Name: 代脉冲式低频超声定量分析，以确定未处理的声波的敏感性和治疗肿瘤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解低频脉冲超声联合甲基-β-环糊精处理人白血病细胞的实验方法。该技术通过XTT检测和自动细胞计数评估肿瘤细胞损伤程度，为开发新型声动力疗法提供临床前研究基础。

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作者谨向雪城大学物理系车间的工作人员致以诚挚感谢，感谢他们在本系统设计相关事宜中提供的创新性协助。

1. 清洁细胞破碎仪系统
<ol>
	<li>使用氯仿和棉签清洁喇叭头与变幅杆之间的连接处。在喇叭头和变幅杆的螺纹上涂抹少量润滑油或矿物油，以进一步清除金属碎屑、锈迹或氧化物的积聚。</li>
	<li>用油擦拭螺纹后，再使用氯仿清除连接处的油渍及其他任何污染物。</li>
</ol>
2. 重新组装细胞声化仪并设置系统&#160;
<ol>
	<li>将探头重新连接至换能器。为正确施加扭矩，先从杯组件中取出已组装的换能器和探头，方法是将探头从杯底部拉出（图2A）。将一个槽口扳手插入换能器顶部附近的三个小孔之一（图2B）。然后，将装有½英寸开口扳手头的扭矩扳手对准探头的槽口部分（图2B）。按标准顺时针方向拧紧，直至扭矩计读数达到制造商推荐的54.23 N.m（图2C）16。将拧紧后的换能器和探头重新装入杯中，并将探头和换能器垂直固定在铁架台上。在设置系统进行实验脉冲给能前，重新连接换能器与电源。</li>
	<li>设置系统以实现脉冲给能，超声1秒，脉冲间隔1秒。其他实验条件可采用不同的给能模式。许多变量，如水体积和探头直径，可能需要调整该给能参数。针对上述细胞样本类型、体积和浓度，通过经验数据和观察确定了本给能方案。</li>
	<li>调节系统至所需振幅。本实验方案中采用33%和50%的振幅，以避免细胞完全破坏，否则将难以或无法评估声敏剂的效应。 
	注意：本研究中对不同振幅进行了比较。</li>
</ol>
3. 评估系统强度与功能&#160;
<ol>
	<li>将空化仪保持在1.5 cm处，即样品超声处理的水平位置。记录读数以评估系统是否在预期强度下运行。使用当前系统和水位时，33%振幅下预期读数为100–110 W/cm2，50%振幅下为115–125 W/cm2。从空化仪显示屏上记录代表空化能量（单位：W/cm2）的读数。应在水面处进行测量，并确保探头表面无气泡存在。 
	注意：需特别指出，这些操作需在未加盖状态下进行，以便接触探头上方空间。每次超声处理后无需重复此步骤，仅在清洁、重新组装和设置系统后执行即可。</li>
	<li>将水听器置于含有12.5 ml水的样品管中，以完全浸没水听器传感器。使用铁架台固定并悬置水听器。</li>
	<li>将水听器连接至示波器输入端，以评估波形特征。观察示波器上是否呈现清晰的正弦波，异常波形可能导致系统频率偏离制造商的技术规格。空化仪和示波器均可提供频率读数，但只有示波器能够显示异常波形，从而提示系统故障或组装不当。</li>
</ol>
4. 细胞与培养基的制备
<ol>
	<li>使用240 ml Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）和50 ml胎牛血清配制培养基。切勿在热水浴中融化胎牛血清，因为温度快速升高可能导致血清稳定性下降。在标准细胞培养瓶中加入240 µl庆大霉素（50 mg/ml）和5 ml青霉素/链霉素（100×），然后加入培养基中。将培养基在4 °C下保存。</li>
	<li>将U937细胞以约4 x 10⁵个/孔接种于4 细胞/毫升，在 25 cm² 培养瓶中2 使用预热的培养基将细胞接种至培养瓶中。采用TC20细胞计数仪和台盼蓝染色法检测细胞浓度和活率：取15–20 µl细胞悬液与15–20 µl台盼蓝加入微量离心管中，混匀。吸取15–20 µl混合液加入TC20计数载片，将载片插入TC20细胞计数仪中开始计数。</li>
	<li>在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞2，使用台盼蓝排斥法和TC20细胞计数仪检测细胞活力。当细胞达到适当浓度和/或经声敏剂处理适当时间后，将3 ml细胞从培养瓶转移至20 ml玻璃闪烁瓶中。本方案中，将U937细胞培养48小时，然后进行处理&#160;用0.5、1或5 mM MeβCD处理30分钟，以在超声处理前充分耗尽细胞中的胆固醇。</li>
</ol>
5. 细胞超声处理
<ol>
	<li>使用真空泵和布氏漏斗对去离子蒸馏水进行脱气处理。将脱气后的水转移至杯状探头中，加水至液面高于探头顶端15 mm。超声处理过程会使水进一步脱气，持续数分钟；如果在样品超声处理前未预先运行系统，可能导致实验过程中结果不一致。因此，在样品超声处理前应先运行系统约7分钟。</li>
	<li>将含有细胞的闪烁瓶固定在夹持装置上，然后将夹持装置安装到杯状探头顶部，并通过滑动机构调节至距离探头顶端（即水面位置）15 mm的高度。</li>
	<li>通常采用三次超声脉冲处理细胞，每次脉冲持续1秒，脉冲之间间隔1秒。在本实验方案中，使用上述脉冲剂量模式，分别在33%和50%振幅条件下对细胞进行超声处理。</li>
</ol>
6. 评估细胞在超声处理后的损伤情况
<ol>
	<li>使用台盼蓝和TC20细胞计数仪评估悬浮细胞的损伤情况和存活率。此外，使用Z2计数器分析样品。对于Z2计数器分析，将100 µl细胞悬液加入20 ml等渗盐水中（200:1比例）。分析前，使用等渗盐水至少冲洗Z2颗粒分析仪的孔径两次。将Z2样品放入计数器样品架中，并在开始计数前将平台升至孔径位置。</li>
	<li>使用制造商提供的软件从TC20和Z2计数器获取数据。分析这些数据以评估细胞损伤、存活率以及超声处理产生的细胞碎片情况。</li>
</ol>
7. XTT 法测定经处理的 U937 和 THP1 细胞的细胞活力和线粒体活性
<ol>
	<li>在进行XTT实验之前，将U937和THP1细胞在相同条件下培养。在超声处理前，用相同浓度范围的MeβCD预处理细胞30分钟。除超声参数外，其余步骤与之前一致；细胞现采用1-3次、每次1秒、间隔1秒的脉冲进行超声处理，以产生不同程度的损伤，供XTT试剂盒评估。 
	注意：许多步骤直接取自XTT试剂盒说明书，仅为方便感兴趣的实验室而重复列出。</li>
	<li>以200 × g离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于前述生长培养基中，调整细胞密度至约1 × 105 个细胞/ml。每孔加入100 µl细胞悬液，将U937细胞以每孔100 µl接种至平底96孔微孔板中，每组设三个复孔，然后使用另一块96孔板对THP1细胞重复相同操作。设置3个对照孔，每孔仅含100 µl完全生长培养基，用于作为空白吸光度读数。将接种后的微孔板置于培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>使用前，将两份XTT试剂和活化试剂在37 °C解冻。轻轻摇动至溶液澄清。向5.0 ml XTT试剂中加入0.1 ml活化试剂，配制成足够用于一块96孔微孔板检测的活化XTT溶液。对另一块板重复相同配制过程。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µl活化后的XTT溶液。将微孔板放回细胞培养用CO2孵箱中孵育2小时。孵育结束后轻轻振荡微孔板，使阳性孔中的橙色均匀分布。使用微孔板读数仪在450-500 nm波长下测定含细胞的检测孔及空白对照孔的吸光度。</li>
	<li>可选择使用空白对照孔将微孔板读数仪调零，或从各检测结果中减去其平均值。再次在630-690 nm波长下测定所有检测孔的吸光度，并从450-500 nm测得的数值中减去该波长下的读数。注意：第二次吸光度测定有助于消除实验结果中的非特异性信号。XTT实验对两种细胞系均重复进行了四次。</li>
</ol>

<ol><li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The promise of sonodynamic therapy.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).</li>
<li>Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shock+wave+rate+on+the+outcome+of+shock+wave+lithotripsy%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis.</a> J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).</li>
<li>Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+Wave+Lithotripsy+at+60+or+120+shocks+per+minute%3A+A+randomized%2C+double-blind+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial.</a> J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).</li>
<li>McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+shock+wave+lithotripsy%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review.</a> Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).</li>
<li>Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+sound%3A+the+use+of+ultrasound+in+drug+delivery+and+other+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).</li>
<li>Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+definitive+treatment+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer.</a> BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).</li>
<li>Li, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+treatment+for+patients+with+unresectable+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Pancreat+Dis+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).</li>
<li>Xiaoping, L., Leizhen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+high+intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hyperthermia%22%5BJournal%5D)">Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer.</a> Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).</li>
<li>Lukka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+for+prostate+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oncol+%28R+Coll+Radiol%29%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review.</a> Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).</li>
<li>So, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIFU+ablation+is+not+a+proven+standard+treatment+for+localized+prostate+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Urol+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer).</a> Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).</li>
<li>Crouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-gland+ablation+of+localized+prostate+cancer+with+high-intensity+focused+ultrasound%3A+oncologic+outcomes+and+morbidity+in+1002+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients.</a> Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).</li>
<li>Tezel, A., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+inertial+cavitation+bubbles+with+stratum+corneum+lipid+bilayers+during+low-frequency+sonophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis.</a> Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).</li>
<li>Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+role+of+cavitation+in+low-frequency+ultrasound-mediated+transdermal+drug+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport.</a> Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).</li>
<li>Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cavitation+as+an+enhancing+mechanism+of+low-frequency+sonophoresis+for+transdermal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery.</a> Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).</li>
<li>Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real+deal%3A+Using+cytochalasin+B+in+sonodynamic+therapy+to+preferentially+damage+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells.</a> Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).</li>
<li>Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf">http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf</a> (2010).</li>
<li>Lagneaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+low-energy+treatment%3A+A+novel+approach+to+induce+apoptosis+in+human+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells.</a> Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).</li>
<li>Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+cavitation+as+a+unifying+mechanism+for+ultrasound-induced+bioeffects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).</li>
<li>Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+ultrasound-induced+permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes.</a> Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).</li>
<li>Mizrahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+ultrasound+perturbs+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics.</a> Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).</li>
<li>Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-site+sonoporation+disrupts+actin+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization.</a> J R Soc Interface. 11 (95), 20140071(2014).</li>
<li>Trendowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+enlargement+of+leukemia+cells+using+cytoskeletal-directed+agents+and+cell+cycle+growth+control+parameters+to+induce+sensitivity+to+low+frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound.</a> Cancer Lett. In press, (2015).</li>
<li>Dumontet, C., Sikic, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+and+resistance+to+antitubulin+agents%3A+Microtubule+dynamics%2C+drug+transport%2C+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death.</a> J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).</li>
<li>Verrills, N. M., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+targeting+of+tubulin-binding+agents%3A+lessons+from+drug+resistance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies.</a> Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).</li>
<li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inherent+metastasis+of+leukaemia+and+its+exploitation+by+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy.</a> Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).</li>
<li>Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerated+doses+in+zebrafish+of+cytochalasins+and+jasplakinolide+for+comparison+with+tolerated+doses+in+mice+in+the+evaluation+of+pre-clinical+activity+of+microfilament-directed+agents+in+tumor+model+systems+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo.</a> In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了获得最佳结果，应特别注意准确定位样品并清洁转换器与探头的连接处。样品在探头中的位置对于实现一致的细胞破碎至关重要，因为样品与探头之间的距离变化会改变声学焦点，从而改变样品所受的声能。可使用空化测量仪对杯式探头内的声能进行 Mapping，以确定空化作用最强的位置。此外，空化测量仪与示波器对于确定细胞所受的声强以及波形的均匀性也至关重要。因此，应利用这些仪器检测系统存在的问题，并帮助判断为纠正系统不稳定性所需采取的故障排查措施。
如前所述，如果在样品超声处理前未预先运行数分钟，低频系统可能会在实验过程中进一步去除水中的气体。必须进行初始运行，以获得相对脱气的超声介质，从而确保实验结果的一致性。此外，在评估声敏剂效果时，不应以最大振幅或接近最大振幅的条件对细胞进行超声处理，因为这将难以准确评估真正的增敏程度。在40 kHz系统上使用33%的振幅是一个理想设置，该条件可产生明显的损伤，同时为声敏剂充分展示其效应留出空间，这一点已在MeβCD对U937和THP1细胞的作用中得到证实（图7）。这些数据还证实，MeβCD能够以剂量依赖的方式使多种白血病细胞系对低频超声产生敏感化。
已有大量实验在0.75 MHz至8 MHz的较高频率范围内进行，结果表明通过超声处理可产生膜内空化气泡17-19然而，关于超声诱导细胞裂解的确切机制，仍存在一些尚未解决的问题18我们已证明，通过低频超声使细胞骨架液化与声敏感性增强之间存在关联15，这一现象已被其他实验室证实20, 21此外，我们发现微丝破坏剂（如细胞松弛素B）可增强多种白血病细胞系对超声的敏感性，但对人造血干细胞（hHSCs）或白细胞无此作用。22，表明抑制肌动蛋白聚合可能是特别值得关注的一种声敏化机制。我们还观察到，长春新碱是一种微管破坏剂，可抑制微管蛋白聚合23, 24显著提高了不同类型白血病的超声敏感性 体外 包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病。相比之下，作用于细胞骨架并稳定其组分的药物（如紫杉醇和 Jasplakinolide）似乎使细胞对超声处理产生抗性，表现为细胞裂解率降低22综上所述，这些数据支持了以下假设：使肿瘤细胞的细胞骨架组分发生液化确实是提高声动力疗法（SDT）疗效的重要因素25本研究还表明，胆固醇耗竭可能是进一步增强肿瘤细胞超声敏感性的另一种方法，因为经 MeβCD 处理的 U937 细胞对 40 kHz 超声的敏感性显著提高。
尽管我们的超声处理方案已显示出显著的抗肿瘤活性 体外目前，该方法仅限于在培养物和能够放入用于超声处理小瓶中的小型脊椎动物模型中应用。我们已证明，斑马鱼可安全地接受脉冲式低频超声（20 kHz）处理，且其对化疗药物的耐受剂量在定量上与小鼠模型耐受的剂量相当26，表明荷瘤斑马鱼可用于初步研究，以评估 体内 这些方案的抗肿瘤活性。然而，已有报道在兆赫兹（MHz）范围内，于哺乳动物模型超声处理前给予化疗药物1并且此类方案很可能可扩展应用于低频超声以及耗竭胆固醇和靶向细胞骨架的试剂。
这种SDT的潜在临床应用可能包括体外血液超声处理，即在血液被抽出进行超声处理之前，先通过静脉（i.v.）给予抗肿瘤药物25。该方法可消除人体解剖结构可能带来的声学屏障，可能是损伤白血病原始细胞以及实体瘤转移灶的有效手段。此外，耗竭胆固醇的药物和靶向细胞骨架的药物也可能被用于已在临床研究中的高强度聚焦超声（HIFU）治疗方案，以期提高该治疗方式的疗效。
本研究中所述方法能够评估潜在声敏剂的价值，进一步的系统优化可能提升其应用价值。然而，使用此类超声设备时需考虑诸多变量，包括电源质量、声学焦点以及换能器之间的个体差异。因此，未来的研究将聚焦于声波的可视化及其对结果影响的理解。声动力疗法已被证明可增强细胞裂解 体外 并且如果进一步研究，可能在临床上具有可行性 体内 在哺乳动物模型中获取的数据。我们实验室仍在继续开展研究恶性细胞其他潜在可利用特征的实验，以及涉及多种药物联合超声的多种联合治疗模式的研究。

超声是指频率超过人类听觉能力上限（约 20 kHz）的任何振荡声压波1。频率在 20–60 kHz 范围内的低频超声已在实验室中被用于生成乳剂、制备用于核酸提取的细胞样品、组织破碎以及多种其他实验。低频超声的应用也已扩展至工业领域，用于焊接、清洗各种材料以及材料加工。市面上可购得的超声发生器频率范围为 18–60 kHz，全功率范围为 100–1,200 W。
尽管超声技术长期以来已用于临床诊断成像，但其作为治疗手段的应用则是近年来才发展起来的。频率≥1 MHz的超声能够安全地破坏患者的尿路结石（肾结石）和胆道结石（胆囊或肝脏中的结石），从而减轻症状2,3。这种被称为体外冲击波碎石术（ESWL）的方法目前在临床上已广泛应用（仅在美国每年就有超过一百万名患者接受ESWL治疗4），它通过体外施加聚焦的高强度声脉冲，以微创方式粉碎结石，同时最大限度减少对周围组织的损伤2-4。
由于高强度超声产生的独特直接剪切力以及空化气泡，这些方法已在癌症治疗中被用于治疗去势抵抗性前列腺癌和胰腺腺癌，该技术被称为高强度聚焦超声（HIFU）5-8。与体外冲击波碎石术（ESWL）非常相似，HIFU利用多束超声波将其聚焦于选定的焦点区域，通过声能作用使局部温度达到60 °C或更高，从而在靶向组织中诱导凝固性坏死5。尽管目前已有其他热消融方式（如射频消融和微波消融），但HIFU相较于这些方法具有独特优势，即它是唯一一种非侵入性的热疗方式5。HIFU在临床应用中效果参差不齐，目前仅限于临床试验中使用8-11。然而，其所取得的有限成功以及从临床前哺乳动物模型获得的极具前景的体内数据，已充分展示了超声在癌症治疗中的潜力。
为了改进高强度聚焦超声（HIFU），研究人员尝试将超声与适当的抗肿瘤药物结合，以开发一种声化学治疗形式。声动力治疗（SDT）是一种具有前景的新型治疗方式，在体内外均表现出显著的抗肿瘤活性。 体外 和 体内研究1已发现超声波会基于恶性细胞与正常组织细胞之间的尺寸差异，优先损伤恶性细胞。1,5SDT 采用一类称为声敏剂的特异性试剂，以增强超声对肿瘤细胞的选择性损伤作用。尽管此前已对 SDT 的治疗应用进行了研究，但所用超声系统通常采用较高频率的超声（≥1 MHz），而低千赫兹（kHz）频率超声的作用尚未得到充分探索。较低频率的超声通常更易于产生惯性空化效应，这种现象因微泡的快速塌陷而导致细胞破坏，引发物理化学性损伤12-14MHz 和低 kHz 超声在产生惯性空化方面的这种差异，归因于较低的波频率使微泡在膨胀半周期内通过整流扩散有更充足的时间生长，从而在随后的压缩半周期中产生更剧烈的崩溃。12.
我们此前已证实，U937 人单核细胞白血病细胞对低频超声（23.5 kHz）具有敏感性，且通过使用干扰细胞骨架的抗肿瘤药物可显著增强这种敏感性15。此外，我们还证明，细胞的损伤程度与其大小密切相关，较大的细胞表现出更高的超声敏感性。另外，在相同细胞大小条件下，正常人造血干细胞（hHSCs）和白细胞对超声处理的耐受性明显高于其肿瘤对应细胞15，初步提示低频超声可能在保留正常组织的同时优先损伤恶性细胞。
为了进一步研究低频超声在潜在治疗应用中的独特性质，我们开发了清洗和稳定化操作流程，以提高当前所用超声系统之一——Branson SLPe 150 W、40 kHz 细胞破碎仪（配备插入7.62 cm杯中的20 mm声 horn）的功效和可靠性。此外，我们利用空化仪和配备水听器的示波器，在40 kHz范围内精确测定了样品的空化能量以及一致的波形和振幅。通过优化和系统化我们的实验方案，我们实现了超声处理实验的一致性，从而能够对不同组织发生来源的肿瘤细胞与正常细胞的超声敏感性进行定量比较。本文详细介绍了40 kHz系统的操作方案，以便感兴趣的实验室能够开展可比性实验，并评估我们关于低频超声诱导抗肿瘤效应的研究结果。此外，我们还研究了胆固醇耗竭剂甲基-β-环糊精（MeβCD；图1）在提高人单核白血病U937和THP1细胞超声敏感性方面的剂量依赖性效应。

<table><tbody><tr><td>含碳酸氢钠的伊氏改良杜尔贝科培养基 &amp;amp; 25 mM Hepes&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100 倍溶液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12105</td><td></td></tr><tr><td>Branson SLPe 40kHz 细胞破碎仪，配备 3&quot; （25毫米）杯状角</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>101-063-726</td><td>超声处理装置</td></tr><tr><td>快速加热 SDC 台式数字温度控制器配 1000 ml 烧杯加热器</td><td>快速加热</td><td>SDCJF1A-GBH1000-1</td><td>用于温度控制的加热器</td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Z2 细胞计数器配 AccuComp&amp;reg; 软件</td><td>贝克曼库尔特</td><td>6605700</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20 自动细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 50 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml &amp;和 25 ml 透气培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Lonza L-谷氨酰胺 200 mM 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-605C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 ml 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml 小瓶及瓶盖</td><td>Beckman-Coulter</td><td>&amp;nbsp;A35473</td><td></td></tr><tr><td>AccuJet Pro 自动移液器&amp;nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26330</td><td></td></tr><tr><td>USA Scientific 10 ml 一次性血清移液管</td><td>USA Scientific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>技巧一 100 &amp;#956;l 和 1,000 &amp;#956;滤芯吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840, 1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#956;微量移液器&amp;nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>851164</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;微量移液器</td><td>Wheaton</td><td>851168</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 双室计数板</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>145-0015</td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific 双室水套式培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td>3131</td><td></td></tr><tr><td>Tektronix&amp;nbsp; DPO 2002B 数字荧光示波器</td><td>Tektronix</td><td>DPO2002B</td><td>用于测量超声波波形</td></tr><tr><td>PPB MegaSonics PB-500 型超声能量计</td><td>PPB Megasonics</td><td>PB-500&amp;nbsp;</td><td>用于评估 W/cm 中的声强&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Teledyne RESON TC4013-1 水听器</td><td>Teledyne</td><td>TC4013-1&amp;nbsp;</td><td>连接至示波器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wheaton 250 ml 锥形瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z364827</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 玻璃闪烁瓶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>贝克曼库尔特等渗盐溶液&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>N/A</td><td>Z2计数仪稀释液</td></tr><tr><td>氯仿 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇 200 证明&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XTT细胞增殖检测试剂盒</td><td>ATCC</td><td>30-1011K</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板读板仪</td><td>科尔-帕尔默</td><td>&amp;nbsp;EW-13055-54</td><td></td></tr><tr><td>U937 人单核细胞白血病细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL&amp;shy;1593.2</td><td></td></tr><tr><td>THP1 人单核细胞白血病细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

产生与定量分析脉冲低频超声以确定未处理及经处理肿瘤细胞的声敏感性

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

20 至 60 kHz 范围内的低频超声是一种新型物理手段，可用于诱导肿瘤细胞的选择性裂解和死亡。此外，该方法还可与称为声敏剂的特殊试剂联合使用，以增强超声对肿瘤细胞的优先损伤作用，这种方法被称为声动力疗法（SDT）。本文介绍了在临床前体外（in vitro）条件下产生和应用低频超声的方法，以证明可实现可重复的细胞破坏，从而研究和比较超声处理对肿瘤细胞和正常细胞的影响。这为在临床前治疗评估所要求的一致性水平上可靠地对肿瘤细胞进行超声处理提供了途径。此外，还讨论了胆固醇耗竭剂和细胞骨架靶向试剂在增强肿瘤细胞超声敏感性方面的作用，以进一步阐明有利于声化学治疗策略的作用机制。

系统稳定性对于获得可重复且可靠的结果至关重要。通过施加54.23 N.m的正确扭矩，可实现换能器与声波导之间的良好耦合2，并通过示波器和水听器评估波形的一致性（图3A）。图3B展示了样品瓶内部的测量结果，图3C则评估了杯型喇叭内部的稳定性。如预期所示，由于部分能量被玻璃吸收，振幅略有降低。然而，在图B和图C中，波形均未出现扰动或畸变，这是向样品可靠传递声能所必需的条件。若波形未呈现清晰的单一正弦波，则表明换能器存在故障或设置不当。这一点在图3D中有所体现，该图显示了多个异常波形，明显缺乏正弦波特征，且频率读数不符合正常工作系统的预期。用于测量所产生的空化能量的空化计（图4）测得，在33%振幅下声强为100–110 W/cm2，在50%振幅下为125–130 W/cm2。
在40 kHz系统经过适当校准并完全组装后（图5），通过TC20和Z2细胞计数仪均证实可稳定实现细胞破坏（图6）。正如预期，与33%振幅处理相比，在50%振幅下进行超声处理的细胞群体表现出更显著的细胞损伤。然而，33%振幅仍可作为起始条件用于检测所施加试剂是否具有增强超声敏感性的效应，因为该参数可产生可观察到的损伤，同时为后续检测试剂增强超声敏感性时可能出现的进一步损伤留出检测空间。这一点在图7A中得到展示，该图呈现了MeβCD在增强U937细胞超声敏感性方面的剂量依赖性效应。尽管未经超声处理的MeβCD处理组细胞活力与未经超声处理的未处理组细胞相近，但在施加三次每次1秒的40 kHz超声脉冲后，细胞活力显著下降。此外，超声处理后的细胞活力下降呈剂量依赖性，其中5 mM MeβCD导致细胞数量下降最显著，其次是1 mM，然后是0.5 mM MeβCD。
使用XTT试剂盒评估发现，在超声处理前用不同浓度的甲基-β-环糊精（MeβCD）处理的U937和THP1细胞中，细胞活力和线粒体活性均表现出相似的变化（图7B）。尽管THP1细胞似乎比U937细胞对超声稍具抗性，但这两种人白血病细胞系均呈剂量依赖性地受到损伤。对于U937和THP1细胞而言，较高的MeβCD浓度和更多的超声脉冲次数均使其XTT还原为可溶性亮橙色产物的程度降至最低，表明细胞活力和线粒体活性降低。
<img alt="环糊精结构示意图；化学环，糖苷键；分子式。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 甲基-β-环糊精的分子结构。（A）甲基-β-环糊精（MeβCD）的完整结构。（B）MeβCD是由七个重复单元组成的聚合物，其R基团为H或CH3。分子式：C56H98O35。分子量 = 1331.36。
<img alt="扭矩测量装置；扭矩扳手，槽口扳手；机械装配示意图。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 正确对 40 kHz 超声波系统施加扭矩。（A）在施加扭矩前，将变幅杆和换能器从杯体上拆下。（B）将槽口扳手和扭矩扳手分别放置在相应位置。（C）顺时针方向施加 54.23 N.m 的扭矩，然后重新将变幅杆和换能器安装到杯体上。
<img alt="示波器显示波形分析；电子信号处理；显示波形图的图表。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 使用示波器表征超声系统的波形。（A）可使用带有水听器的示波器评估振幅和波形的一致性。（B）在喇叭正上方1.5 cm处、振幅设置为33%时采集的记录。（C）此处所示波形来自将水听器置于20 ml玻璃闪烁小瓶内时获得的读数。小瓶位于喇叭上方1.5 cm处，振幅同样设置为33%。（D）存在异常频率的系统示波器截图，此类情况可能由系统故障或喇叭与换能器连接处耦合不当引起。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="能量计 UEM-001-ITI 与测量探头、用于电学研究的数据记录设置。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 使用空化计量仪表征超声系统的声强。 此处所示的空化计量仪用于表示以 W/cm2 为单位的空化能量。该仪器对于评估样品所受能量的一致性至关重要。
<img alt="带水平指示器的静力平衡装置；流体力学实验设备。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 40 kHz 超声系统的关键组件。 超声系统包括杯形变幅杆（A）、加热装置（B）、换能器（C）和样品定位机构（D）。该设计可方便地将样品（E）置于变幅杆（F）上方进行定位。
<img alt="超声处理下的细胞活力与计数；图表显示未超声处理与不同振幅效应的比较。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 使用TC20和Z2细胞计数仪检测不同振幅水平对U937细胞超声裂解的影响。采用40 kHz细胞破碎仪对细胞进行超声处理，分别使用33%振幅（100–110 W/cm2）和50%振幅（125–130 W/cm2），每次超声脉冲持续1秒，脉冲之间间隔1秒，共进行三次脉冲处理。(A) Z2细胞计数仪软件的截图展示了超声处理对U937细胞的影响。(B) 来自TC20细胞计数仪的数据被绘制成图表，以展示结果的可重复性。这些数据包括总细胞数、活细胞数以及台盼蓝染色评估的细胞活力。柱状图表示4个独立细胞群体的平均值标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="超声对细胞大小的影响；柱状图和折线图；MeBCD处理；吸光度分析；40 kHz。" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 甲基-β-环糊精对增强U937和THP1细胞超声敏感性的影响。（A）U937细胞在超声处理前，先用不同浓度的MeβCD处理30分钟，随后使用40 kHz超声（105 W/cm2）进行辐照，每次1秒脉冲，共3次，每次间隔1秒。细胞群体按直径≥12 µm和≥17 µm进行分组。（B）U937或THP1细胞再次经不同浓度MeβCD处理30分钟后，使用40 kHz超声系统进行1至3次、每次1秒的脉冲处理，脉冲间隔1秒。采用XTT试剂盒检测细胞活力和线粒体活性。每孔接种100 µl细胞至平底96孔微孔板中。加XTT溶液前，将细胞培养板孵育24小时，随后再孵育2小时，然后读取波长。柱状图表示4次独立细胞群体的均值标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

通过一种新颖的方法，即在有或无化疗药物预处理白血病细胞和正常造血细胞的情况下应用低频超声，可实现对人类白血病细胞的选择性损伤。

20 至 60 kHz 范围内的低频超声是一种新型物理手段，可用于诱导肿瘤细胞的选择性裂解与死亡。在……

以下实验的总体目标是评估脉冲式低频超声在有或无胆固醇耗竭剂存在条件下对人白血病细胞群体造成损伤的效果及可重复性。该目标通过清洗超声系统并评估其稳定性来实现。随后，人白血病细胞在有或无甲基-β-环糊精的条件下接受超声处理。接下来使用自动细胞计数器评估细胞活力以及超声处理和胆固醇耗竭的影响。通过XTT法检测白血病细胞的线粒体活性。最终数据表明，低频超声可用于损伤恶性细胞，而胆固醇耗竭剂的使用可增强这一效应。我们的实验室致力于研究声纳纳米疗法（sonar namp therapy），这是一种新型治疗模式，结合了超声波的抗肿瘤效应与特异性试剂，以增强声波的治疗效果。本方案旨在评估肿瘤细胞和正常细胞对声波的敏感性，从而确定值得进一步开展临床前研究的潜在化疗策略。通常，初次接触该方法的研究人员可能在使用相关设备评估声学系统稳定性方面存在困难，因为掌握这些设备的最佳操作方法需要一定学习时间。该方法的可视化演示至关重要，因为用于评估超声系统的清洗和稳定步骤对于获得可重复的结果必不可少。在开始实验之前，使用氯仿和棉签清洁探头与换能器之间的连接处。接着，在探头和换能器的螺纹上涂抹少量润滑油。为了进一步去除任何金属碎屑、锈迹或氧化物积聚，随后用更多氯仿清洗接头以去除油污及其他污染物，并将探头重新连接到换能器上。为正确施加扭矩，先将探头从杯底拉出，并将槽口扳手插入换能器顶部附近三个小孔中的任意一个。然后，将装有½英寸弯头的扭矩扳手卡在探头的槽口部位，沿标准顺时针方向拧紧，直至扭矩表读数为39.99英尺·磅。拧紧后，将换能器和喇叭重新装入杯中，并将组件垂直固定在环形支架上，重新将换能器连接至电源，然后将系统设置为脉冲给能模式。采用每秒超声处理1秒，间隔1秒的脉冲模式，随后调节系统至所需振幅，以评估桑拿Fire系统的强度与功能。开始时，将空化仪探头置于距声源1.5厘米处，注意确保探头表面无气泡存在。读取空化仪屏幕，确认系统正在适当的强度下运行。接着，将水听器传感器完全浸入含有 12.5 毫升水的样品瓶中，并使用环形支架将水听器悬挂固定。为确认波形特征的稳定性，将水听器连接至示波器输入端，观察是否存在清晰的正弦波，因为异常波形可能改变系统的频率。为超声处理准备细胞时，首先将细胞以每毫升4 × 10⁴个细胞的密度接种于25 cm²培养瓶中，使用新鲜配制的培养基。通过台盼蓝排斥法测定活细胞数量后，将细胞培养物置于37°C、5% CO₂条件下培养，直至达到所需浓度。当细胞准备就绪进行超声处理时，使用真空泵和抽滤瓶对一定体积的去离子蒸馏水进行脱气。然后用水将杯状喇叭口填充至喇叭口顶部以上15毫米处。用脱气水运行系统约七分钟。随后将三毫升细胞转移至一个20毫升的玻璃闪烁小瓶中，并将该小瓶连接到固定装置上。接下来，将固定装置连接到杯状变幅杆的顶部，并利用滑动机构将固定装置调节至距离变幅杆顶部水面15毫米的高度。随后，以33%和50%的振幅，对细胞进行三次超声处理，每次持续1秒，脉冲间隔1秒。超声处理后，通过台盼蓝排斥法评估细胞活力。为评估细胞损伤情况，使用等渗盐水至少冲洗Z2颗粒分析仪的测量孔两次。接着，将100 µL超声处理后的细胞加入20 mL等渗盐水中，并将细胞样品转移至计数池支架。然后将平台升至孔径处，根据制造商说明书分析细胞损伤、活力及碎片情况。为通过XTT法评估超声处理后细胞的活力，使用1至3个梯度对细胞进行超声处理。间隔一秒钟施加一次一秒脉冲，以产生不同程度的损伤，供XTT试剂盒评估；随后离心细胞，将沉淀重悬于新鲜配制的生长培养基中，浓度为每毫升1 × 10⁵个细胞。接下来，每孔接种100 µL细胞至平底96孔微孔板中，每个样本设三个复孔，并设置三个对照孔，每孔加入100 µL完全生长培养基用于空白吸光度测定。在检测当天上午，将细胞孵育24小时，轻轻摇晃已预热至37摄氏度的XTT试剂和活化试剂等分试样，直至溶液澄清。然后，向5毫升Eloqua瓶中的XTT试剂中加入0.1毫升活化试剂。接着，向每孔U937和THP-1接种的培养板中加入50微升活化的XTT溶液，并将细胞放回细胞培养孵箱中。两小时后，轻轻振荡培养板，使阳性孔中的橙色染料均匀分布，并在酶标仪上测量450至500纳米波长范围内的吸光度。最后，再次测量所有检测孔在630至690纳米波长范围内的吸光度。与33%振幅处理的细胞群体相比，50%振幅超声处理的细胞群体显示出更严重的细胞损伤。然而，当施加试剂时，33%的振幅能够检测到进一步的损伤。例如本实验中评估了胆固醇耗竭剂甲基-β-环糊精对U 937细胞超声敏感性的增强作用及其剂量依赖性效应。尽管经甲基-β-环糊精处理的细胞与未经处理的对照细胞在活力上相似，但在施加三脉冲、每秒一次、40千赫兹超声后，细胞活力显著下降。此外，超声处理后的活力降低呈剂量依赖性，XTT检测结果显示：胆固醇清除剂浓度为5毫摩尔时，细胞数量下降最为明显，其次为1毫摩尔和0.5毫摩尔的甲基-β-环糊精处理组。尽管THP-1细胞对超声的耐受性略高于U937细胞，但这两种人白血病细胞系均表现出剂量依赖性的损伤。此外，较高浓度的甲基-β-环糊精与更多超声脉冲的联用，使U937和THP-1细胞中XTT还原为可溶性亮橙色衍生物的程度降至最低，表明两种细胞系的细胞活力和线粒体活性均较低。通过该方法，可进一步评估其他声敏化剂（如作用于细胞骨架或产生活性物质的试剂）对声敏感性的增强作用，从而建立新的治疗策略，并进一步研究其潜在的临床疗效。在实施该操作时，需注意妥善整理TC和Z2计数器获取的声学数据，因为这些数据提供了有关治疗方案有效性的详细信息，若处理不当可能丢失。如果不使用任何物流方案，在观看本视频后，您应能充分理解如何在临床前体外模型中结合潜在的增敏剂使用低频超声，以评估其潜在的治疗效用。

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医学

代脉冲式低频超声定量分析，以确定未处理的声波的敏感性和治疗肿瘤细胞

微泡的超声辐照是一种有前景的策略，可在降低的时间平均声功率下实现肿瘤消融，并实现治疗药物的靶向递送。本研究的目的是开发低占空比的超声脉冲策略和纳米载体，以最大程度地实现非热性微血管消融，并将载药递送至皮下C6胶质瘤。...

通过载药纳米颗粒递送与微血管消融实现小鼠胶质瘤的超声造影靶向治疗

本方案描述了使用低强度脉冲超声刺激培养的成纤维细胞，通过模拟跨膜基质受体syndecan-4的激活，诱导黏着斑的形成和Rac1的活化。该方法可在细胞水平上研究一种已成功应用于临床的技术，从而为优化该疗法提供可能。...

低强度超声诱导黏附依赖性信号

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低频超声应用：一种确定超声处理对人类白血病细胞影响的方法

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