用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

本实验的总体目标是检测和分析脑组织细胞外空间中的离子动态。通过使用离子选择性微电极来实现离子瞬变的测量，这些微电极可根据双管或同心结构设计制备。第一步，需在实验浴液中对微电极进行校准。

然后将电极插入急性小鼠海马脑片进行记录，以诱发细胞外离子移动，同时给予递质谷氨酸或谷氨酸激动剂。谷氨酸结合并打开突触后树突棘上的离子型受体，从而允许钠离子内流和钾离子外流。最终，细胞外钠离子浓度降低，同时细胞外钾离子浓度升高，这些变化可被离子选择性微电极检测到。

该方法用于研究脑内细胞外离子调节以及由活动诱导的铁瞬变。本文介绍了两种离子选择性微电极的制备与校准方法，并展示了如何在急性脑组织切片中使用这些电极，以测量神经递质作用下细胞外钾离子或钠离子浓度的变化。

该实验步骤将由 Nicole Hark 和 Simon 为我的实验室进行演示。开始此操作前，准备一根带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，用于离子敏感电极；另准备一根用于后续的参比电极。接下来，使用双组分胶水或一小条铝箔，将长、短毛细管的两端固定在一起。

将双巴氏吸管置于炉中，在 60 摄氏度下加热一小时以去除残留水分。随后将电极存放在干燥器中直至使用。使用转轮粉笔将双巴氏吸管在垂直拉制仪中居中定位。使用粉笔以防止巴氏吸管过度拉伸。

轻轻保持线圈，直至玻璃软化到足以使旋转器进行水平旋转。冷却后，将夹头旋转180度，移除机械断裂部分。应用第二次加热程序以拉制毛细管，得到两根尖锐的双通道毛细管。

双巴氏吸管的尖端直径应接近一微米。现在用蒸馏水填充参考管直至其尖端，以防止污染。在接下来的操作中，将双巴氏吸管尖端朝上放置于定制的支架上。

然后将此支架放入盛有预热六甲基二硅氮烷（HMDS）的广口瓶中，孵育70分钟。之后，将毛细管转移至金属支架上。随后，将其放入预热好的炉中干燥两小时，以在定植后干燥两个管腔，并将毛细管保持干燥状态，存放在干燥器中直至使用。

在实验当天，通过在硅化套管的尖端加入两到三微升的离子选择性传感器来准备离子选择性电极。然后，对于钠敏感微电极，用100毫摩尔氯化钠溶液反向填充套管；对于钾敏感微电极，则用100毫摩尔氯化钾盐溶液反向填充。在此操作过程中需注意避免引入额外的气泡。

如果灌注成功且传感器填充良好，传感器表面应呈现出相对于回填部分清晰可见的凹面。接下来，填充参比通道，然后将氯化银丝插入两个管腔中，并用牙科蜡密封每个管腔。在此步骤中，使用水平拉制仪将一段两毫米的毛细管拉制成短锥形，尖端直径为四微米。

使用前立即用 0.2 微升传感器填充硅化毛细管。制备内毛细管时，拉制一根小直径毛细管，得到两根具有长锥形和尖锐尖端的毛细管，然后用 100 毫摩尔氯化钠或 100 毫摩尔氯化钾生理盐水填充。

将装有传感器的毛细管和装有生理盐水的毛细管并排置于由盖玻片制成的定制塞子上。将较细的毛细管部分插入较粗的毛细管中。接着，将毛细管固定在另一张盖玻片上。

使用建模黏土将毛细管转移至显微镜载物台上，并在100倍放大倍数下观察。借助安装在显微操作器上的玻璃棒，缓慢将外层毛细管向前推进，覆盖内层毛细管，直至两者尖端之间的距离约为五微米。使用牙科蜡将外层毛细管的开口端固定在内层毛细管上，并插入银丝。

制备参比电极时，使用垂直拉制仪将带纤维的毛细管拉制，弃去上端的移液管，然后打开下端卡盘，将下端移液管向上提起约五毫米。再次关闭卡盘，并将其上提，使下端电极尖端位于加热线圈上方约五毫米处。随后加热线圈，并用镊子将尖端向一侧弯曲约45度。

再次将其弯曲约负45度，使尖端回转至与主杆平行。然后用大量缓冲盐水填充参比电极管。将一根氯化银丝插入其中，并用牙科蜡密封管口。

在此步骤中，将离子敏感电极和参比电极均连接至显微操作器，并将其浸入灌流人工脑脊液的实验腔室中。在体视显微镜下，将氯化银导线连接至差分放大器探头端的相应输入端口，随后测定电极电阻。

然后，将电压信号调零并开始记录以进行校准。获得稳定的基线后，切换至含有待测离子特定浓度的生理盐水。现在，将一片250微米厚的海马脑片转移至实验记录室，并用网格固定。

将校准的离子选择性微电极降至脑片表面，随后再将电极进一步下降约50微米，进入CA1区的辐射层。为施加神经递质激动剂，用0.5毫摩尔谷氨酸填充施加用移液管。

将移液管连接至显微操作器，并与压力施加装置耦合。接着，将施加用移液管缓慢插入组织，并小心地将其置于离子选择性微电极尖端附近。启动压力施加，设定为 40 毫巴。

图中显示了双管电极和同心电极的参比管在浴液钠离子浓度变化时电压的变化情况。同时，图中还展示了双管电极和同心电极的钠电位电压随浴液钠离子浓度变化的情况。该图显示了两种电极的钠电位电压与浴液钠离子浓度之间的半对数关系图。

线性图显示，两种电极的斜率均约为48毫伏。此处为双管电极和同心电极对浴液中钠离子浓度从152毫摩尔快速变化至70毫摩尔时的响应情况。

请注意，同心电极的响应时间明显更快。该图显示了双管电极和同心电极检测到的细胞外钠离子瞬变，以及参比管电压的瞬时变化。细胞外钠离子浓度的变化是通过灌流10毫摩尔的天冬氨酸持续120秒（如图中条形所示）所诱导的。而在该图中，参比管电压和细胞外钠离子浓度的瞬时变化则是通过局部加压施加10毫摩尔谷氨酸0.2秒所诱导的。

请注意，在此条件下，锥形电极的响应时间显著加快。在尝试该操作时，必须牢记，适当的静置是成功制备铁选择性微电极的关键步骤。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备和使用这些电极，以检测脑组织中的细胞外铁瞬变。