压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

以下操作的总体目标是在重建手术期间通过移植自体组织以实现其扩张。该过程首先从目标组织中获取活检样本，随后将活检组织切碎，并构建一种由塑料压缩聚己内酯（PCL）和胶原蛋白组成的自体移植物。

随后将PCL与自体切碎的组织整合，以构建三维支架。我们采用了一比六的扩增率。接下来，将该支架重新移植回受试者体内。

最终，可通过免疫组织化学分析支架内及绞碎组织颗粒中细胞的增殖与重排情况，来评估自体移植组织的再生能力。本方法将在动物模型中以皮肤和尿路上皮进行演示。该技术的应用前景涵盖严重发育畸形组织或外伤后因组织严重缺失而难以进行手术修复的情况。

与现有的体外培养等方法相比，该技术的主要优势在于可作为单阶段手术操作进行。该方法的可视化演示至关重要，因为从组织取材到移植的各个步骤都必须在无菌条件下完成。为获取猪膀胱活检标本，首先用镊子夹住膀胱，并使用无菌的测量尺确定组织的尺寸。

接下来，使用已灭菌的笔标记一个椭圆形的活检区域，大小为2厘米×1厘米，目标扩张倍数为1至6倍。然后用手术刀切除标记的组织，并将膀胱活检标本置于无菌条件下的DMEM中。为获取皮肤活检标本，使用取皮机采集厚度为0.3毫米的浅层部分皮厚标本。

然后，将组织置于DMEM中，并用敷料覆盖伤口区域。接着，用DMEM清洗膀胱活检组织两次，并将组织转移至无菌解剖板上，使黏膜面朝上。使用解剖针将标本的一侧固定在板上，再用精细剪刀和镊子将黏膜组织与逼尿肌分离。

然后，将组织切碎装置置于黏膜上方，从组织一端到另一端垂直和水平方向移动，以获得大小为 0.8 × 0.8 毫米的切碎组织块。注意，在移动过程中需对组织施加压力。为制备塑料压缩胶原自体移植物，首先将一滴正常浓度的氢氧化钠逐滴加入含 I 型胶原的 10X DMEM 培养基中，直至培养基颜色由深黄色变为粉红色。

确认 pH 值为 7.4 至 8 后，小心地将 2 mL DMEM 加入溶液中并混匀。然后，将约 2 mL 胶原蛋白加入一个 20×30×10 毫米的钢制矩形模具的孔中，孵育胶原蛋白 10 分钟。待胶原蛋白凝固后，将适量的 PCL 生物材料铺在凝胶化的胶原蛋白上方，再将剩余的 6 mL 胶原蛋白覆盖于 PCL 上方。

将模具放回培养箱中继续孵育20分钟。接着，在无菌表面上叠放一层厚的纱布垫。然后，在纱布上放置一层400微米厚的不锈钢网，再在其上覆盖一层110微米厚的尼龙网。

轻柔地将胶原凝胶转移至尼龙网上，并小心移除矩形钢制模具。将切碎的组织转移至胶原上。此处，我们的目标是达到1比6的扩增比例。

然后，在胶原凝胶和组织上方放置一层新的尼龙网，再在尼龙网上方放置第二层钢网，随后放上一个重量不少于120克的加载板。五分钟后，从自体移植物上移除重物、钢网和尼龙网。对于自体移植物的体外培养，首先将变薄的构建物切成足够小的片段，以适配12孔板。

然后，向每个孔中加入一毫升角质形成细胞培养基，将组织培养三至六周。将切碎的膀胱黏膜自体移植物移植到猪膀胱时，先用DMEM润湿移植物，再用细的连续单丝缝线将构建物缝合至健康组织上。

通过留置导尿管向膀胱内注入生理盐水，确认移植部位无渗漏。将含有 minced skin 表皮的自体移植物移植至全层皮肤缺损创面时，先用 DMEM 润湿移植物，然后在移植物的四角及中部采用间断缝合的方式，将其固定于全层皮肤缺损创面的底部。

最后，用塑料敷料覆盖伤口以保持湿润。如碎皮自体移植图像所示，复合生物移植物能够承受抓持、缝合及外科操作。体外培养不同时间点的免疫组织化学结果显示，细胞增殖、迁移并重新组织形成具有典型细胞表型微结构的连续上皮层。

例如，在培养两周时，皮肤自体移植物表面的细胞层大约有两层厚。右侧显示，在相同培养 period 后，膀胱上皮约为八层厚。在培养五至六周后，无论是 minced 皮肤上皮还是 minced 膀胱黏膜自体移植物，其连续上皮均约为八至十层细胞厚。

与体外组织扩张相比，该方法快速、劳动强度低，且无需复杂的实验室资源。此外，所有组件均获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可在标准手术环境中使用。实施该操作时，务必注意在无菌条件下准备凝胶、生物移植材料及自体组织。

通过该操作流程以及细胞体外培养等其他方法，可进一步探究细胞增殖与分化的相关问题。该技术建立后，可能为再生医学领域的研究人员开辟新的途径。由此，我们有望利用自体组织工程移植物治疗皮肤或泌尿系统的严重畸形。