Name: 脑组织中的双管和同心微电极用于测量细胞外离子的信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习制备双管和同心离子选择性微电极的方法，用于测量小鼠海马脑片中的细胞外钾离子和钠离子浓度变化。该技术可精确检测神经递质诱导的离子动态，为研究神经元信号传导提供重要工具。

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作者谨此感谢 C. Roderigo 提供的专业技术协助。感谢 S. Köhler（德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学先进成像中心）在视频制作方面的帮助。作者实验室的研究工作得到了德国研究基金会（DFG：Ro 2327/8-1，资助 CRR）、德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学（资助 NH）以及美国国立卫生研究院基金 R01NS032123（资助 MC）的资助。

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作者声明无竞争利益。

基于液态载体的离子选择性电极已成功应用数十年，并且针对多种离子已有高特异性传感器可供使用22-26。然而，在脊椎动物脑组织的细胞外间隙（ECS）中应用时必须注意，该技术具有较强的侵入性：尽管细胞外间隙的宽度仅为约20–50 nm，离子选择性微电极的直径却约为1 µm（双管电极）或更大（同心电极）。因此，离子选择性微电极的尖端在穿入组织时不仅会损伤组织，还会扩大细胞外间隙，导致对离子瞬变的低估。尽管存在这些局限性，不同实验室所记录到的神经元活动引发的细胞外离子瞬变结果却表现出高度一致性7,8，证明了该方法的可靠性。
离子选择性电极的性能和适用性取决于其灵敏度和选择性，而这些特性由所使用的传感器混合物（“液态膜离子载体”）决定。传感器混合物包含一种特殊的载体分子， 例如 缬氨霉素用于 K+-对钾具有高选择性的微电极 27然而，可能会与其他离子发生交叉反应，必须进行测试。缬氨霉素对铵根离子具有显著的交叉反应性，在解读结果时需予以考虑（例如 11,12）。此外，由于离子载体的电压响应遵循能斯特行为（参见公式1），其信噪比和检测阈值取决于待测离子的浓度。因此，当[K+]o 瞬变过程在低基线[K+]o，小量 [Na+]o 瞬变信号在高基线[Na+]o （参见 图5和图6).
离子选择性电极的性能还取决于其时间分辨率，而时间分辨率主要由电极的电时间常数决定。电时间常数主要取决于传感器的轴向电阻以及移液管长度方向上内部溶液与外部液体之间的分布电容。在双通道配置中，由于回填离子传感器形成长液柱，电阻较高。对于给定的绝缘介质（本例中为硼硅酸盐玻璃），电容由介质厚度决定。在双通道电极中，介质宽度即为移液管的玻璃管壁厚度。当玻璃在尖端附近变薄时，介质宽度减小，电容随之增加。这些因素共同作用，使得电极的响应时间随参数变化而介于数百毫秒到数秒之间。
同心设计的一个主要优点是轴向电阻和相对于浴液的电容都大大降低。同心移液管分流了大部分后填充离子交换剂的电阻，仅在尖端前几微米处残留少量电阻。此外，同心移液管内的填充液在物理上与浴液相隔较远，中间隔着两层玻璃壁的厚度，从而显著降低了电容。如先前所示10，电阻和电容降低的综合效应使时间分辨率提高了两个数量级。对于同心Ca2+和pH微电极而言，90%响应时间可低至10–20毫秒10。同心设计的另一个相关优势是噪声水平较低（参见图8）。由于电阻显著降低，来自任何环境噪声的电压瞬变被最小化。此外，由于时间常数较短，此类瞬变的恢复速度很快。因此，这类伪影幅度小、持续时间短，对生理记录的干扰更小（参见图8）。
同心电极技术也存在一些缺点。首先，其组装过程更为复杂且耗时。第二个缺点是需要放置一个独立的参比微电极，并将其尖端定位，这要求使用单独的显微操作器或专用的双通道操作器。最后，双管微电极可进一步扩展为三管设计，从而能够同时检测两种不同的离子种类28，而同心电极则无法实现这一功能。
最常见的陷阱
硅烷化效率低下。
制造任何基于液体传感器的离子选择性微电极过程中，最重要的步骤及主要障碍均为硅烷化处理。当电极无法响应特定离子浓度的变化，或响应呈现亚能斯特响应（sub-Nernstian response）时，即，远低于每十倍浓度差58 mV），通常是由硅烷化效果不佳所致。根据我们的经验，当环境湿度过高或过低时（分别类似于夏季或冬季的典型条件），便可能发生这种情况。如果能够对室内湿度进行一定程度的控制，则可克服此类问题。
电极电阻过高。
如有需要，可通过打磨降低离子敏感电极管的电阻。为此，将其尖端暴露于水中悬浮的研磨剂强射流中数秒钟。这将导致其最顶端断裂，从而使电阻降至所需值。
盐桥。
离子管与参考管之间的盐桥会导致电极响应不良或无响应，因此也会严重干扰电极在标定过程中的性能。如上所述（见第1.6点），这一问题主要出现在选用双管型theta玻璃时，而采用本方法所述的偏移式扭绞管技术时则较为罕见。
考虑到制备的简便性，Lux29最初的双管设计通常可有效利用。该方法首先将离子管和参比管预先填充盐溶液，然后通过尖端吸入并推出硅烷溶液进行快速处理，随后同样通过尖端引入离子交换剂（见30,31）。此类电极的制备大约需要10分钟，但其尖端尺寸通常为4 µm或更大，且在实验过程中更容易失效。相比之下，采用硅烷蒸气暴露并加热的硅烷化方法可制备出尖端更小、使用寿命可达数天甚至数周的电极。
综上所述，目前已有多种制备离子选择性微电极的方案和方法。本文中，我们描述了两种在本实验室中效果良好且可靠的微电极制备主要步骤，分别为绞合式双管微电极和同心式双管微电极，其总体成功率接近100%。重要的是，这些技术可推广应用于其他离子种类的检测，包括pH或钙离子，也可用于除脑组织以外的其他样本，如充满液体的腔隙或一般体液。最后但同样重要的是，离子选择性微电极可用于测定细胞内离子浓度。由于其尖端尺寸相对较大（约1 µm），该技术仅适用于胞体较大的细胞，例如无脊椎动物标本中常见的细胞28,32。

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

大脑中的电信号依赖于离子跨质膜的流动。主要离子进出细胞外空间的过程不仅通过电压门控离子通道介导，还通过突触后离子型受体以及离子转运体实现。因此，神经元活动伴随着细胞外所有主要离子浓度的复杂变化1。例如，兴奋性活动期间钠离子流入神经元已被证实会导致细胞外钠离子浓度（[Na+]o）下降2。细胞外钙离子浓度同样如此，因为钙离子会快速进入突触前和突触后结构3。与此同时，钾离子则朝相反方向移动，导致细胞外钾离子浓度（[K+]o）升高至低毫摩尔（mM）范围4,5。突触活动还会引起细胞外pH值的变化，部分可通过伴随发生的胶质细胞膜离子流动得到缓解，而这些流动会改变细胞内胶质细胞的pH值6,7。这些与活动相关的细胞外离子浓度变化具有重要的功能影响。例如，即使[ K+]o的轻微升高也会使神经元和胶质细胞去极化，从而改变神经元的兴奋性，且存在多种机制用于清除过量的钾离子8。这些机制若失效，可能导致神经元出现癫痫样放电或如扩散性抑制等现象1。
由于细胞外离子浓度具有至关重要的作用，因此在生理和病理生理条件下，通常需要对其进行定量测定，以理解神经网络的功能与功能障碍。几十年来，双管离子选择性微电极已被证明是用于脑组织中此类测量的优秀工具9。对于许多离子，已有高度特异、对其他离子交叉反应性低的传感器可供使用。除了经典的双管电极外，近年来还引入了所谓的同轴电极。后者具有更优的时间分辨率，但在制备上需要更多的时间和精力10。
接下来，我们将介绍这两种离子选择性微电极的制备与校准方法。随后展示如何在脑片标本中使用这些电极，通过不同刺激范式（包括药物的浴应用和压力施加）诱发兴奋性活动，进而测量细胞外钾离子浓度 [K+]o 或钠离子浓度 [Na+]o 的变化。

<table><tbody><tr><td>研磨剂&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>MicroPolish&amp;nbsp;</td><td>Buehler有限公司</td><td>溶解于 A.dest 中</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>移液管；75 mm × 2 mm，壁厚 0.3 mm</td></tr><tr><td>带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>GC 150 F-15&amp;nbsp;</td><td>Clark 电生理仪器公司，哈佛仪器公司</td><td>双巴雷尔微电极传感器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带纤维的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments，Harvard Apparatus</td><td>双巴雷尔微电极的参考&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>GB-200TF-15&amp;nbsp;</td><td>科学产品</td><td>同心外通道。外径 2.0 mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带玻璃丝的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>GB-120TF-10</td><td>科学产品</td><td>同心内管，外径 1.2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>带前置放大器的静电计放大器</td><td></td><td>定制</td><td>Rin = 10 T&amp;Omega; 以及 Ibias = 50 fA–1 pA（商业可购得）&amp;nbsp; 替代方案： &lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; Dagan IX2-700，配备前置放大器（10 GΩ 反馈电阻）或 EPMS-07，NPI，Tamm，德国</td></tr><tr><td>实验腔室</td><td></td><td>定制</td><td>可从商业渠道获得 &lt;i&gt;例如&lt;/i&gt; &amp;nbsp; Warner Instruments，美国&amp;nbsp; 英国 Scientifica 公司</td></tr><tr><td>熔炉</td><td></td><td>Heraeus</td><td>必须保持恒定在200 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>硬质粘性蜡 / 牙科蜡&amp;nbsp;</td><td>Deiberit 502&amp;nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme &amp;amp; Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td>定制</td><td>必须始终保持在40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>由有机玻璃制成的微电极夹持器</td><td></td><td>定制</td><td>双联管：O.D. &amp;nbsp;毛细管 1.5 mm，同心：外径&amp;nbsp; 毛细血管 2 mm</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>目标</td><td>计划 0.8xLWD</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Model PP-830</td><td>Narishige</td><td>同心微电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>拉管仪</td><td>Model P-97</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td>同心微电极传感器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气动药物喷射系统</td><td>Picospritzter II型</td><td>General Valve TM 公司</td><td></td></tr><tr><td>平移燕尾台</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>双组分胶水</td><td>&amp;nbsp;Araldite</td><td>亨茨曼先进材料有限公司</td><td>也可使用一小条铝箔将毛细管粘在一起&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>银线</td><td>99.9%&amp;nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>切片机 / 振动切片机</td><td>Microm HM 650 V</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>AxoScope 8.1&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>垂直拉制仪&amp;nbsp;</td><td>PE-2型</td><td>Narishige科学仪器公司</td><td>配备可旋转卡盘的&amp;nbsp; 双管微电极</td></tr><tr><td>x/y 平移台</td><td></td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>1(S),9(R)-(&amp;minus;-荷包牡丹碱甲碘化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14343</td><td>GABAA受体的竞争性拮抗剂（光敏感）；注意：有毒</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂；注意 有毒性</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>NMDA受体拮抗剂；注意 有毒</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>警告：易燃，经口、经皮和吸入急性毒性，对金属和皮肤具有腐蚀性</td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td>激活NMDA、非NMDA受体及EAATs</td></tr><tr><td>L-谷氨酸单钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td>激活NMDA受体、AMPA受体、QA受体和KA受体，&amp;nbsp; mGluRs 和 EAATs</td></tr><tr><td>钾离子载体 I - 混合液 B</td><td>Fluka&amp;nbsp;</td><td>60403</td><td>基于缬氨霉素；注意：有毒</td></tr><tr><td>钠离子载体 II - 混合液 A</td><td>Fluka&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>71178</td><td>基于 ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>电压门控Na+通道抑制剂；注意：有毒</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

大脑中的电活动伴随着跨膜的显著离子流动，导致细胞外环境中所有主要离子浓度发生复杂变化。由于这些离子浓度变化具有重要的功能意义，因此通常需要对其进行定量测定，以理解神经网络在生理和病理生理条件下的功能与功能障碍。在本研究中，我们展示了双管离子选择性微电极的制备与校准方法，此类电极已被证明是脑组织中此类测量的优秀工具。此外，本文还介绍了所谓的“同心式”离子选择性微电极，其由于结构设计不同，能够实现对快速离子变化更优的时间分辨率。随后，我们展示了这些电极在小鼠海马急性脑片标本中的应用。利用双管钾离子选择性微电极，演示了细胞外钾离子浓度（[K+]o）在施加谷氨酸受体激动剂或出现癫痫样活动时的变化。此外，我们还展示了钠离子敏感的双管和同心式电极的响应特性，并比较了它们在浴式或加压给药诱导下对细胞外钠离子浓度（[Na+]o）变化的检测能力。这些测量结果表明，尽管响应幅度相似，但与双管设计相比，同心式钠离子微电极具有更优的信噪比和响应速度。总体而言，所展示的方法可轻松推广至其他离子种类（包括pH或钙离子）的测量，并适用于其他实验标本。

为了监测[K+]o 并响应兴奋性活动的变化，将一根双管钾选择性微电极插入 辐射层 CA1 区域。刺入几分钟后，电极的选择性离子桶部达到稳定基线（图7A），对应于 [K+]o 约为 2.8 mM，该值接近 [K+]（所用人工脑脊液中的浓度为2.5 mM）。浴施加0.5 mM谷氨酸持续10秒可诱导[K+]o 约4 mM，随后出现低于基线的下冲，幅度约为0.7 mM（图7A）。将谷氨酸浓度降低至 0.4、0.3 和 0.2 mM 时，瞬时升高幅度及[K+]o (图7A).
<img alt="神经元离子电流图；K+ 动力学、电生理学、动作电位、APV、CNQX、TTX 阻断。" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 兴奋性活动引发的细胞外钾离子瞬变。 （A）[K+]o 瞬变，表现为先升高随后低于基线的下冲，由浴施加不同浓度谷氨酸持续 10 秒诱导，如图所示。（B）灌注谷氨酸受体阻断剂（CNQX，100 µM；APV，100 µM）和河豚毒素（TTX；0.5 µM）对浴施加 0.5 mM 谷氨酸 10 秒所诱导的 [K+]o 瞬变的影响。（C）在 0Mg2+/BIC 条件下的自发性 [K+]o 瞬变。A-C 中所示实验使用双管电极进行。为便于展示，曲线经 Savitzky-Golay 滤波器平滑处理（宽度为 20）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
早期实验表明，此类谷氨酸诱导的细胞外[K+]o信号在应用TTX期间未发生显著改变，因此在很大程度上不依赖于电压门控钠通道的开放及神经元动作电位的产生15,16。为了研究谷氨酸引起[K+]o变化的潜在机制，我们在存在TTX（0.5 µM）的情况下施加了谷氨酸受体阻断剂，即CNQX（100 µM；AMPA受体阻断剂）和APV（100 µM；NMDA受体阻断剂）。当通过灌流施加这些阻断剂后，谷氨酸诱导的[K+]o变化几乎完全被消除，证实了其依赖于离子型谷氨酸受体通道的开放，这与先前报道的结果一致（例如 17；图7B）。
为进一步证明谷氨酸能兴奋性活动在细胞外[K⁺]升高过程中的相关性+] 信号，切片用无镁人工脑脊液灌注2+不含盐水 10 µM 荷包牡丹碱甲碘化物（0Mg）2+/BIC)。这可解除电压依赖性的Mg2+阻断NMDA受体并通过阻断GABA减弱抑制作用A 受体，导致网络中出现自发性反复癫痫样活动（例如 18,19）。正如预期的那样 20，自发性，复发性 [K+]o 瞬变信号，约为 1.5 mM，在 0Mg 条件下被检测到2+/BIC 生理盐水（图7C）。在这些反应之间，较小的 [K+]o 瞬变信号的平均振幅约为 0.2 mM图7C).
在另一组实验中，我们使用对[Na+]敏感的微电极来测定谷氨酸激动剂引起的细胞外[Na+]o变化。在此，我们还比较了双管微电极和同心微电极在两种不同给药模式下的响应特性。将[Na+]敏感微电极置于stratum radiatum，深度约为50 µM。在获得稳定的基线后，通过浴槽灌流方式给予谷氨酸激动剂L-天冬氨酸（10 mM，120秒，灌流速度为2.5 ml/min）。如先前研究所示21，天冬氨酸的施加导致[Na+]o缓慢下降约15 mM，该效应持续约5分钟，随后开始恢复至基线水平（图8A）。值得注意的是，在这些条件下，两种电极测得的[Na+]o信号的峰值幅度和动力学特征几乎完全相同，但同心电极表现出更稳定的基线和更低的噪声水平（图8A）。
为了在更快速的应用模式下测试不同电极的响应特性，我们通过一根精细的玻璃移液管施加谷氨酸，该移液管置于距离离子选择性微电极尖端 20–40 µm 的 stratum radiatum 区域。正如预期21，施加谷氨酸（10 mM）持续 200 毫秒引起了细胞外钠离子浓度 [Na+]o 的下降（图 8B）。两种类型电极测得的 [Na+]o 下降峰值幅度范围相似（双管电极：4.5 – 13.5 mM，n=14；同心电极：2.0 – 19.1 mM，n=15）。然而，与缓慢浴灌注所得结果（见上文）不同的是，不仅信噪比存在差异，而且两种电极检测到的 [Na+]o 信号的时间进程也显著不同。双管微电极的平均达峰时间为 3.5 秒，而同心微电极仅为 1.3 秒。
因此，这些结果展示并证实了同心式钠电极相较于双管钠电极具有更快的响应动力学+选择性微电极，（参见 图6C和8B），这一点在Ca中也有同样观察结果2+ 以及pH选择性对应物 10与之前的研究不同，之前的研究采用短脉冲突触刺激以诱发快速的突触诱导离子瞬变，而在本研究的应用范式下，同心电极与双管电极在平均峰值幅度上仅表现出一种趋势，但无显著差异。这可能是由于给药移液管与离子选择性微电极尖端之间的距离变化达两倍（20–40 µm因此，不同实验中靶向区域的谷氨酸最大浓度并不相同，这阻碍了峰幅之间任何现有差异的显现。
（A）上图：双巴雷尔电极（黑色虚线）和同心电极（灰色实线）的参考巴雷尔电压（Vref）在浴液Na+浓度（[Na+]b）变化时的响应，如图所示。注意，两种电极的电压响应几乎完全相同。下图：双巴雷尔电极（黑色实线）和同心电极（灰色实线）的Na+电位电压（VNa+）在[Na+]b变化时的响应。（B）两种电极的[Na+]b与VNa+关系的半对数图。数据的线性拟合显示，两种电极的斜率均约为48 mV。（C）双巴雷尔电极（黑色实线）和同心电极（灰色实线）的VNa+在[Na+]b从152 mM快速降至70 mM时的响应。注意，同心电极的响应时间明显更快。为便于展示，图中曲线经Sawitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。
<img alt="显示电压和钠离子浓度变化的电生理学图谱，使用双管和同心电极检测。" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8：通过双管电极和同心电极检测到的细胞外钠瞬变。 （A）用 10 mM 天冬氨酸灌注浴液 120 秒（如条形所示）诱导的 Vref 和 [Na+]o 瞬时变化。上部曲线为使用双管电极记录的结果，下部曲线为使用同心电极记录的结果。（B）通过局部加压施加 10 mM 谷氨酸 0.2 秒（如箭头所示）诱导的 Vref 和 [Na+]o 瞬时变化。上部曲线为使用双管电极记录的结果，下部曲线为使用同心电极记录的结果。红色虚线表示从信号起始到其峰值期间的线性拟合。请注意，在此条件下，同心电极的响应时间显著更快。为便于说明，曲线经Sawitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。

大脑中的电活动伴随着跨膜的显著离子流动，从而导致细胞外环境发生复杂的改变……

本实验的总体目标是检测和分析脑组织细胞外空间中的离子动态。通过使用离子选择性微电极来实现离子瞬变的测量，这些微电极可根据双管或同心结构设计制备。第一步，需在实验浴液中对微电极进行校准。然后将电极插入急性小鼠海马脑片进行记录，以诱发细胞外离子移动，同时给予递质谷氨酸或谷氨酸激动剂。谷氨酸结合并打开突触后树突棘上的离子型受体，从而允许钠离子内流和钾离子外流。最终，细胞外钠离子浓度降低，同时细胞外钾离子浓度升高，这些变化可被离子选择性微电极检测到。该方法用于研究脑内细胞外离子调节以及由活动诱导的铁瞬变。本文介绍了两种离子选择性微电极的制备与校准方法，并展示了如何在急性脑组织切片中使用这些电极，以测量神经递质作用下细胞外钾离子或钠离子浓度的变化。该实验步骤将由 Nicole Hark 和 Simon 为我的实验室进行演示。开始此操作前，准备一根带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，用于离子敏感电极；另准备一根用于后续的参比电极。接下来，使用双组分胶水或一小条铝箔，将长、短毛细管的两端固定在一起。将双巴氏吸管置于炉中，在 60 摄氏度下加热一小时以去除残留水分。随后将电极存放在干燥器中直至使用。使用转轮粉笔将双巴氏吸管在垂直拉制仪中居中定位。使用粉笔以防止巴氏吸管过度拉伸。轻轻保持线圈，直至玻璃软化到足以使旋转器进行水平旋转。冷却后，将夹头旋转180度，移除机械断裂部分。应用第二次加热程序以拉制毛细管，得到两根尖锐的双通道毛细管。双巴氏吸管的尖端直径应接近一微米。现在用蒸馏水填充参考管直至其尖端，以防止污染。在接下来的操作中，将双巴氏吸管尖端朝上放置于定制的支架上。然后将此支架放入盛有预热六甲基二硅氮烷（HMDS）的广口瓶中，孵育70分钟。之后，将毛细管转移至金属支架上。随后，将其放入预热好的炉中干燥两小时，以在定植后干燥两个管腔，并将毛细管保持干燥状态，存放在干燥器中直至使用。在实验当天，通过在硅化套管的尖端加入两到三微升的离子选择性传感器来准备离子选择性电极。然后，对于钠敏感微电极，用100毫摩尔氯化钠溶液反向填充套管；对于钾敏感微电极，则用100毫摩尔氯化钾盐溶液反向填充。在此操作过程中需注意避免引入额外的气泡。如果灌注成功且传感器填充良好，传感器表面应呈现出相对于回填部分清晰可见的凹面。接下来，填充参比通道，然后将氯化银丝插入两个管腔中，并用牙科蜡密封每个管腔。在此步骤中，使用水平拉制仪将一段两毫米的毛细管拉制成短锥形，尖端直径为四微米。使用前立即用 0.2 微升传感器填充硅化毛细管。制备内毛细管时，拉制一根小直径毛细管，得到两根具有长锥形和尖锐尖端的毛细管，然后用 100 毫摩尔氯化钠或 100 毫摩尔氯化钾生理盐水填充。将装有传感器的毛细管和装有生理盐水的毛细管并排置于由盖玻片制成的定制塞子上。将较细的毛细管部分插入较粗的毛细管中。接着，将毛细管固定在另一张盖玻片上。使用建模黏土将毛细管转移至显微镜载物台上，并在100倍放大倍数下观察。借助安装在显微操作器上的玻璃棒，缓慢将外层毛细管向前推进，覆盖内层毛细管，直至两者尖端之间的距离约为五微米。使用牙科蜡将外层毛细管的开口端固定在内层毛细管上，并插入银丝。制备参比电极时，使用垂直拉制仪将带纤维的毛细管拉制，弃去上端的移液管，然后打开下端卡盘，将下端移液管向上提起约五毫米。再次关闭卡盘，并将其上提，使下端电极尖端位于加热线圈上方约五毫米处。随后加热线圈，并用镊子将尖端向一侧弯曲约45度。再次将其弯曲约负45度，使尖端回转至与主杆平行。然后用大量缓冲盐水填充参比电极管。将一根氯化银丝插入其中，并用牙科蜡密封管口。在此步骤中，将离子敏感电极和参比电极均连接至显微操作器，并将其浸入灌流人工脑脊液的实验腔室中。在体视显微镜下，将氯化银导线连接至差分放大器探头端的相应输入端口，随后测定电极电阻。然后，将电压信号调零并开始记录以进行校准。获得稳定的基线后，切换至含有待测离子特定浓度的生理盐水。现在，将一片250微米厚的海马脑片转移至实验记录室，并用网格固定。将校准的离子选择性微电极降至脑片表面，随后再将电极进一步下降约50微米，进入CA1区的辐射层。为施加神经递质激动剂，用0.5毫摩尔谷氨酸填充施加用移液管。将移液管连接至显微操作器，并与压力施加装置耦合。接着，将施加用移液管缓慢插入组织，并小心地将其置于离子选择性微电极尖端附近。启动压力施加，设定为 40 毫巴。图中显示了双管电极和同心电极的参比管在浴液钠离子浓度变化时电压的变化情况。同时，图中还展示了双管电极和同心电极的钠电位电压随浴液钠离子浓度变化的情况。该图显示了两种电极的钠电位电压与浴液钠离子浓度之间的半对数关系图。线性图显示，两种电极的斜率均约为48毫伏。此处为双管电极和同心电极对浴液中钠离子浓度从152毫摩尔快速变化至70毫摩尔时的响应情况。请注意，同心电极的响应时间明显更快。该图显示了双管电极和同心电极检测到的细胞外钠离子瞬变，以及参比管电压的瞬时变化。细胞外钠离子浓度的变化是通过灌流10毫摩尔的天冬氨酸持续120秒（如图中条形所示）所诱导的。而在该图中，参比管电压和细胞外钠离子浓度的瞬时变化则是通过局部加压施加10毫摩尔谷氨酸0.2秒所诱导的。请注意，在此条件下，锥形电极的响应时间显著加快。在尝试该操作时，必须牢记，适当的静置是成功制备铁选择性微电极的关键步骤。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备和使用这些电极，以检测脑组织中的细胞外铁瞬变。

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