Name: 在压缩的胶原组织糜:含细胞Biotransplant单上演重建修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解体内组织扩张与重建技术，通过PCL支架与自体组织结合实现三维支架构建。该方法用于皮肤及尿路上皮修复，可减少体外处理步骤并提高组织再生效率。

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作者感谢瑞典医学研究学会、Promobilia 基金会、王储妃洛维萨基金会、共济会儿童福利基金会、瑞典医学会、Solstickan 基金会、卡罗林斯卡学院以及斯德哥尔摩市议会提供的经费支持。

所有动物实验方案均事先获得斯德哥尔摩县动物伦理委员会批准，所有操作均符合动物使用相关法规以及联邦法律规定。
1. 动物实验操作
<ol>
	<li>手术前动物准备
	<ol>
		<li>在无菌条件下，将手术所需的所有材料和器械准备好并放置于手术台上。手术操作必须在严格的无菌条件下进行，以降低感染风险，并优化存活手术的条件。</li>
		<li>术前12小时禁食动物，并测量其体重。肌肉注射赛拉嗪（2 mg/kg）作为术前用药。通过肌肉注射盐酸替来他明（2.5&#8201;mg/kg）、盐酸唑拉西泮（2.5&#8201;mg/kg）、美托咪啶（25 µg/kg）和阿托品（25 µg/kg）对动物实施麻醉。</li>
		<li>在气管插管前注射苯巴比妥（15&#8201;mg/kg），随后以0.8%–2%异氟烷维持全身麻醉。在一侧耳部插入外周静脉导管，并在手术过程中静脉输注葡萄糖（25&#8201;mg/ml），以维持动物的良好状态。</li>
		<li>将监测设备置于耳部或尾部，以检测体温、血压、血氧饱和度和外周脉搏。通过刺激耳部或蹄部评估疼痛反应，以调控麻醉深度。麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膀胱活检标本的切除
	<ol>
		<li>使用10-Fr硅胶导管进行膀胱插管，插入窥器以暴露尿道，将导管经尿道插入膀胱，在半无菌条件下排空尿液。用无菌生理盐水将膀胱充盈至20–25 cm H2O压力（约100–300 ml），然后排空至20 cm H2O（约8 ml/kg体重）。</li>
		<li>将猪小心地置于侧卧位，使用氯己定葡糖酸盐对皮肤进行基本的术前消毒。使用剪毛剪去除肩部毛发后，贴上电凝板。</li>
		<li>将猪小心地转为仰卧位，使用剪毛剪去除腹部毛发，并用氯己定葡糖酸盐对腹部皮肤进行基本的术前消毒。
		<ol>
			<li>用柔软织物固定四肢，以尽量减少关节过度伸展造成的损伤风险。依次使用氯己定葡糖酸盐对动物腹部皮肤进行消毒，并在手术区域周围铺设无菌巾。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>皮肤切开前，静脉注射镇痛药物，包括布托啡诺（45 µg/kg）、卡洛芬（3&#8201;mg/kg），并在脐下正中线局部注射利多卡因。用镊子夹持皮肤以检查疼痛反应。使用电刀切开腹膜和筋膜，以控制出血。定位猪体内完全位于腹膜内的膀胱，并通过手术切口将其自由牵出暴露。</li>
		<li>用镊子夹住膀胱，使用无菌测量尺测量其大小，并用无菌记号笔标记出长约2 cm、横径约1&#160;cm或更小的椭圆形活检区域（猪可良好耐受膀胱体积减少四分之一）。使用手术刀切除标记区域，并将膀胱活检标本在无菌条件下置于DMEM培养基中。</li>
		<li>使用自体移植组织进行自体移植，或用5-0 Vicryl缝线双层缝合关闭膀胱。仔细使用2-0或3-0连续Vicryl缝线关闭腹壁筋膜。使用3-0 Vicryl缝合皮下组织，使用3-0 Ethilon缝合皮肤。伤口覆盖敷料，并密切观察动物，直至其从麻醉中充分恢复且无疼痛表现。</li>
		<li>将动物转移至动物护理设施，确保术后护理条件。将动物单独饲养于笼中并配备加热灯，持续观察直至完全从麻醉中恢复，之后可成对饲养。</li>
		<li>确保术后恢复平稳，无疼痛且状态良好。术后肌肉注射布托啡诺（45 µg/kg）以提供镇痛，并在术后三天内每日两次给予甲氧苄啶（4 mg/kg）和磺胺类药物（20 mg/kg），随后五天内每日一次，以降低术后感染风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤活检标本的切除
	<ol>
		<li>准备好手术台及相关必要材料。按照步骤1.1所述方法对动物进行麻醉。使用脱毛蜡去除毛发，用聚维酮碘和70%酒精清洗并消毒切口区域，然后在切口周围铺设无菌巾。</li>
		<li>使用取皮刀获取厚度为0.3 mm的部分皮层皮肤活检标本。在剪碎前将皮肤标本置于DMEM培养基中，具体操作如步骤2.2所述。伤口区域覆盖油脂性软膏并包扎敷料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织切碎制备
<ol>
	<li>膀胱黏膜
	<ol>
		<li>用 DMEM 清洗膀胱活检组织两次。将膀胱活检样本置于无菌解剖板上，使黏膜面朝上，并用解剖针固定样本的一侧。</li>
		<li>使用精细剪刀和镊子将黏膜组织与逼尿肌分离（图3），并通过滴加生理盐水或 DMEM 保持黏膜湿润。</li>
		<li>使用组织切碎装置：将其放置在黏膜表面，然后在垂直和水平方向上从一端移动到另一端，施加手动压力，以获得大小为 0.8 mm × 0.8 mm 的切碎组织（0.8 mm 为旋转切割刀片之间的距离）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤
	<ol>
		<li>若皮肤活检组织较厚：将皮肤放置在无菌解剖板上，使用外科剪刀将表皮与皮下脂肪及真皮层分离。当表皮变得薄而半透明（约 0.3 mm）时，即可进行切碎。</li>
		<li>将组织切碎装置放置在表皮上，施加压力，在垂直和水平方向上从一端移动到另一端，以获得大小为 0.8 mm × 0.8 mm 的切碎组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 塑性压缩PCL/胶原自体移植物的制备
<ol>
	<li>将所有成分置于冰上以保持低温。所需器具：Falcon管、10倍DMEM、1倍DMEM、1 N NaOH和大鼠尾胶原蛋白I型。
	<ol>
		<li>将2 ml的10倍DMEM（操作需小心，避免产生气泡）与12 ml的I型胶原蛋白混合。逐滴加入1 N NaOH，使pH升至7.4–8（培养基颜色应由深黄色变为粉红色，以指示pH变化）。此外，使用pH试纸进行检测。</li>
		<li>小心加入2 ml的1倍DMEM并混匀。在钢制矩形模具（20×30×10 mm）的每个孔中加入约2 ml胶原蛋白，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。 
		注：胶原蛋白浓度应为2.06 mg/ml（溶于0.6%乙酸），胶原蛋白用量为1 ml/cm2。</li>
		<li>待胶原蛋白在模具中凝固后，将生物材料（PCL）置于胶原凝胶（20 mm × 30 mm）上方，并在其上倒入剩余的胶原蛋白（约6 ml）。于37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。</li>
		<li>将切碎的组织（用于1:6扩增）置于胶原凝胶顶部，通过机械力施加塑料压缩以挤出构造中的水分（见图3和图4）。</li>
		<li>在无菌表面上铺一层厚纱布垫。在纱布垫上放置一片不锈钢网（400 µm厚），然后在其上放置一片尼龙网（110 µm厚）。小心地将胶原凝胶/切碎组织转移至尼龙网上，并小心移除矩形钢模具。</li>
		<li>在胶原凝胶/切碎组织上方再覆盖一层新的尼龙网。在尼龙网上方放置第二片不锈钢网。放置一个重量至少为120 g的压力板或加载板（例如，玻璃板），持续5分钟。</li>
		<li>移除重物、尼龙网和钢网。此时自体移植物已准备好，可用于缝合至猪膀胱的全层皮肤创面，或进行体外培养。</li>
		<li>如需进行体外培养，将薄片状构造切割成适合12孔板的小块，每孔加入1 ml角质形成细胞培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养时间最长可达6周，每周更换培养基3次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 自体移植物的缝合
<ol>
	<li>将自体移植物与切碎的膀胱黏膜缝合至猪膀胱
	<ol>
		<li>在等待期间，将自体移植物保持在DMEM中湿润。使用细的连续单丝缝线缝合自体移植物。出于研究目的，使用不可吸收的5-0 Ethilon缝线。</li>
		<li>通过留置导尿管向膀胱内注入生理盐水，检查是否密闭不漏水。如有可能，用大网膜覆盖自体移植物。按1.2.6所述方法关闭腹壁、皮下组织和皮肤。应用伤口敷料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将自体移植物与切碎的皮肤表皮缝合至全层皮肤缺损创面
	<ol>
		<li>在等待期间，将自体移植物保持在DMEM中湿润。</li>
		<li>使用间断缝合在自体移植物的四角及中央部位将其缝合至全层皮肤创面的基底，以确保自体移植物紧密贴附于下方组织表面。</li>
		<li>用可保持创面湿润的塑料敷料覆盖创面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 终止
<ol>
	<li>在处死前，通过肌内注射盐酸唑拉西泮（2.5&#8201;mg/kg）和美托咪啶（25 µg/kg）对动物进行镇静，并在耳部或尾部连接监测设备以检测脉搏和血压。</li>
	<li>通过静脉注射戊巴比妥钠致死剂量（60–140 mg/kg）处死动物。持续监测脉搏和血压直至动物死亡。</li>
</ol>
6. 体外 培养
 
注意：为了在组织学上评估肌腱碎块在聚己内酯/胶原支架中的进展 体外将胶原蛋白/PCL/碎块补片置于12孔板中，使用角质形成细胞培养基进行培养。
<ol>
	<li>角质形成细胞培养基的制备：
	<ol>
		<li>对一个500 ml的玻璃瓶进行灭菌。</li>
		<li>将400 ml DMEM与100 ml Ham’s F12混合（4:1混合液）。添加10%胎牛血清、5 µg/ml胰岛素、0.4 µg/ml氢化可的松、21 µg/ml腺嘌呤、10-10 mol/L霍乱毒素、2 × 10-9 mol/L三碘甲腺原氨酸、5 µg/ml转铁蛋白、10 ng/ml表皮生长因子、50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素。</li>
		<li>通过0.2 μm滤膜过滤灭菌，并将滤液收集至无菌的500 ml玻璃瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 免疫组织化学

注意：免疫组织化学实验方案通常分为以下步骤：（1）固定和石蜡包埋，（2）切片至5 µm厚度，将切片置于载玻片上，脱蜡和复水，（3）抗原修复、染色和封片。在开始免疫组织化学实验的最后步骤之前，应准备好洗涤缓冲液和抗原修复液（详见单独的材料说明）。ABC复合物溶液需至少在使用前30分钟配制完毕。
<ol>
	<li>固定 
	注意：在实验结束时 体外 培养后，按如下步骤固定样本：
	<ol>
		<li>在离心管中加入1 ml 4%缓冲甲醛（PFA）（注意：甲醛有毒。使用该化学品前请阅读材料安全数据表。佩戴手套和护目镜，并在通风橱内配制溶液）。</li>
		<li>将每块胶原蛋白补片转移至含有4% PFA的Eppendorf管中，在室温下固定过夜。</li>
		<li>将样品置于70%乙醇中，于4 °C长期保存。样品现可进行脱水处理，并包埋于石蜡块中，以备切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再水化
	<ol>
		<li>将载玻片放入盛有X-tra solv的染色缸中，孵育15分钟。更换新的染色缸及X-tra solv，重复此步骤。将载玻片放入盛有无水乙醇的染色缸中，孵育10分钟。更换新的染色缸及无水乙醇，再次重复此步骤。将载玻片依次放入盛有95%乙醇的染色缸中孵育10分钟，再放入盛有70%乙醇的染色缸中孵育10分钟。最后用蒸馏水洗涤载玻片两次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>将载玻片放入盛有TE溶液的柯普林瓶中，将瓶子置于水浴中煮沸20分钟。小心从水浴中取出瓶子。让载玻片冷却至室温，持续30分钟，然后在Tris缓冲液中洗涤两次，每次5分钟。将载玻片放入盛有3%过氧化氢的染色瓶中，孵育10分钟。再用Tris缓冲液洗涤两次，每次5分钟。使用防水标记笔在样品周围画出圆圈。</li>
		<li>使用100–300 µl封闭液封闭抗体的非特异性结合。移除封闭液，加入100–300 µl用Tris缓冲液按推荐浓度稀释的一抗溶液，4℃孵育过夜。移除抗体溶液，用Tris缓冲液洗涤切片2次，每次5 min。</li>
		<li>室温下用二抗孵育1小时。在Tris缓冲液中洗涤两次，每次5分钟。使用ABC Elite试剂盒孵育30分钟（遵循生产商说明书）。在Tris缓冲液中洗涤两次。</li>
		<li>使用Vector VIP试剂盒进行抗体反应，按照制造商说明书操作（通常孵育1–7分钟即可产生清晰的紫罗兰色强度）。将切片置于蒸馏水中。用Mayer苏木精复染30秒。</li>
		<li>用流水冲洗 5 分钟。将载玻片放入盛有 70% 乙醇的染色缸中，浸泡 1 分钟。更换新的染色缸，再次使用 70% 乙醇重复一次。将载玻片放入盛有 95% 乙醇的染色缸中，浸泡 1 分钟。更换新的染色缸，再次使用 95% 乙醇重复一次。</li>
		<li>将切片放入盛有X-tra solv的染色缸中，处理5分钟。逐个取出以保持湿润。在每张切片上滴加一滴封片介质，并小心加盖盖玻片（操作时避免产生气泡）。让切片过夜干燥，随后在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究介绍了一种在手术台上利用自体组织制备膀胱壁补片的简便方法。该补片由中间的可生物降解聚合物针织材料与外层含或不含 minced 组织的胶原结合，并通过塑性压缩技术成型。塑性压缩是一种先前由其他研究者描述的方法，可定义为从胶原凝胶中快速排出液体的过程。12,13膀胱黏膜或皮肤的绞碎组织被接种于该支架中，并形成 &#160;膀胱或皮肤上皮可在6周内进行追踪。免疫组织化学分析显示形成了具有正常组织特征的类似结构。这些结果不仅能够 体外 研究再上皮化和伤口愈合的模型，也可作为自体组织移植的生物材料。对于泌尿科应用而言，最重要的是，自体移植物可用于 在体 组织工程在重建泌尿外科中的应用：利用工程化自体组织补片，无需供体组织 体外 移植前培养11.
在细胞扩增和体外培养技术方面，皮肤上皮与尿路上皮具有共同的特性。本研究中同时介绍适用于这两种上皮组织的塑料压缩与剪切技术，其原因是皮肤上皮的获取及体内研究相比膀胱尿路上皮更为简便。通过这种方法，可首先利用生物材料...

大多数关于移植至皮肤和泌尿生殖道的组织工程研究，均包括从健康组织中获取自体细胞，以及在配备特殊设备的细胞培养设施中进行细胞扩增1,2。
细胞扩增后，通常需要将细胞储存起来，待患者准备好接受自体移植时再使用。液氮冻存罐可在-150 °C或更低温度下实现细胞的长期保存。细胞冻存过程必须谨慎且受控，以避免细胞损失。细胞死亡的一个风险是在解冻过程中细胞内水分形成冰晶，导致细胞膜破裂。细胞冻存通常采用缓慢且受控的降温方式（每分钟降低1 °C），并使用高浓度的细胞、胎牛血清以及二甲基亚砜。解冻后，细胞在重新移植回患者体内之前，需再次进行处理，包括去除冻存液，并在细胞培养塑料表面或生物材料上重新培养。
上述所有步骤均耗时、费力且成本高昂3此外，所有 体外 用于患者移植的细胞处理受到严格监管，需要经过专业培训并获得认证的人员和实验室来操作4总之，为了获得安全可靠的制造工艺，该技术目前仅能在少数技术先进的中心建立，其在普通外科疾病中的广泛应用前景尚不明确。
为了克服实验室环境中细胞培养的局限性，提出了一种将切碎的组织进行体内移植以实现细胞扩增的概念，即利用机体自身作为生物反应器。为此，自体移植物应优先移植到与目标器官最终重建形状相匹配的三维模具上5-7。
最初，Meek 在 1958 年提出了移植切碎上皮组织的概念，当时他描述了上皮组织如何从伤口边缘生长。他证明，通过将一块皮肤在相互垂直的方向上切割两次（图 1）8，可使皮肤边缘增加，从而使其细胞扩增潜力提高 100%。该理论已得到应用网状中厚皮片进行皮肤移植9以及皮肤创伤愈合模型研究的支持10。
<img alt="梯形对称示意图；显示几何分割为更小部分；教育用几何学。" src="/files/ftp_upload/53061/53061fig1.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：Meek理论。 根据Meek理论，上皮组织从伤口边缘生长。通过增加组织切碎技术所暴露的表面积，切碎的组织可从多个位点促进伤口上皮化。
本研究基于以下假设：通过将切碎的上皮组织放置在模具周围，可将相同原理应用于皮下组织。上皮细胞会从切碎的移植物中迁移出来（重新排列），覆盖创面区域（迁移），并进行分裂增殖（扩展），从而形成连续的新生上皮层，覆盖创面区域，并将异物（即模具）与机体内部隔离开来（图2）。
<img alt="Nanoparticle encapsulation diagram; demonstrates coating process and barrier effect analysis." src="/files/ftp_upload/53061/53061fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：用于盛装切碎上皮组织的三维模具示意图 体内 根据Meek理论的体内组织扩张 通过将切碎的组织置于模具上并移植至皮下组织，可验证以下假设：上皮细胞从切碎组织的边缘迁移而出，重新排列并扩展，从而形成连续的新上皮层，覆盖创面区域，并将异物（模具）与机体内部隔离开来。
尽管先前的体内研究已显示出令人鼓舞的结果，但通过加强自体移植物，可使再生的上皮组织更好地耐受机械性损伤，从而进一步提高疗效7。为此，研究人员确定了成功生物材料所需的重要先决条件，例如：营养物质和代谢废物的易于扩散、具备三维塑形能力以及便于外科操作。结论认为，将复合生物材料添加到切碎的组织中，可满足上述需求。
本研究旨在开发一种由机械切碎的组织构成的支架，该支架包含在塑料压缩胶原中，并以可生物降解织物作为增强核心。通过这种方法，活细胞可从切碎的组织颗粒中迁移并增殖，且表现出与原始上皮组织（皮肤或尿路上皮）特征一致的形态学特性。通过塑料压缩技术，支架尺寸从1 cm减小至约420 µm，同时切碎的组织颗粒被包裹于上层胶原中。核心织物可采用任意聚合物材料，但需经修饰以具备亲水性表面，从而与覆盖的胶原层实现交联11。
该方法通过在两层塑化压缩胶原凝胶内嵌入由聚(ε-己内酯)（PCL）制成的针织网状结构，提高了支架的完整性，并将其作为培养猪膀胱黏膜碎块或皮肤碎块的支架。该构建物在细胞培养条件下维持长达6周。 体外，证明在结构良好且已充分整合的杂合构建物顶部成功形成了分层的多层尿路上皮或鳞状皮肤上皮。该构建物易于操作，可通过缝合固定，用于膀胱扩大术或皮肤缺损覆盖。组织支架的所有组分均获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，该技术可实现单阶段手术：从组织取材、切碎、塑形压缩，再到移植回患者体内，整个过程可在一次手术中完成。该操作可在任何普通外科手术单元内，在无菌条件下完成，用于组织扩增与重建。

<table><tbody><tr><td>10-French 硅胶导管</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>DMEM 10x</td><td>Gibco</td><td>31885-023</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>3',3',5-三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>IRMM469</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Labmed Solutions</td><td>200-001-8</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Histolab</td><td></td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>ABC Elite 试剂盒：生物素-链霉亲和素检测试剂盒</td><td>Vector</td><td>PK6102</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Histolab</td><td>1399.01</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>阿托品 25 &amp;mu;g/kg</td><td>Temgesic, RB Pharmaceuticals, 英国</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪 2&amp;thinsp;mg/kg&amp;nbsp;</td><td>Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, 奥地利</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>生物安全二级罩&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>塑料压缩；第 4 节</td></tr><tr><td>封闭液：&amp;nbsp; 使用与二抗相同物种来源的正常血清。</td><td>Vector</td><td>封闭液取决于&amp;nbsp;一抗的&amp;nbsp;来源</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>丁丙诺啡 45 &amp;mu;g/kg</td><td>Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>卡洛芬 3&amp;thinsp;mg/kg&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rimadyl, Orion Pharma, 瑞典</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>葡萄糖酸氯己定&amp;nbsp;</td><td>Hibiscrub 40&amp;thinsp;mg/mL, Regent Medical, 英格兰</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>Coplin 染色缸：用于煮沸的染色缸</td><td>Histolab</td><td>6150</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>不锈钢模具（33 mm x 22 mm x 10 mm），定制</td><td></td><td></td><td>塑料压缩；第 4 节</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>3188-5023</td><td>塑料压缩，第 4 节。进行塑料压缩时使用需保持冰上&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>Ethilon（不可吸收单丝缝合线，用于皮肤缝合）</td><td>Ethicon</td><td></td><td>手术，第 1 节</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10437-036</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>镊子（Adison 带齿）</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>纱布（Gazin Mullkompresse）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>湿盒</td><td>DALAB</td><td></td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3536</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>利多卡因 5 mg/ml</td><td>Xylocaine, AstraZeneca, 瑞典</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>葡萄糖 25&amp;thinsp;mg/ml</td><td>Baxter, Deerfield, IL</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>标记笔（Pap pen）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>美托咪啶 25 &amp;mu;g/kg&amp;nbsp;</td><td>Domitor, Orion Pharma, 瑞典</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>组织切碎装置</td><td>Applied Tissue Technologies LLC</td><td></td><td>组织切碎制备，第 2 节</td></tr><tr><td>Monocryl（可吸收单丝缝合线）</td><td>Ethicon</td><td></td><td>手术，第 1 节</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>NaOH 1&amp;nbsp;N</td><td>Merck Millipore</td><td>106462</td><td>塑料压缩，第 4 节及细胞培养</td></tr><tr><td>尼龙筛网，厚度 110 &amp;mu;M，孔径 0.04&amp;nbsp;sqmm</td><td></td><td></td><td>塑料压缩；第 4 节</td></tr><tr><td>Oculentum simplex APL：眼部保护软膏</td><td>APL</td><td>Vnr 336164</td><td>手术，第 1 节</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>塑料压缩，第 4 节</td></tr><tr><td>苯巴比妥 15&amp;nbsp;mg/kg</td><td>Pentobarbital, APL, 瑞典</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>PCL 编织织物</td><td></td><td></td><td>塑料压缩；第 4 节</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原</td><td>First LINK, Ltd, 英国</td><td>60-30-810</td><td>塑料压缩，第 4 节，保持冰上</td></tr><tr><td>手术刀片 - 15</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>剃毛剪</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>不锈钢筛网，厚度 400&amp;nbsp;&amp;mu;M，孔径</td><td></td><td></td><td>塑料压缩；第 4 节</td></tr><tr><td>无菌手套</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>无菌手术衣</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>无菌铺巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterilium</td><td>Bode Chemie HAMBURG</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>缝合线 Ethilon</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>TE 溶液（抗原修复液），含 10 mM Tris 和 1 mM EDTA，pH 9.0</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris/1 mM EDTA，&amp;nbsp;调节 pH 至&amp;nbsp; 9.0</td></tr><tr><td>盐酸替来他明 2.5&amp;nbsp;mg/kg</td><td></td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;培养；第 5 节</td></tr><tr><td>Trizma Base, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;NC&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>Vector VIP 试剂盒：酶&amp;nbsp;过氧化物酶底物试剂盒</td><td>Vector</td><td>SK4600</td><td>免疫细胞化学；第 6 节</td></tr><tr><td>Vicryl（可吸收编织缝合线）</td><td>Ethicon</td><td></td><td>手术，第 1 节</td></tr><tr><td>Tris 缓冲液 pH 7.6（洗涤缓冲液）</td><td></td><td></td><td>TE 溶液：配制 10x（0.5 M Tris, 1.5 M NaCl），方法为：称取 60.6 g Tris（Trizma Base, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;NC(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, M=121.14 g/mol），加入 800 ml 蒸馏水，调节 pH 至 7.6，加入 87.7 g NaCl，加蒸馏水定容至 1,000 ml。使用时用蒸馏水稀释至 1x。</td></tr><tr><td>X-tra solv（溶剂）</td><td>DALAB</td><td>41-5213-810</td><td>免疫细胞化学；第 6 节。在通风橱中使用</td></tr><tr><td>盐酸唑拉西泮</td><td>Zoletil, Virbac, 法国</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>脱毛蜡纸</td><td>Veet</td><td></td><td>手术前动物准备，第 1 节</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Lundbeck</td><td></td><td>终止，第 3 节</td></tr></tbody></table>

压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

用于组织工程的自体细胞扩增与移植的传统技术可在配备专用设备的人类细胞培养设施中进行。这些方法包括将细胞分离为单细胞悬液，并在重新移植回患者体内之前完成一系列耗时且 laborious 的操作步骤。先前的研究表明，可将人体自身用作生物反应器以实现细胞扩增和组织再生，从而最大限度地减少 离体 移植前对组织和细胞进行的操作。本研究旨在展示一种组织获取、连续上皮分离、将上皮切割成小片段并将其整合入三层生物材料的方法。该三层生物材料作为递送载体，便于手术操作、促进移植物营养交换，并实现可控降解。该生物材料由两层外层的胶原蛋白和一个机械稳定且缓慢降解的聚合物核心组成。在移植前，将切碎的上皮组织整合至其中一层胶原层中。通过将上皮组织切割成小片段，可使其均匀铺展，从而刺激细胞增殖。在移植物初步存活后，细胞将进行扩增与重组，细胞外基质逐渐成熟，促进毛细血管和神经的长入，并进一步促进细胞外基质的成熟。该技术最大限度地减少了 离体 操作简便，可实现细胞采集、自体移植材料制备及患者移植的一站式单阶段干预。未来，可根据患者的具体需求，在体内利用三维模具启动组织扩张。此外，该技术可在普通手术环境中实施，无需复杂的细胞培养设施。

本研究介绍了一种通过胶原蛋白和绞碎组织的塑性压缩来制备用于移植的生物材料的方法。
可采集膀胱黏膜和皮肤，随后通过机械方法将其切碎成小颗粒（图3）。通过塑料压缩法，将切碎的组织颗粒整合到复合支架中，该支架由中心位置的可生物降解聚合物构成，外层为胶原凝胶，具有良好的机械强度（图4）。切碎的组织颗粒可被分离，实现1:6的扩增率。通过压出胶原中的水分，即可完成用于自体重建手术的生物移植材料制备。
生物移植物可用于动物自体移植，以进行体内研究，也可在常规细胞培养环境中培养，用于进一步的体外研究。
复合自体移植物便于抓取和缝合，并能耐受外科操作（图5）。从组织获取到制备含细胞的自体移植物用于重建手术的整个过程大约需要20分钟，旨在作为单阶段手术完成。
在 体外 研究显示，细胞...

组织工程通常包括 体外 扩增以创建用于组织再生的自体移植物。本研究介绍了一种组织扩增、再生与重建的方法 体内 旨在尽量减少细胞和生物材料在体外的处理过程。

用于组织工程的自体细胞扩增与移植的传统技术可在配备特殊的...

以下操作的总体目标是在重建手术期间通过移植自体组织以实现其扩张。该过程首先从目标组织中获取活检样本，随后将活检组织切碎，并构建一种由塑料压缩聚己内酯（PCL）和胶原蛋白组成的自体移植物。随后将PCL与自体切碎的组织整合，以构建三维支架。我们采用了一比六的扩增率。接下来，将该支架重新移植回受试者体内。最终，可通过免疫组织化学分析支架内及绞碎组织颗粒中细胞的增殖与重排情况，来评估自体移植组织的再生能力。本方法将在动物模型中以皮肤和尿路上皮进行演示。该技术的应用前景涵盖严重发育畸形组织或外伤后因组织严重缺失而难以进行手术修复的情况。与现有的体外培养等方法相比，该技术的主要优势在于可作为单阶段手术操作进行。该方法的可视化演示至关重要，因为从组织取材到移植的各个步骤都必须在无菌条件下完成。为获取猪膀胱活检标本，首先用镊子夹住膀胱，并使用无菌的测量尺确定组织的尺寸。接下来，使用已灭菌的笔标记一个椭圆形的活检区域，大小为2厘米×1厘米，目标扩张倍数为1至6倍。然后用手术刀切除标记的组织，并将膀胱活检标本置于无菌条件下的DMEM中。为获取皮肤活检标本，使用取皮机采集厚度为0.3毫米的浅层部分皮厚标本。然后，将组织置于DMEM中，并用敷料覆盖伤口区域。接着，用DMEM清洗膀胱活检组织两次，并将组织转移至无菌解剖板上，使黏膜面朝上。使用解剖针将标本的一侧固定在板上，再用精细剪刀和镊子将黏膜组织与逼尿肌分离。然后，将组织切碎装置置于黏膜上方，从组织一端到另一端垂直和水平方向移动，以获得大小为 0.8 × 0.8 毫米的切碎组织块。注意，在移动过程中需对组织施加压力。为制备塑料压缩胶原自体移植物，首先将一滴正常浓度的氢氧化钠逐滴加入含 I 型胶原的 10X DMEM 培养基中，直至培养基颜色由深黄色变为粉红色。确认 pH 值为 7.4 至 8 后，小心地将 2 mL DMEM 加入溶液中并混匀。然后，将约 2 mL 胶原蛋白加入一个 20×30×10 毫米的钢制矩形模具的孔中，孵育胶原蛋白 10 分钟。待胶原蛋白凝固后，将适量的 PCL 生物材料铺在凝胶化的胶原蛋白上方，再将剩余的 6 mL 胶原蛋白覆盖于 PCL 上方。将模具放回培养箱中继续孵育20分钟。接着，在无菌表面上叠放一层厚的纱布垫。然后，在纱布上放置一层400微米厚的不锈钢网，再在其上覆盖一层110微米厚的尼龙网。轻柔地将胶原凝胶转移至尼龙网上，并小心移除矩形钢制模具。将切碎的组织转移至胶原上。此处，我们的目标是达到1比6的扩增比例。然后，在胶原凝胶和组织上方放置一层新的尼龙网，再在尼龙网上方放置第二层钢网，随后放上一个重量不少于120克的加载板。五分钟后，从自体移植物上移除重物、钢网和尼龙网。对于自体移植物的体外培养，首先将变薄的构建物切成足够小的片段，以适配12孔板。然后，向每个孔中加入一毫升角质形成细胞培养基，将组织培养三至六周。将切碎的膀胱黏膜自体移植物移植到猪膀胱时，先用DMEM润湿移植物，再用细的连续单丝缝线将构建物缝合至健康组织上。通过留置导尿管向膀胱内注入生理盐水，确认移植部位无渗漏。将含有 minced skin 表皮的自体移植物移植至全层皮肤缺损创面时，先用 DMEM 润湿移植物，然后在移植物的四角及中部采用间断缝合的方式，将其固定于全层皮肤缺损创面的底部。最后，用塑料敷料覆盖伤口以保持湿润。如碎皮自体移植图像所示，复合生物移植物能够承受抓持、缝合及外科操作。体外培养不同时间点的免疫组织化学结果显示，细胞增殖、迁移并重新组织形成具有典型细胞表型微结构的连续上皮层。例如，在培养两周时，皮肤自体移植物表面的细胞层大约有两层厚。右侧显示，在相同培养 period 后，膀胱上皮约为八层厚。在培养五至六周后，无论是 minced 皮肤上皮还是 minced 膀胱黏膜自体移植物，其连续上皮均约为八至十层细胞厚。与体外组织扩张相比，该方法快速、劳动强度低，且无需复杂的实验室资源。此外，所有组件均获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可在标准手术环境中使用。实施该操作时，务必注意在无菌条件下准备凝胶、生物移植材料及自体组织。通过该操作流程以及细胞体外培养等其他方法，可进一步探究细胞增殖与分化的相关问题。该技术建立后，可能为再生医学领域的研究人员开辟新的途径。由此，我们有望利用自体组织工程移植物治疗皮肤或泌尿系统的严重畸形。

minced-tissue-compressed-collagen-cell-containing-biotransplant-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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