Name: 正向遗传学的方法来揭开抗逆基因小鼠 - 在ES细胞高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 了解正向遗传学高通量筛选方法，利用小鼠胚胎干细胞筛选抗逆突变体并建立长寿研究模型。该技术可快速识别与应激抗性相关的基因，为衰老机制研究提供经济高效的实验手段。

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我们感谢英国威康信托桑格研究所惠赠的piggyBac转座子和piggyBac转座酶。本研究得到了科罗拉多州巴彻尔基金以及美国国立卫生研究院R01 AG041801（W.S.C.）项目的资助。

1. 利用 piggyBac 转座子构建基因捕获型胚胎干细胞文库
<ol>
	<li>制备原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）作为胚胎干细胞（ES细胞）培养的饲养层
	<ol>
		<li>在37 °C水浴中解冻一管经丝裂霉素C失活的PMEF（5.0 × 106个细胞）。将细胞转移至5 ml ES细胞培养基（含15%胎牛血清、1,000单位/ml白血病抑制因子、100 µM非必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺、55 µM 2-巯基乙醇和25单位/ml青霉素/链霉素的DMEM），在100 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于30 ml ES细胞培养基中，随后分装至两个T25培养瓶（每瓶5 ml）和两个100 mm培养皿（每皿10 ml）。于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养并扩增C9 ES细胞
	<ol>
		<li>在37 °C水浴中解冻一管C9 ES细胞（0.5 ml中含2.5 × 106个细胞），将细胞转移至5 ml ES细胞培养基中，在100 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将ES细胞重悬于5 ml ES细胞培养基中，接种至T25饲养层培养瓶中。于37 °C、5% CO2条件下培养，每日更换ES细胞培养基。</li>
		<li>培养2天后，ES细胞应达到约80%汇合度，可进行传代。用5 ml不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤细胞，加入2.5 ml预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育10分钟。加入2.5 ml ES细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用，吹打15次以分散细胞团块，在100 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于4 ml ES细胞培养基中。每100 mm培养皿中加入1 ml细胞悬液和9 ml ES细胞培养基，共制备两个100 mm培养皿。此为1:8传代比例。每日以10 ml ES细胞培养基喂养细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为文库制备96孔饲养层培养板
	<ol>
		<li>参照步骤1.1.1，解冻三管经丝裂霉素C失活的PMEF（每管含5 × 106个细胞），每管细胞用33.3 ml ES细胞培养基重悬，合并所有细胞制成100 ml细胞悬液。</li>
		<li>每孔加入100 µl细胞悬液，接种至十块96孔板中。这些96孔饲养层培养板应在用PB转座子转染C9 ES细胞前至少一天制备完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PB-UPA载体对C9 ES细胞进行电穿孔
	<ol>
		<li>使用自动细胞计数仪对扩增后的C9 ES细胞进行胰蛋白酶消化并计数。每块100 mm培养皿的C9 ES细胞用10 ml PBS洗涤，加入8 ml预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>加入2 ml ES细胞培养基终止胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移至15 ml离心管中，吹打15次以分散细胞团块，立即在100 × g条件下离心5分钟，随后吸除上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于10 ml ES细胞培养基中，使用血细胞计数板计数ES细胞。准备六个15 ml离心管，每管含5 × 106个ES细胞。在100 × g条件下离心5分钟，吸除上清液后，将每个细胞沉淀重悬于0.8 ml PBS中。</li>
		<li>准备六个电穿孔杯（4 mm间隙），将0.8 ml细胞悬液转移至每个电穿孔杯中。向每个电穿孔杯中加入1 µg PB-UPA和20 µg mPB转座酶（mPBase），轻轻吹打混匀。将电穿孔杯置于冰上，使用电穿孔仪在指数衰减模式下进行电穿孔（250 V，500 µF，无限电阻）。 
		注：通常成功电穿孔的时间常数约为10至12毫秒，每5 × 106个细胞可获得约1,500至2,000个G418抗性转化子。</li>
		<li>将转染后的细胞收集并合并至含98 ml ES细胞培养基的T75培养瓶中，轻轻吹打混匀后转移至50 ml储液槽中。使用12通道移液器，每孔加入100 µl细胞悬液至先前制备的96孔饲养层培养板（共10块）。于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>24小时后，每日用含G418（150 µg/ml）的新鲜ES细胞培养基喂养细胞，以筛选基因捕获克隆。 
		注：通常每孔可形成约十个G418抗性克隆。当这些克隆生长至足够大小（通常为5–7天）时，将96孔板（文库）复制为两套，分别用于保存和筛选。文库中的每块板称为“子文库”，因此本实验中共有10个子文库。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 文库扩增
<ol>
	<li>复制主培养板
	<ol>
		<li>在G418抗性克隆达到50–60%融合度前24–48小时，将另外三管经丝裂霉素C灭活的PMEF解冻并接种至十个96孔板中作为饲养层（参见第1.3节）。通过在37 °C孵育0.1%明胶（每孔100 µl）至少15–30分钟对十个96孔板进行明胶包被；过夜孵育亦可接受。</li>
		<li>通过胰酶消化制备96孔板中的单细胞悬液。吸除96孔板中的培养基，并用等体积不含Ca2+、Mg2+的PBS洗涤一次。每孔加入50 µl预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。加入50 µl ES细胞培养基终止胰酶反应。使用多通道移液器反复吹打15次以充分分散细胞团块。</li>
		<li>将50 µl胰酶消化后的细胞悬液转移至已含有150 µl ES细胞培养基的饲养层板（主板）对应行中，剩余50 µl转移至已含有150 µl ES细胞培养基的明胶包被板（复制板）对应行中。将每行细胞分别处理至主板和复制板。将板（现每孔总体积为200 µl）置于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。 
		注：此时共有二十个96孔板。</li>
		<li>次日，用含150 µg/ml G418的新鲜ES细胞培养基（每孔100 µl）换液。每日更换培养基，直至孔内细胞融合度达80–90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存主培养板
	<ol>
		<li>当主培养板细胞融合度约达80%时，按前述方法进行胰酶消化（参见第2.1.2节）。</li>
		<li>取出培养板，加入50 µl 2倍冻存液（60% ES细胞培养基、20% FBS、20% DMSO）终止胰酶反应。使用多通道移液器反复吹打10次，确保冻存液充分混匀。</li>
		<li>将96孔板放入密封严实的泡沫盒中，置于-80 °C冰箱中可保存长达四个月。四个月的保存时间足以完成应激筛选，并确定主培养板中哪些孔含有目标克隆。 
		注：在-80 °C保存超过四个月将导致细胞活力下降。可选用96孔格式的冻存管，长期储存在液氮气相中以延长保存时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从复制板制备DNA板及亚文库池
	<ol>
		<li>在进一步复制至DNA板和亚文库池前24–48小时，准备十个含丝裂霉素C灭活PMEF的100 mm培养皿用于亚文库池，以及十个明胶包被的96孔板用于DNA板复制。具体操作步骤参见第1.3节。</li>
		<li>对96孔复制板中的细胞进行胰酶消化（参见第2.1.2节）。在10分钟&#160;胰酶消化期间，吸除DNA板中的明胶，并更换为含G418（150 µg/ml）的150 µl ES细胞培养基。同时，准备一个储液槽，加入5 ml ES细胞培养基，用于将“亚文库”细胞汇集至100 mm饲养层培养皿中。</li>
		<li>胰酶消化后，使用12通道移液器逐行加入50 µl ES细胞培养基终止胰酶反应。&#160;反复吹打10次以充分分散细胞团块。</li>
		<li>将50 µl细胞悬液转移至DNA板的对应行，剩余50 µl转移至含5 ml ES细胞培养基的储液槽中。完成一个完整的96孔板操作后，吸除一个100 mm饲养层培养皿中的培养基，用于接种汇集的细胞。这些汇集的诱变细胞定义为一个“亚文库”。</li>
		<li>对剩余九个96孔板重复上述操作。每日用含G418（150 µg/ml）的ES细胞培养基对96孔DNA板和100 mm“亚文库”板进行换液。 
		注：此时共有十个96孔“DNA”板和十个100 mm“亚文库”板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存DNA板。当DNA板中细胞融合度达80–90%时，吸除培养基，用100 µl PBS洗涤两次，随后于-20 °C保存，以备后续基因组DNA提取6。这些DNA板将通过PCR筛选，以确定“主培养板”中哪个对应孔含有目标克隆。</li>
</ol>
3. 多西环素诱导的纯合突变体
<ol>
	<li>冷冻亚文库细胞池并传代细胞以进行多西环素处理
	<ol>
		<li>在100 mm“亚文库”培养皿中的菌落生长至可达到70–80%汇合度的前24小时，准备十块经明胶包被的100 mm培养皿用于多西环素处理。</li>
		<li>制备每个亚文库的单细胞悬液（详见第1.4.1和1.4.2节）。将5 × 106 个细胞转移至含多西环素（1 µg/ml）的明胶包被100 mm培养皿中；在37 °C、5% CO2条件下培养。将未加多西环素处理的剩余亚文库细胞池以每管5 × 106 个细胞分装并冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在多西环素存在下传代细胞以敲除 Blm
	<ol>
		<li>在多西环素（1 µg/ml）存在下，每2–3天以1:8比例传代亚文库细胞，持续最多两周。在此期间，多西环素诱导的 Blm 敲除将促进细胞群体中杂合性丢失，从而产生纯合突变体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 应力筛选与抗性克隆的分离
<ol>
	<li>对多西环素处理的细胞进行应激筛选
	<ol>
		<li>在对多西环素处理的细胞进行传代以进行应激筛选前24小时，准备十个经明胶包被的150毫米培养皿，并置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中。</li>
		<li>通过胰蛋白酶消化制备各亚文库的单细胞悬液（详见第1.4.1和1.4.2节）。将6.6 × 106个细胞接种至每个150毫米培养皿中，总体积为30 ml，均匀分布细胞。在含7.5%热灭活FBS的胚胎干细胞培养基中加入应激物（10 µM百草枯或省略β-巯基乙醇），共同孵育7天，之后更换为正常的胚胎干细胞培养基，使存活细胞生长形成克隆以便挑取。</li>
		<li>可选：将剩余的多西环素处理细胞以每管5.0 × 106个细胞的密度冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>挑取抗应激克隆
	<ol>
		<li>恢复正常培养基培养一周后，观察存在的抗应激克隆数量。根据需挑取的克隆数量，提前一天在96孔板中准备相应数量的含丝裂霉素C失活的PMES饲养层的孔（详见第1.1节）。&#160;</li>
		<li>挑取当天，吸除96孔饲养层板中的培养基并更换为100 µl新鲜胚胎干细胞培养基，放回37 °C、5% CO2湿化培养箱。同时，准备一个U型底96孔板，每孔加入50 µl 0.25%胰蛋白酶-EDTA。吸除150毫米应激筛选板中的培养基，并加入等体积的PBS。</li>
		<li>将微量移液器设定为2 µl，将存活的克隆“挑取”至含有胰蛋白酶的U型底孔中，每孔一个克隆。允许该板在室温下静置，直至完成所需数量的克隆挑取。随后将U型底板在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。 
		注：通常，挑取96个克隆约需1小时。</li>
		<li>使用多通道移液器逐行加入50 µl胚胎干细胞培养基以终止胰蛋白酶反应。上下吹打15次以获得单细胞悬液，并将100 µl细胞悬液转移至已含有100 µl胚胎干细胞培养基的饲养层板对应行中。完成整块板的转移。在200 µl培养基中过夜培养。次日早晨，吸除培养基并更换为100 µl胚胎干细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复制96孔板
	<ol>
		<li>当挑取的克隆孔达到80–90%汇合度时，将其复制至两块相同的96孔板中，一块用于基因组DNA提取，另一块用于细胞备份。这些板经明胶包被，不含丝裂霉素C失活的PMES饲养层。</li>
		<li>吸除培养基，用100 µl PBS洗涤。每孔加入50 µl 0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C孵育10分钟。加入150 µl胚胎干细胞培养基终止胰蛋白酶反应，通过移液混匀，将100 µl细胞悬液转移至两个96孔板的对应孔中。每日更换培养基。</li>
		<li>当两块板均达到80–90%汇合度时，将其中一组按“备份”冻存（详见第2.2节）。另一组板按以下方法进一步扩增。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增细胞以进行基因组DNA提取
	<ol>
		<li>在96孔DNA板中制备单细胞悬液（详见第2.1.2节）。</li>
		<li>使用微量移液器将96孔板中每一孔的细胞悬液转移至24孔板（共4块）的对应孔中。确保无任何细胞交叉污染，因为“挑取”的克隆为“单克隆”来源。在0.5 ml胚胎干细胞培养基中培养细胞，每日更换培养基，直至孔内细胞达到80–90%汇合度。 
		注：24孔板可提供足量的基因组DNA用于PCR分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PB 插入位点及捕获基因的鉴定
<ol>
	<li>从24孔板中分离基因组DNA：裂解24孔板中的细胞，并分离无RNA污染的基因组DNA。</li>
	<li>进行Splinkerette PCR（SpPCR），以扩增PB转座子插入位点侧翼的序列片段，具体方法如文献7,8所述。 
	注意：SpPCR是一个为期五天的流程，但每天实际操作时间很短。</li>
</ol>
6. 突变克隆的遗传学分析
<ol>
	<li>定位主孔并纯化目标克隆。
	<ol>
		<li>当 PB 整合位点已定位，设计一个位于整合位点上游的正向引物，与一个 PB 反向引物（例如， PB3’-1) 8 并筛选对应于该DNA板的 相同 从“子文库”中挑选出耐受胁迫的克隆。预期在整个96孔DNA板中仅发现一个阳性孔。从“主板”中将该特定孔的细胞复苏至含饲养层的24孔板中，培养细胞至80-90%汇合度。 
		注意：此时，该孔中含有基因捕获克隆的混合物。</li>
		<li>当24孔板细胞融合度达到80–90%时，用胰蛋白酶消化细胞，并将1,000个ES细胞接种至100 mm饲养层培养皿中（确保为单细胞悬液）。将剩余细胞传代至含饲养层的T25培养瓶中进行扩增。当T25培养瓶中细胞集落融合度达到80–90%时，冻存细胞。每个T25培养瓶冻存4管作为备份。</li>
		<li>让菌落生长7天，然后挑取96个菌落转入一个96孔饲养板中。挑取操作步骤参见第4.2节。待条件适宜后，将该板复制为一份“DNA”板，另一份冷冻保存作为“2”nd-master’ 板（参见第 2.2 节关于冻存的内容）。</li>
		<li>待细胞集落达到 80–90% 汇合度。对 DNA 板进行筛选，找出含有目标纯化克隆的孔。从 96 孔板中扩增细胞nd- 将主培养板转移至24孔板，随后转移至T25培养瓶（均接种于饲养层细胞上）。每T25培养瓶冻存4管。 
		注意：此时，基因捕获细胞系为单克隆，尚未暴露于应激刺激，适用于小鼠制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定数量 PB 插入：解冻一管耐受应激的细胞系，于明胶包被的T25培养瓶中扩增细胞。提取基因组DNA，并检测插入拷贝数 PB 转座子。这可以通过以新霉素基因为靶标的qPCR实现。</li>
	<li>检测基因表达水平：在确认存在单一 PB 在目标细胞系中检测整合事件，使用针对每个基因的特异性TaqMan探针，通过RT-qPCR测定被捕获基因的表达水平。</li>
	<li>对突变mRNA进行测序：使用上游引物（结合于外显子）和下游引物（结合于基因捕获盒的剪接受体序列）通过PCR扩增生成cDNA片段。对cDNA片段进行测序，以确认被捕获基因中发生预期的剪接事件。</li>
	<li>重新动员 piggyBac 转座子用于检测被捕获基因与抗逆性之间的因果关系。
	<ol>
		<li>解冻细胞前24-48小时 PB 重悬并解冻DR4饲养细胞，接种于一个T25培养瓶和两个100 mm培养皿中。在DR4饲养细胞接种至T25培养瓶至少一天后，解冻一管含有该细胞系的冻存细胞 PB 接种细胞并将其接种至含有DR4饲养层细胞的T25培养瓶中。在ES细胞培养基中培养48小时，每天更换培养基。</li>
		<li>制备ES细胞的单细胞悬液。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并转移5.0 x 106 将ES细胞转移至15 ml离心管中。以100 × g离心，用800 µl PBS重悬细胞。将细胞悬液转移至4 mm比色杯中。</li>
		<li>加入20 µg mPBasePuro 将样品加入比色皿，用移液器混匀，电穿孔转染细胞（具体操作参见第1.4节）。将转染后的细胞分别接种至两块100 mm DR4饲养层培养皿中。在ES细胞培养基中过夜培养细胞。</li>
		<li>次日上午，用含1 µg/ml嘌呤霉素的ES培养基喂养细胞，并培养48小时。随后撤去嘌呤霉素筛选，继续培养细胞5天。当克隆足够大时进行挑取，挑取至96孔饲养层培养板中（参见第4.2节）。</li>
		<li>当挑选的细胞达到80-90%融合度时，按1/6比例传代th 将该板的内容转移至DNA板中，并取1/6th 将培养板中的细胞转入含有G418的培养板中，保留2/3rds 原培养板中待冻存的细胞（冻存步骤详见第2.2节）。</li>
		<li>将DNA板在ES细胞培养基中培养以备后续DNA提取，将G418板置于含150 µg/ml G418的培养基中，用于检测新霉素抗性的丢失。在含G418的培养条件下培养72–96小时后，无存活细胞的孔表明基因捕获元件已成功重新动员。 PB 转座子</li>
		<li>‘DNA’板中对应的孔将通过PCR筛选以确认 PB 转座子已被移除。当DNA培养板汇合度达到90%时，以96孔板形式提取基因组DNA 4 通过PCR筛选野生型序列的恢复情况以及neo-IRES的缺失，以确认回复突变。</li>
		<li>从主培养板中将对应孔的细胞解冻转移至24孔板，并扩增至T25培养瓶（均含饲养层细胞）。每个T25培养瓶冻存四支备份冻存管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 小鼠突变体的制备
<ol>
	<li>从主培养板中回收具有抗性的 ES 细胞，并用于胚胎显微注射以产生嵌合体。将约 15–20 个 ES 细胞注入单个 C57BL/6 囊胚中。每只小鼠子宫内移植 15 个囊胚至假孕雌鼠（ICR 品系）。将获得的雄性嵌合体小鼠（通过 ES 细胞特异的 agouti 毛色标记识别）与多只年轻的 C57BL/6J 雌性处女鼠交配，以检测生殖系传递能力，并建立突变小鼠品系。</li>
	<li>从小鼠 F1 代突变体及其野生型同窝对照中分离尾部皮肤成纤维细胞，检测活性氧（ROS）水平及对百草枯9的抗性。</li>
</ol>

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<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36, 543-544 (2015).</li>
<li>Baker, K. E., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+terminating+erroneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression.</a> Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).</li>
<li>Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+nonsense-mediated+mRNA+decay+permits+unbiased+gene+trapping+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).</li>
<li>Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+mouse+mutations+in+embryonic+stem+cells+by+use+of+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling.</a> Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

正向遗传学分析能够无偏倚地检测基因组中负责特定表型的基因。该方法在揭示新基因功能方面非常强大。尽管该方法已在低等生物中广泛应用，但在哺乳动物（如小鼠）中却较少使用，主要原因是所需基础设施和后勤保障的成本极高。在此，我们将遗传筛选过程转移到胚胎干细胞（ES细胞）培养平台，显著提高了突变体生成和突变鉴定的效率与通量。
为了有效筛选耐药突变体，需要确定一种致死剂量的胁迫因子及处理时间，使得所有野生型细胞均被杀死。筛选条件越严格，假阳性结果的发生率就越低。成纤维细胞饲养层对氧化应激的耐受性高于胚胎干细胞（ES细胞）；饲养层的存在会挽救邻近的ES细胞，使其免于被胁迫因子杀死。因此，在胁迫筛选过程中省略饲养层对于实现有效杀伤至关重要。在皮肤成纤维细胞中，血清剥夺是揭示长寿小鼠中应激抗性表型所必需的10。然而，该方法在ES细胞中不可行，因为ES细胞无法在无血清条件下存活。作为替代方案，我们发现使用低浓度（7.5%）的热灭活血清可达到类似效果。
在本报告中，我们采用了 poly-A 捕获法而非启动子捕获法，因为在正常条件...

寿命与抗应激能力密切相关。通常，长寿物种往往对多种应激因素表现出更强的抵抗力，例如过氧化氢、百草枯（PQ）、紫外线、高温和重金属1,2。相反，对应激的敏感性增加通常预示着寿命缩短和/或更容易患病的表型。长期以来，人们推测抗氧化清除通路在赋予动物抗应激能力方面起着关键作用。然而，除少数例外，在多种经过基因改造的动物模型中，针对不同抗氧化酶（例如，SOD）进行操作的研究表明，提高氧化物清除酶的水平并不能延长寿命或健康寿命3。这些数据提示，长寿动物中 consistently 观察到的抗应激特性是由其他尚未揭示的细胞通路所介导的。
我们采用无偏倚的正向遗传学方法，筛选在突变后可赋予培养的胚胎干细胞（ES细胞）应激抗性表型的基因。ES细胞在本研究中具有两大优势：（1）可利用成熟的遗传操作技术对ES细胞基因组进行修饰；（2）从筛选中获得的任何具有应激抗性的ES细胞均可直接用于小鼠制备，从而快速转化为整体动物研究，以评估寿命和健康寿命。
在本报告中，我们描述了使用C9 ES细胞系的方法，其中Blm等位基因受四环素响应元件调控。通过多西环素（dox）处理可 transiently 关闭Blm的表达，从而增加姐妹染色单体交换的发生频率。这种短期的Blm基因敲除使得在杂合子群体中能够产生纯合突变，从而在筛选过程中捕获与应激抗性相关的隐性突变。我们还描述了使用piggyBac（PB）转座子作为诱变工具，随机将多聚腺苷酸化信号捕获盒（PB-UPA）插入基因组中以实现基因突变。被多聚腺苷酸化信号捕获盒中断的基因将导致细胞对G418产生抗性，因而可被筛选回收，从而构建基因捕获突变体文库（gene-trap library），并进一步筛选出具有应激抗性的突变克隆。
从筛选中获得的抗逆克隆可通过分子技术快速表征，包括插入拷贝数（qPCR）、插入位点（splinkerette PCR）、被破坏基因的身份（BLAST）及其表达水平（RT-qPCR）。通过在克隆中瞬时表达mPB转座酶，可使PB插入序列发生重动员，从而恢复野生型DNA序列，并据此检测抗逆性是否丧失。这些方法可有效验证突变与表型之间的因果关系，应在进行成本较高的小鼠制备前完成。先前研究表明，暴露于胁迫因素的细胞会失去多能性4,5。因此，在本方案中，保留一组未经胁迫处理的突变细胞副本，对于成功制备小鼠至关重要。
本实验室已构建了C9 ES细胞系和PB-UPA载体，两者均可应其他研究者的要求提供。本文所报道的实验方案首先利用PB-UPA构建全新的基因捕获ES细胞文库（图1A），随后通过复制平板培养和应激筛选，分离获得抗应激的克隆（图&#160;1B）。我们以百草枯为例展示了筛选过程，百草枯是一种强效的细胞内自由基生成剂。实际上，任何细胞毒性化合物或毒素，例如内质网应激诱导剂（如毒胡萝卜素和衣霉素）、神经元氧化剂（如 MPP+、6-羟基多巴胺和鱼藤酮）、高温以及重金属（如 Cd、Se），均可适用于该方法，用于筛选相应的抗性突变体。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;载体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase&lt;sup&gt;Puro&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;组织培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>500-ml Stericup 滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>250-ml Stericup 滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50-ml Steriflip-GV 滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Tissue Culture Biologicals</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>热灭活 FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>甲基紫精二氯化物（百草枯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 Hybri-MAX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX 0.1% 明胶</td><td>EMD Millipore</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/改良型</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>100-mm&amp;nbsp; 培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>150-mm&amp;nbsp; 培养皿</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>96-孔&amp;nbsp; 板</td><td>Corning</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96-孔 U 型底板</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>24-孔板</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50-ml 储液槽&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>15-ml 离心管</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>原代小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 小鼠胚胎成纤维细胞</td><td>Applied StemCell</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素 C</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP25312</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素（G418）</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP26531</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>计数载片（用于 TC10）</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;电穿孔&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser 电穿孔杯（4&amp;#160;mm 间隙）</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;分子生物学&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler ep Gradient&amp;nbsp; S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene Core kit B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA 克隆试剂盒</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 合成试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>双纯化组织培养用水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;96-孔裂解缓冲液（Ramires-Solis &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，1992）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-月桂酰肌氨酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;电泳&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭&amp;nbsp;</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>2-log DNA 标准分子量标记</td><td>New England BioLabs</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

利用正向遗传学方法揭示小鼠应激抗性基因——在胚胎干细胞中进行的高通量筛选

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

以表型驱动的小鼠遗传筛选是一种揭示基因功能的强大技术，但通常受限于极高的成本，从而严重限制了其应用潜力。本文介绍了利用小鼠胚胎干细胞（ES细胞）作为替代细胞，对感兴趣的表型进行筛选，随后将这些细胞导入宿主胚胎，发育成携带该表型的活体小鼠。该方法具有以下优势：（1）为哺乳动物细胞的遗传筛选提供了一个成本低、通量高的平台；（2）能够快速鉴定突变基因并验证其因果关系；（3）可直接利用筛选获得的ES细胞快速构建小鼠突变体，用于整体动物研究。我们展示了使用百草枯（PQ）筛选耐药突变体，并鉴定赋予氧化应激耐受性的突变。其他应激源或细胞毒性化合物也可用于筛选耐药突变体，以揭示多种细胞应激耐受性的新型遗传决定因素。

在典型的诱变实验中，转染包含总共 3 x 107 个 ES 细胞，以及 PB-UPA 和 mPB 转座酶。两次独立实验所产生的基因捕获 ES 细胞数量总结于表 1中。基因捕获的效率约为 0.04%。合并的基因捕获文库包含 22,400 个独立突变体，大约覆盖了小鼠基因组（23,000 个编码基因）的全部基因。通过重复诱变和/或扩大实验规模产生更多突变体，可实现更高的覆盖度。
由于基因捕获文库包含随机突变，因此无法预测具有胁迫抗性表型的突变体数量。我们进行了两次独立的百草枯（PQ）抗性筛选；对22,440个独立的基因捕获突变体进行联合筛选，共发现17个突变可赋予细胞对PQ的抗性（占0.08%）（表1）。
我们已从主培养板中纯化出3个突变克隆——Pigl、Tiam1和Rffl，用于进一步分析和小鼠品系的建立。携带Rffl杂合突变的细胞通过敲除Blm成功诱导产生了纯合子后代。然而，我们未能从Pigl和Tiam1突变体中获得任何纯合子突变体，推测...

抗应激能力是长寿的标志性特征之一，已知其受遗传因素调控。在此，我们开发了一种无偏倚的高通量方法，用于筛选赋予胚胎干细胞抗应激能力的突变，从而建立用于长寿研究的小鼠模型。

以表型驱动的小鼠遗传筛选是一种揭示基因功能的强大技术，但通常受限于极高的成本，这严重……

本方法的总体目标是高效筛选出耐受应激的突变型胚胎干细胞，快速鉴定相关基因，并以较低成本建立可存活的小鼠模型。该方法有助于解答衰老研究领域中的关键问题，使我们能够识别参与应激抵抗以及延长哺乳动物健康寿命和寿命的基因。该技术的一个优势在于，它能够以较低成本筛选出新的突变体，并在胚胎干细胞筛选后作为替代模型，高效地生成具有表型的小鼠模型。开始培养ES细胞时，首先在37摄氏度水浴中解冻一管经丝裂霉素C处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMFs），用于作为ES细胞培养的饲养层细胞。将细胞转移至5毫升ES细胞培养基中，并在100 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于30毫升ES细胞培养基中。将细胞分别接种至两个100毫米培养皿和两个T25培养瓶中。在37摄氏度、5%CO2条件下培养24小时。随后，将一管C nine ES细胞在37摄氏度水浴中解冻。将细胞转移至5 mL ES细胞培养基中，以100 × g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 mL ES细胞培养基中，随后接种至含有饲养层细胞的T25培养瓶之一中。在37摄氏度和5% CO2条件下培养。每天更换培养基。两天后，ES细胞应达到约80%融合度，可用于传代。将这些细胞用5毫升PBS洗涤一次，加入2.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，在37°C下孵育10分钟。然后加入2.5毫升ES细胞培养基，上下吹打15次以分散细胞团块。将细胞转移至15毫升锥形管中，在100 × g下离心5分钟。吸去上清液，并将细胞沉淀重悬于四毫升 ES 细胞培养基中。然后将一毫升细胞悬液分别转移至两个含有九毫升 ES 细胞培养基的 100 毫米培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中孵育，并每天更换培养基，以制备用于文库构建的 96 孔饲养层培养板。将三管丝裂霉素C灭活的P、mfs解冻，并将每管分别重悬于33.3毫升ESL培养基中。合并细胞，由此平板获得100毫升细胞悬液。24小时后，每孔接种100微升细胞至10块96孔板中。胰蛋白酶观察着在100毫米培养皿上生长的C9 ES细胞。计数后，准备六个15毫升离心管，每管含有5×10⁶个ES细胞，并将其重悬于0.8毫升PBS中。为构建ESL突变文库，将0.8毫升细胞悬液加入六个电穿孔比色皿中进行准备。将1微克的piggyback或P-B-U-P-A载体与20微克的MPB转座酶轻轻混匀，用移液器吹打混匀后将电转杯置于冰上。使用指数衰减模式进行电穿孔，参数设置为250伏、500微法拉和无穷大欧姆。将转染后的细胞收集至含有98毫升ESL培养基的T75培养瓶中。轻轻吹打混匀细胞，取50毫升转移至储液槽中。使用12通道移液器将100微升细胞悬液加入96孔饲养板的每个孔中，于37摄氏度、5%CO2条件下培养24小时后，每天用含有150微克/毫升G418的新鲜ESL培养基喂养细胞，以启动ESL文库的扩增。首先，按

forward-genetic-approach-to-uncover-stress-resistance-genes-mice-high

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

正向遗传学的方法来揭开抗逆基因小鼠 - 在ES细胞高通量筛选

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。...

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本方案描述了一种高通量方法，用于在S.

基于蛋白质遗传的高通量筛选 S. cerevisiae

本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C.

生理应激反应的测量 秀丽隐杆线虫

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

基于Ca2+浓度升高的正向遗传筛选可鉴定参与植物钙依赖性信号通路的遗传组分。...

利用转基因钙离子荧光报告蛋白Aequorin进行正向遗传筛选以鉴定钙信号通路中的新靶点

新近发现的疾病相关基因在神经精神障碍发病机制中的作用仍不明确。一种改良的双侧子宫内电穿孔技术可实现将基因转入大量神经元群体中，并可用于研究基因表达变化对社交行为的因果影响。...

利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

本研究描述了一种在裂殖酵母（Schizosaccharomyces...

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

了解正向遗传学高通量筛选方法，利用小鼠胚胎干细胞筛选抗逆突变体并建立长寿研究模型。该技术可快速识别与应激抗性相关的基因，为衰老机制研究提供经济高效的实验手段。

利用正向遗传学方法揭示小鼠应激抗性基因——在胚胎干细胞中进行的高通量筛选

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