</li>
		<li>提取细胞骨架蛋白：将沉淀物重悬于200 μl含蛋白酶抑制剂的缓冲液CS中，在室温下于试管旋转仪上孵育30分钟。 
		注意沉淀物不会完全溶解。建议通过移液吹打使沉淀物破碎，直至观察到沉淀物明显分散。</li>
		<li>在室温下以16,000 × g离心样品30分钟。将上清液收集至洁净试管中。此时应注意沉淀物体积进一步显著减小（参见视频）。</li>
		<li>将沉淀物重悬于150 μl含蛋白酶抑制剂的缓冲液C中，在4 °C下于试管旋转仪上孵育20分钟。在4 °C下以16,000 × g离心20分钟。</li>
		<li>收集上清液并加入之前的上清液中：此即为蛋白质印迹分析中的细胞骨架（CS）组分。迅速冷冻该组分并储存在-80 °C。</li>
		<li>进行额外洗涤：将沉淀物重悬于500 μl含蛋白酶抑制剂的PBS中，在4 °C下于试管旋转仪上孵育5分钟。在4 °C下以16,000 × g离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤三次。 
		注意：在将蛋白质消化为肽段之前（参见第3节），必须通过多次洗涤彻底去除所有痕量去垢剂。此时，富含细胞外基质（ECM）的沉淀物可迅速冷冻并保存在-80 °C。注意沉淀物的大小取决于起始材料中不溶性（ECM）蛋白的含量以及去细胞化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过SDS-PAGE和Western Blot监测脱细胞/细胞外基质富集的质量
<ol>
	<li>取10–20 μl的总组织提取物和50 μl的中间组分，与含有100 mM DTT的Laemmli缓冲液混合。将富含ECM的不溶性组分重悬于含有100 mM DTT的3倍浓度Laemmli缓冲液中。 
	注意：提高DTT和SDS的浓度有助于溶解相对难溶的ECM蛋白。</li>
	<li>通过SDS-PAGE分离蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>使用特异性抗体进行免疫印迹，以检测细胞质、细胞核、细胞膜、细胞骨架及ECM各组分中代表性蛋白的分布情况（参见结果代表性部分、表2和图2）。</li>
</ol>
3. 用于质谱分析的蛋白质溶液内酶解为肽段

注意：脱细胞处理并去除SDS后获得的沉淀物富含不溶性细胞外基质（ECM）蛋白。若需通过质谱进一步分析，这些蛋白需被消化为肽段。需要注意的是，由于ECM蛋白的不溶性，在此步骤中无法测定样品的蛋白浓度。因此，我们根据ECM富集沉淀物的尺寸（mm）或干重提供用于将ECM富集样品消化为肽段的试剂体积（表3）。碳酸氢铵、尿素、DTT、碘乙酰胺和三氟乙酸溶液均需新鲜配制。
<ol>
	<li>通过向 ECM 富集的沉淀物中加入适量的 8 M 尿素溶液重悬样品，并将 DTT 加至终浓度为 10 mM（参见表 3）。在 37 °C 下以 1,400 rpm 持续振荡孵育 2 小时。 
	注意：此时 ECM 蛋白尚未完全溶解，肉眼可见的大颗粒蛋白不应通过离心或过滤去除。悬浮液将在去糖基化和消化后变得澄清（参见视频）。</li>
	<li>烷基化
	<ol>
		<li>用 HPLC 级水配制碘乙酰胺溶液。将样品冷却至室温，加入碘乙酰胺至终浓度为 25 mM。为实现完全烷基化，DTT 与碘乙酰胺的摩尔比应在 1:2.5 至 1:3 之间。</li>
		<li>在避光条件下于室温孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去糖基化： 
	注意：去糖基化是必要的步骤，用于去除干扰 N-连接糖基化肽段鉴定的碳水化合物侧链。
	<ol>
		<li>用 pH 8.0 的 100 mM 碳酸氢铵溶液稀释至尿素浓度为 2 M，并加入适量的 PNGaseF（参见表 3）。在 37 °C 下以 1,400 rpm 持续振荡孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶切
	<ol>
		<li>加入 Lys-C，在 37 °C 下以 1,400 rpm 持续振荡孵育 2 小时。然后加入胰蛋白酶，在 37 °C 下以 1,400 rpm 持续振荡过夜（O/N）。 &#160; 
		注意：最初在 8 M 尿素中重悬时呈浑浊的富含 ECM 的悬浮液，在过夜酶切后变得澄清（参见视频）。</li>
		<li>向样品中加入第二份胰蛋白酶，继续在 37 °C 下以 1,400 rpm 持续振荡孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酸化
	<ol>
		<li>酶切完成后，使用新配制的 50% 三氟乙酸（TFA）酸化样品以灭活胰蛋白酶。样品 pH 应降至&#60; 2。建议每次加入 1–1.5 μl 的 50% TFA，并取 1 μl 肽溶液用 pH 试纸测定溶液 pH（参见视频）。</li>
		<li>在室温下以 16,000 × g 离心 5 分钟。将上清液收集至洁净的低吸附管中。此时肽溶液可于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱盐 
	注意：此最后一步通常由质谱平台根据其自身偏好的方法进行。
	<ol>
		<li>在进行蛋白质组学分析前，对样品进行脱盐处理，并用新配制的 60% 乙腈、0.1% 三氟乙酸洗脱肽段，随后在真空浓缩仪中浓缩。将肽段重悬于新配制的 3% 乙腈、0.1% 三氟乙酸8中。 
		注意：脱盐后，可通过分光光度法测定肽溶液的浓度（参见“预期结果”部分）。</li>
		<li>随后根据质谱平台的最佳操作流程进行质谱分析。 
		注意：我们鼓励希望通过质谱技术分析 ECM 组成的研究人员参考我们的其他出版物8–10 及相关网站，其中提供了更详细的说明，包括 LC-MS/MS 参数设置、用于蛋白质鉴定的质谱数据搜索，以及使用我们开发的in silico matrisome 注释工具进行数据分析的方法8。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

修饰
尽管我们已采用此精确方案从十种组织和肿瘤类型中富集细胞外基质（ECM）8–10，但在以下情况下应考虑对方案进行修改：
1）检测中间组分中的细胞外基质蛋白。
不同组织或肿瘤类型的细胞外基质在可提取性/不溶性方面可能存在差异，如上文所述的纤连蛋白和层粘连蛋白。例如，人们认为纤维化组织或正在重塑的组织中的细胞外基质动态更新非常迅速，因此在这些组织中可能观察到更高比例的细胞外基质蛋白更容易被提取12。根据检测到细胞外基质蛋白所在的组分，我们建议缩短导致细胞外基质蛋白提取步骤的孵育时间，或省略该步骤。
2) 在富含细胞外基质（ECM）的沉淀物中检测到大量细胞内成分。在某些组织或肿瘤类型中，细胞与ECM的比例特别高（例如， 肝脏、脾脏、非促结缔组织增生性肿瘤）。在此情况下，ECM富集组分中可观察到显著的细胞内蛋白污染（特别是细胞骨架蛋白和/或组蛋白）。为有效去除细胞内蛋白，建议在缓冲液M和/或缓冲液CS中重复孵育两次（两者均含有去垢剂，通常可有效去除丰度较高的细胞内蛋白）。另一种替代方案是使用去垢剂浓度更高的缓冲液，但需注意这可能导致相对可溶性的ECM蛋白也被部分去除（见下一段）。
3）替代使用商业试剂盒的方法。
由于商业机密原因，我们无法从区室蛋白提取试剂盒的供应商处获得缓冲液的精确组分。然而，我们在表1中根据使用自制缓冲液的经验提供了备注，其中包含已知浓度的去垢剂（NP-40、脱氧胆酸钠和SDS），可用于进行类似的提取。最近一项研究也强调了脱细胞缓冲液pH值在保留细胞外基质（ECM）蛋白方面的重要性13。
该技术的局限性
本文所述方法基于细胞外基质（ECM）蛋白本身比大多数细胞内蛋白更难溶解的特性。然而，此处描述的脱细胞方法确实会提取存在于ECM中的可溶性成分，例如某些生长因子或ECM重塑酶。尽管在按所述方法制备的样品中，通过蛋白质组学检测到了与ECM紧密结合的ECM相关蛋白，但该方法可能过于严苛，无法全面分析基质体相关蛋白的组成。
该技术相对于其他方法的重要性
本方法相较于其他方法的优势在于，可根据目标细胞外基质（ECM）的特性进行调整：可省略或重复中间步骤，以分别防止ECM蛋白的丢失或增强污染性细胞内蛋白的去除。该方法仅使用少量洗涤剂，并通过冲洗去除，以避免其对后续肽段制备和质谱分析造成干扰。最后，本文所述将富含ECM的蛋白样品消化为肽段的方法，还具有无需蛋白质溶解的优势，可直接在“粗制”的ECM富集组分上进行。
利用变性剂（如盐酸胍）的替代性脱细胞方法 通过质谱法研究细胞外基质（ECMs）组成的已有文献报道（详见综述） 14）并已与质谱联用以表征软骨细胞外基质的组成15,16心脏17乳腺18 和血管19 和肾小球20 基底膜
建议
如果后续要对细胞外基质（ECM）进行富集以开展蛋白质组学分析，则不应使用胰蛋白酶消化细胞的去细胞化方法，因为胰蛋白酶处理会导致细胞外基质部分降解，并造成细胞外基质蛋白和肽段的丢失。同样，若使用胶原酶消化以辅助组织解离，也需谨慎监控，因为胶原酶同样会引起细胞外基质的降解，导致细胞外基质蛋白和肽段的损失。
溶液内消化与凝胶内消化？细胞外基质蛋白具有交联性且高度不溶，即使在含有6% SDS的3倍Laemmli缓冲液和100 mM DTT中重悬后，其在SDS凝胶电泳中的分离效果仍然较差。因此，凝胶内消化并非首选方法。
未来应用
值得注意的是，尽管本文未予讨论，脱细胞过程中收集的各个中间组分的成分也可通过质谱法进行分析。当研究极小样本（即 人类活检样本）或需要获取其他细胞组分信息时，这种方法可能尤为有价值。

细胞外基质（ECM）是由交联且糖基化的蛋白质构成的复杂网状结构，为细胞提供结构支撑和附着位点，并部分决定组织的生物力学特性1,2细胞外基质蛋白还通过其受体直接向细胞传递信号（例如， 整合素，黏结蛋白 等等。或通过调控生长因子信号传导3因此，细胞外基质（ECM）提供了生物物理和生化信号，这些信号是调控细胞增殖、存活、极化、分化和迁移等细胞过程的主要调节因子。 等等。
细胞外基质（ECM）在生理、发育和衰老过程中发挥着关键作用4。此外，多种疾病（如心血管疾病、纤维化、肌肉骨骼疾病和癌症）的发生或发展均与ECM的改变有关，或导致ECM发生改变。进一步地，ECM有助于维持干细胞微环境，而鉴定支持干性（stemness）的关键ECM分子将直接应用于组织工程和再生医学领域5。然而，尽管ECM具有重要意义，但在过去相当长一段时间内仍未得到充分研究6。
在计算机中 分析表明，基质组（matrisome）被定义为细胞外基质（ECM）及ECM相关蛋白的集合，其产物由人类和小鼠基因组中数百个基因编码。1,7,8然而，细胞外基质蛋白的不溶性阻碍了对其成分的系统性表征 体内 正常与病理样本的细胞外基质。我们近期证明，这种不溶性可被转化为优势，用于富集细胞外基质蛋白8–10我们及其他研究者进一步证明，质谱法是表征细胞外基质（ECMs）组成成分的首选方法8–10, 13.
本文介绍一种脱细胞化方法，该方法包括在不同pH值以及不同盐浓度和去污剂浓度的缓冲液中依次孵育。该方法可有效去除（或耗竭）胞质、细胞核、细胞膜及细胞骨架蛋白，同时富集细胞外基质（ECM）蛋白。随后，我们描述了如何将富集了ECM蛋白的样品消化为肽段，以便通过质谱法进行后续分析。
通过本文详细描述并图示的方法，我们已成功富集并利用质谱技术表征了十种不同组织和肿瘤类型的细胞外基质：正常小鼠肺组织8、人和小鼠结肠组织8,9、人肝脏组织9、人结直肠肿瘤及其肝转移灶9、黑色素瘤异种移植瘤8、乳腺肿瘤异种移植瘤10、小鼠胰岛及小鼠胰岛素瘤（Naba et al.，未发表）。对不同基质组的比较揭示了组织和肿瘤特异性的细胞外基质特征，这些特征可进一步作为潜在的诊断或预后生物标志物。
我们认为，该方案可应用于其他样本，且无需或仅需进行相对较小的修改。

<table><tbody><tr><td>组织匀浆器：Bullet blender + 珠子</td><td>下一步进展</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender&quot;&gt;BB24-AU&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>区室提取试剂盒</td><td>Millipore</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145&quot;&gt;2145&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;DN25&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 A</td><td>Qiagen</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/&quot;&gt;19101&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;34877&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;U4883&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt&quot;&gt;20291&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵（NH₄HCO₃）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;9830&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;A3221&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>肽-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;去糖基化酶 F（PNGaseF）</td><td>New England Biolabs</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f&quot;&gt;P0704S&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>内切蛋白酶 LysC，质谱级&amp;nbsp;</td><td>和光</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm&quot;&gt;125-05061&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，质谱级&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/&quot;&gt;V5111&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&amp;amp;地区=美国&quot;&gt;T6508&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，质谱级&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade&quot;&gt;51101&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>脱盐柱：Oasis HLB 1&amp;nbsp;cc，每根色谱柱含10 mg吸附剂</td><td>Waters</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383&quot;&gt;186000383&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

组织中细胞外基质蛋白的富集及其酶解为肽段用于质谱分析

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

细胞外基质（ECM）是由交联蛋白构成的复杂网状结构，可提供生物物理和生化信号，是细胞增殖、存活、迁移等过程的主要调控因子。etc. 细胞外基质在发育过程中发挥重要作用，也参与多种病理过程，包括心血管和肌肉骨骼系统疾病、纤维化以及癌症。因此，对正常和病变组织中细胞外基质成分的表征，可能有助于发现新的预后和诊断生物标志物，以及潜在的新型治疗靶点。然而，由于细胞外基质蛋白本身具有分子量大、交联且共价结合、高度糖基化等特点，使得对细胞外基质的生化分析极具挑战性。为克服这一难题，我们开发了一种方法，可从新鲜或冷冻的组织及肿瘤中富集细胞外基质，该方法利用了细胞外基质蛋白不溶于水的特性。本文详细描述了一种去细胞化流程，该流程包括在不同pH值、盐浓度和去垢剂浓度的缓冲液中依次孵育，从而实现：1）提取细胞内蛋白（胞质、核、膜及细胞骨架蛋白）；2）富集细胞外基质蛋白。随后，我们描述了如何对富集的细胞外基质蛋白样品进行去糖基化处理，并将其消化为肽段，以用于后续的质谱分析。

脱细胞过程的质量控制
可通过蛋白质印迹法分析各组分中的蛋白质含量，以监测脱细胞效率。表2列出了可用于评估脱细胞过程质量的具有诊断价值的蛋白质。图2A显示，在中间组分中，胞质蛋白（GAPDH）、核蛋白（组蛋白）、膜蛋白（β1整合素）和细胞骨架蛋白（肌动蛋白）均被有效提取，而在这些组分中未检测到细胞外基质（ECM）蛋白（I型胶原）（图2）。相反，最终沉淀物富含ECM蛋白，而胞内蛋白则基本被去除（图2A）。图2B显示胞内蛋白已得到满意去除（在富含ECM的组分中未检测到组蛋白），尽管在富含ECM的组分中仍可检测到肌动蛋白，且在CS组分中可见单体I型胶原（表观分子量约110 kDa，推测为未组装的I型胶原）的减少。
我们还常规检测其他细胞外基质蛋白，如纤连蛋白和层粘连蛋白，尽管在某些组织中，这些成分可能在早期提取组分中部分溶解8-10。例如，纤连蛋白也以可溶性血浆纤连蛋白的形式存在，这种形式并未整合到细胞外基质中。在提取前对组织进行灌注可降低血浆纤连蛋白的浓度，但并不总能完全去除。在某些组织中，层粘连蛋白与细胞表面或细胞外基质的结合较为松散，会在中间提取组分中被溶出。若出现这种情况，可通过调整提取条件予以解决（见讨论部分）。
请注意，细胞外基质蛋白的富集以及细胞内组分的相应去除是基于不同缓冲液中蛋白质的相对溶解度差异，而这种差异在不同组织之间有所不同——在某些情况下，组蛋白和肌动蛋白比其他情况下更容易被提取。另外需要注意的是，尽管组蛋白预期应在N组分中被提取（图2B），但我们通常观察到在M组分或CS组分中组蛋白的去除更为彻底（图2A 和 B）。
预期的肽浓度
消化、酸化和脱盐后获得的肽溶液浓度可通过分光光度法测定，可选择测量肽溶液在280 nm波长处的吸光度（对应于色氨酸和酪氨酸），或在205 nm波长处的吸光度（对应于肽键的吸收）。
我们测定了平行制备的三份小鼠肺组织样本（分别为82 mg、100 mg和100 mg）经脱细胞化后所得多肽溶液的浓度，结果分别为：424 ng/µl、450 ng/µl 和 580 ng/µl 的多肽。
通过质谱法鉴定细胞外基质肽段
对按照本文所述方法制备的富含细胞外基质（ECM）的蛋白质样品进行质谱分析表明， &gt;70% 的信号强度对应于细胞外基质及与细胞外基质相关的蛋白质8-10.
表1. 使用组分提取试剂盒对100 mg（湿重）组织或肿瘤进行脱细胞所需的试剂体积。 本表列出了用于对100 mg组织或肿瘤进行脱细胞处理时，每种缓冲液的组成及其使用体积。蛋白酶抑制剂混合物以50倍浓缩液形式提供，需加入每种缓冲液中2。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>区室蛋白提取试剂盒中的试剂</td>
			<td>每100 mg组织所需体积</td>
			<td>成分（基于Millipore产品说明书编号cat#21451）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td>500 μl</td>
			<td>HEPES (pH 7.93), MgCl2, KCl, EDT4, Sucrose, Glycerol, Sodium Orthovanadate5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>400 μl</td>
			<td>HEPES (pH 7.9), MgCl2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer N </td>
			<td>150 μl x 2</td>
			<td>HEPES (pH 7.9), MgCl2, NaCl, EDTA, Glycerol, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>400 μl</td>
			<td>HEPES (pH 7.9), MgCl2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer M</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>HEPES (pH 7.9), MgCl2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Sodium deoxycholate (DOC)6, NP-406, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer CS</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>PIPES (pH 6.8), MgCl2, NaCl, EDTA, Sucrose, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)7, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer C</td>
			<td>150 μl</td>
			<td>HEPES (pH 7.9), MgCl2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Sodium Orthovanadate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>500 μl/次洗涤</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
注意事项: 
1 由于商业机密原因，我们无法从试剂盒供应商处获得缓冲液的精确组分，但在此基于我们使用自制缓冲液进行类似提取的经验提供一些说明。 
2 蛋白酶抑制剂：建议包含针对半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸肽酶、丝氨酸酯酶以及二价阳离子依赖性金属蛋白酶的多种抑制剂 等等。 市面上有多种商用蛋白酶抑制剂混合物。 
3 pH 高于 7.0 可有效抑制溶酶体蛋白酶。 
4 EDTA（通常使用浓度为 2 mM）是一种有效的依赖二价阳离子的蛋白酶抑制剂。 
5 偏钒酸钠是一种磷酸酶抑制剂。典型有效浓度为 0.5–5 mM。 
6 0.1%–0.5% 的 NP40 足以溶解大多数膜脂质。NP40 与 DOC 联用时——通常采用相等浓度（例如，各0.5%）常用于更严格的提取条件，同时仍能保持多数蛋白质-蛋白质相互作用的完整性。 
7 SDS 是一种更严格的离子型去垢剂（CMC 0.1%）。也可与其他两种去垢剂联用，组成中等严格性的缓冲液 SDS/NP40/DOC（0.1/0.5/0.5%）。
表2. 用于监测脱细胞过程质量的诊断蛋白。 本表列出了各亚细胞区室（胞质溶胶、细胞核、质膜、细胞骨架和细胞外基质）特征性蛋白的例子，可用于监测脱细胞过程的质量以及细胞外基质富集的效率。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞内区室</td>
			<td>诊断用蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胞质蛋白</td>
			<td>甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>核蛋白</td>
			<td>组蛋白、层粘连蛋白、核孔蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜蛋白</td>
			<td>整合素、转铁蛋白受体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞骨架蛋白</td>
			<td>肌动蛋白、微管蛋白、波形蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基底膜细胞外基质蛋白</td>
			<td>IV型胶原、nidogen、层粘连蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>间质细胞外基质蛋白（间质）</td>
			<td>I型胶原、III型胶原、VI型胶原、纤连蛋白</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
有关抗体的推荐信息，请参见我们的出版物8-10。
表3. 将细胞外基质富集样品消化为肽段所需的试剂体积。 本表列出了用于重悬细胞外基质富集蛋白样品，并在质谱分析前对蛋白样品进行还原、烷基化、去糖基化及消化成肽段所用的试剂。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>配制方法</td>
			<td>1 mm厚沉淀物（约5–10 mg干重）的终浓度/用量</td>
			<td>1 mm厚沉淀物（约5–10 mg干重）的体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碳酸氢铵 (NH4HCO3)</td>
			<td>用HPLC级水配制成100 mM溶液</td>
			<td> - </td>
			<td> - </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尿素</td>
			<td>用100 mM碳酸氢铵溶液配制成8 M溶液</td>
			<td>8 M</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二硫苏糖醇</td>
			<td>用HPLC级水配制成500 mM溶液</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碘乙酰胺</td>
			<td>用HPLC级水配制成500 mM溶液</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>2.5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肽-N-糖苷酶F (PNGaseF)</td>
			<td>商品化溶液，浓度为500 U/μl</td>
			<td>1,000 U</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>内切蛋白酶LysC，质谱级</td>
			<td>用HPLC级水配制成0.5 μg/μl溶液</td>
			<td>1 μg</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶，质谱级（第一轮）</td>
			<td>商品化溶液，浓度为0.5 μg/μl</td>
			<td>3 μg</td>
			<td>6 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰蛋白酶，质谱级（第二轮）</td>
			<td>商品化溶液，浓度为0.5 μg/μl</td>
			<td>1.5 μg</td>
			<td>3 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三氟乙酸 (TFA)</td>
			<td>用HPLC级水配制成50%溶液</td>
			<td> - </td>
			<td>2–5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙腈（洗脱）</td>
			<td>用含0.1% TFA的HPLC级水配制成60%溶液</td>
			<td> - </td>
			<td>500 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙腈（重悬）</td>
			<td>用含0.1% TFA的HPLC级水配制成3%溶液</td>
			<td> - </td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<img alt="脱细胞化流程图：ECM富集、机械/化学裂解、质谱分析前处理" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验流程示意图。 本方案的示意图工作流程包括组织脱细胞化（第1节）、脱细胞化质量控制及细胞外基质（ECM）富集程度评估（第2节），以及在进行质谱分析前将富含ECM的蛋白质样品消化为肽段（第3节）。
<img alt="小鼠肺和乳腺癌异种移植蛋白表达的蛋白质印迹分析。" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过蛋白质印迹法对脱细胞化过程进行质量控制。 使用以下抗体对小鼠肺（A）和人乳腺癌异种移植（B）样本进行蛋白质印迹分析：兔抗肌动蛋白抗体（克隆 14-1）和兔抗 β1 整合素抗体由本实验室制备；兔抗 I 型胶原抗体、鼠抗 GAPDH 抗体和兔抗全组蛋白抗体购自 Millipore。在与一抗孵育后，将膜洗涤并孵育于 Jackson ImmunoResearch Laboratory 提供的 HRP 标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗中。最后，将膜再次洗涤并孵育于 PerkinElmer LAS 提供的 Western Lightning™ 化学发光试剂中。* 表示 ECM 富集组分中存在微量残留的组蛋白污染。** 表示 CS 组分中单体（推测为未组装）I 型胶原的部分耗竭。*** 表示 ECM 富集组分中存在残留的肌动蛋白污染。使用抗胶原抗体检测到的弥散条带代表不同水平的翻译后修饰（例如，交联、糖基化）。

本方案描述了一种从组织或肿瘤中富集细胞外基质（ECM）蛋白，并对富集的ECM组分进行去糖基化和消化处理，以生成可用于质谱分析蛋白质组成的肽段的方法。

细胞外基质（ECM）是由交联蛋白构成的复杂网状结构，可提供生物物理和生化信号，这些信号是调控……的重要因素

本实验的总体目标是通过质谱法对组织中细胞外基质的组成进行表征。首先将选定的组织彻底破碎并完全均质化，以实现这一目标。第二步包括对组织进行脱细胞处理，以富集细胞外基质蛋白，同时去除所有细胞内成分。接下来，在最后一步中，将富含细胞外基质（ECM）的蛋白质样品进行变性处理，变性后的富含ECM的蛋白质样品经去糖基化并消化成肽段。通过血液分析监测脱细胞化及ECM蛋白质富集的质量。最终，通过质谱分析这些肽段，可对特定组织的细胞外基质（ECM）组成成分进行表征。该方法不仅有助于了解正常组织细胞外基质的组成，也可应用于其他系统，例如癌症等疾病组织。首先，按照文本方案中的说明配制所有缓冲液，包括蛋白酶抑制剂的添加，如表一所示。然后使用组织匀浆器在500微升缓冲液C中匀浆100毫克组织，直至获得均匀的悬浮液。将匀浆液转移至试管旋转仪中，在4摄氏度下孵育20分钟。取10至20微升样品加入预先标记为“总组织提取物”或“起始材料”的试管中，用液氮速冻，随后于-80摄氏度保存。接下来，在 4°C 条件下，以 16,000 × g 离心均质液 20 分钟。将上清液收集到一个洁净的离心管中，并标记为胞质组分或 C 组分。迅速冷冻 C 组分，并于 -80°C 保存。用移液器吹打混匀。将沉淀重悬于400 µL缓冲液双倍浓度中，然后在4 °C条件下于旋转仪上孵育20分钟。接着离心样品，弃去上清液，以首先提取核蛋白。将沉淀重悬于150微升缓冲液N中，在4摄氏度下于试管旋转仪上孵育30分钟。接着离心样品，将上清液收集至洁净的离心管中。离心后，再次在缓冲液N中进行孵育。合并上清液，并标记为核组分或N组分。将N组分快速冷冻，于-80°C保存。加入100 µL缓冲液M，重悬沉淀。接下来，将样品置于4°C条件下，在试管旋转仪上孵育30分钟，然后进行离心。将上清液收集至一个洁净的试管中，并标记为膜组分或M组分。将M组分快速冷冻，并于-80°C保存。用200微升CS缓冲液重悬沉淀，通过剧烈吹打混匀，然后将样品置于试管旋转仪上室温孵育30分钟。在室温下以离心力离心30分钟，收集上清液至洁净离心管中，并标记为细胞骨架或CS组分。此时沉淀应明显变小。将沉淀重悬于150微升缓冲液C中。将样品转移至旋转管中，在4摄氏度下孵育20分钟。在4摄氏度下离心20分钟，收集上清液。接着，将该上清液与已标记为细胞骨架或CS组分管中的CS缓冲液上清液混合。速冻。将CS组分冷冻并置于-80摄氏度保存。洗涤沉淀物：将其重悬于500 µL PBS中，然后在4摄氏度下于试管旋转仪上孵育5分钟。离心试管并弃去上清液。总共洗涤三次。为获得富含细胞外基质（ECM）的沉淀，请保留少量ECM组分用于实验的Western印迹质控分析。将组分在液氮中快速冷冻，并在零下80摄氏度保存。开始消化前，先将富含ECM的沉淀重悬于8摩尔尿素中，然后加入水中的二硫苏糖醇溶液，使其终浓度为10毫摩尔。将试管转移至培养箱中，在37摄氏度下以1400转/分钟振荡两小时。随后，将样品冷却至室温，并加入用蒸馏水重悬的碘乙酰胺溶液，使其终浓度为25毫摩尔/升。将混合物避光孵育30分钟。在室温下，用 100 毫摩尔碳酸氢铵将样品稀释至 2 摩尔尿素浓度，然后加入 P PGA F。将样品转移至培养箱中，在 37 摄氏度、1400 转/分钟条件下振荡反应 2 小时。接着向混合物中加入内肽酶 Slice C，在 37 摄氏度、1400 转/分钟条件下继续振荡反应 2 小时。随后，加入胰蛋白酶，在 37 摄氏度、1400 转/分钟条件下过夜振荡反应。浑浊的溶液在过夜消化后应变得澄清，加入第二份等量的胰蛋白酶，继续振荡两小时以灭活胰蛋白酶。逐滴加入一微升的50%三氟乙酸至混合物中，每次增加一微升，直至pH值低于2。通过将一微升肽溶液点在pH试纸上监测pH值。室温下离心溶液五分钟。最后，将上清液收集到洁净的低吸附离心管中。将细胞外基质肽溶液于 -20 摄氏度保存。肺组织去细胞化过程的 Western 印迹结果显示，在中间组分中提取出了细胞内成分，如 β-肌动蛋白（ASIN beta one actin GA）、dh 和组蛋白。这些组分在细胞外基质（ECM）组分中几乎完全不存在，尽管仍存在少量组蛋白污染。相反，I型胶原在ECM组分中高度富集，但在其他组分中未检测到，表明在提取的中间步骤中没有胶原丢失。在人记忆性癌中也获得了类似结果。异种移植的I型胶原在细胞外基质（ECM）组分中显著富集，仅少量流失至CS组分。在该方法建立后，ECM组分中仍残留少量肌动蛋白污染。该技术为生物学家和临床医生探索正常与病变组织中细胞外基质的复杂性奠定了基础。

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Research

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Biology

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