Name: 协议主要人肝细胞的分离和相应的非实质肝细胞的主要种群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 了解从同一供体肝脏组织中分离人肝细胞和非实质细胞的方法。该技术通过灌注和密度梯度离心实现高产量和高活力，为肝脏疾病建模和药物测试提供可靠的体外共培养系统。

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我们感谢 Jia Li Liu 在制作图 1 过程中的支持。本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）项目“虚拟肝脏”（Virtual Liver）资助，项目编号：0315741。

注意：所有细胞均来自部分肝切除术后剩余的非肿瘤性人肝组织，该手术用于治疗原发性或继发性肝肿瘤。患者知情同意书的获取符合柏林夏里特大学医学中心的伦理准则。
1. 材料与溶液的准备
<ol>
	<li>提前对所有器械和材料进行灭菌，以避免在分离过程中发生细菌污染。</li>
	<li>根据表1和表2配制肝脏组织样本灌注、肝细胞与非实质肝脏细胞分离过程以及原代人肝细胞培养所需的溶液，其中消化液（Digestion-Solution）需在使用前新鲜配制。所有溶液均可在4 °C保存，建议在配制后4周内使用。</li>
	<li>使用0.22 µm瓶顶滤器对所有溶液进行灭菌。</li>
</ol>
2. 灌注设备的准备
<ol>
	<li>按照 图1A 所示设置肝脏组织样本灌注与消化的设备。</li>
	<li>将水浴温度调节至 39 °C，以确保灌注和消化过程中胶原酶 P 的最佳活性。</li>
</ol>
3. 肝组织样本的灌注与消化（1.5 小时）
<ol>
	<li>从切除的肝组织中选取带有完整格利森氏被膜的组织样本。切割组织样本时，尽量获得较小的切面，并确保血管清晰可见。运输和处理肝组织样本时需置于冰上，以避免热缺血时间。</li>
	<li>在无菌条件下称取组织重量，将肝组织样本置于超净工作台内的培养皿中。用无菌纱布清洁组织样本表面残留的血液，并使用1×灌注液I冲洗灌注套管组，确保所有套管通畅。</li>
	<li>使用组织胶将套管的橄榄头固定于较大的血管内。根据肝组织样本的大小及表面血管数量，选用含3至8根套管的灌注套管组。进行灌注测试并检查是否存在泄漏。对泄漏出透明1×灌注液I的血管，使用组织胶封闭。</li>
	<li>将插好套管的肝组织样本放置于布氏漏斗的带孔滤膜盘上（图1A）。</li>
	<li>根据所用套管数量及肝组织的阻力，将蠕动泵的流速设定在7.5 ml/min至14.6 ml/min之间。每次均需调节流速，以确保灌注持续但缓慢进行。持续灌注直至完全清除血液，至少灌注20分钟。观察组织在灌注良好的区域逐渐变亮。 
	注意：在某些情况下，可能需要使用塑料夹夹闭其中一根套管，或用刮勺轻轻按压肝被膜以增加局部压力，从而优化灌注效果。当组织完全变为浅黄色至浅褐色时，表明灌注良好。</li>
	<li>将灌注液更换为含有胶原酶P的消化液（表1）。</li>
	<li>调整装置（图1A）以进行消化步骤。按照图1B所示进行消化液的循环灌流，最长持续15分钟。 
	注意：当肝组织样本消化充分时，必须立即停止灌注。消化良好的标志是：用刮勺轻压组织时，其被膜变形后无弹性回弹现象。</li>
</ol>
4. 肝细胞的分离（1 小时）
<ol>
	<li>关闭蠕动泵，将肝组织样本放入玻璃皿中。用冰冻的终止液（表 1）冲洗组织样本外表面。从肝组织样本上取下套管。使用解剖刀在套管连接区域的中部切开肝组织样本，注意保持格利森氏囊完整。</li>
	<li>冲洗组织样本内表面，然后用冰冻的终止液完全覆盖整个组织样本。轻轻振荡组织，以释放细胞。</li>
	<li>收集细胞悬液，并通过纱布漏斗（内衬纱布的塑料漏斗）过滤至 50 ml 塑料离心管中。向肝组织样本中继续添加终止液，直至总体积达到 500 ml。</li>
	<li>将细胞悬液在 50 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。收集上清液用于后续非实质细胞的分离。用 PBS（图 2A）洗涤细胞沉淀。</li>
	<li>再次将细胞悬液在 50 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。收集上清液，并将沉淀重悬于肝细胞孵育培养基中（表 2，图 2B）。</li>
	<li>使用台盼蓝染色法测定所得细胞悬液中的细胞数量和活力。在纽鲍尔计数室中计数活细胞与死细胞。利用以下公式计算原代人肝细胞（PHH）的数量、活力和得率。 
	 
	得率（计数细胞数）= 计数细胞数 × 稀释倍数 × 细胞悬液体积（ml）× 10,000 
	 
	得率（肝细胞/(g 肝组织样本)）= （得率（肝细胞/ml 培养基）× 细胞悬液体积（ml））/ 肝组织样本重量（g） 
	 
	活力（%）= 100% × （活细胞数）/（总细胞数）</li>
</ol>
5. 肝细胞的纯化（1 小时）
注意：如果细胞活力低于70%，建议进行此纯化步骤。
<ol>
	<li>所有操作步骤均需在冰上进行。通过混合5 ml密度梯度溶液与15 ml PBS，配制25%密度梯度溶液，用于密度梯度离心。</li>
	<li>从富含肝细胞的细胞悬液中，小心缓慢地将最多5000万个细胞加至25%密度梯度液的上层，确保两层之间形成清晰界面（图2C）。将离心管小心放入离心机，于4 °C条件下以1,250 × g离心20分钟，不启用刹车（图2D）。</li>
	<li>吸除剩余的细胞悬液及位于界面处的死细胞。根据脂肪含量的不同，可能还需吸除密度梯度溶液。 
	注意：低脂含量的原代人肝细胞（PHH）会形成致密的沉淀，此时可将密度梯度溶液完全吸除；而高脂含量的PHH形成的沉淀较为松散，大量活细胞可能仍保留在沉淀上方的密度梯度溶液中。</li>
	<li>用PBS重悬肝细胞沉淀，于4 °C条件下以50 × g离心5分钟。合并细胞沉淀，再次用PBS洗涤，并将纯化的PHH重悬于肝细胞孵育培养基中。按步骤4.6所述进行细胞计数。</li>
</ol>
6. 肝细胞的培养
<ol>
	<li>通过包被细胞外基质（例如大鼠尾胶原蛋白（I型胶原蛋白））来准备用于原代人肝细胞（PHH）接种的细胞培养皿。按照Rajan et al.17建立的方案制备大鼠尾胶原蛋白。</li>
	<li>用PBS将大鼠尾胶原蛋白储备液按1:200稀释。将100 µl/cm2的大鼠尾胶原蛋白溶液加入培养皿中，确保整个表面被覆盖。在室温下孵育细胞培养器皿20分钟。吸除残留的大鼠尾胶原蛋白溶液。</li>
	<li>在涂有大鼠尾胶原蛋白的培养皿中，以Hepatocyte Incubation培养基接种15 × 104个肝细胞/cm2。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养至少4小时。4小时后肝细胞已贴壁，此时可更换培养基。</li>
	<li>根据实验设计进行后续研究。建议培养48小时，以使细胞从分离过程中充分恢复。</li>
</ol>
7. 非实质肝细胞的分离（1.5–2 小时）
<ol>
	<li>将收集的上清液（步骤 4.5 和 4.6）在 72 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，以去除残留的红细胞和肝细胞。合并上清液后进行两次离心，获得两个细胞沉淀：第一次在 300 × g、4 °C 离心 5 分钟，用于沉淀肝星状细胞（HSC）、肝窦内皮细胞（LEC）及部分库普弗细胞（KC）；第二次在 650 × g、4 °C 离心 7 分钟，用于沉淀剩余的 KC。</li>
	<li>合并两个细胞沉淀，用 HBSS 重悬。通过将密度梯度液与 PBS 混合，配制 25% 和 50% 的密度梯度液，用于密度梯度离心（25% 密度梯度液：5 ml 密度梯度液 + 15 ml PBS；50% 密度梯度液：10 ml 密度梯度液 + 10 ml PBS，参见图 2）。将 25% 密度梯度液小心地叠加在 50% 密度梯度液之上。</li>
	<li>将非实质细胞（NPC）悬液缓慢而轻柔地加在 25% 密度梯度液的液面上，确保两层之间形成清晰的界面。</li>
	<li>将细胞悬液在密度梯度上以 1,800 × g、4 °C 离心 20 分钟，离心过程中不启用刹车（图 2.2）。</li>
	<li>吸除最上层的死细胞和细胞碎片。非实质细胞（NPC）位于 25% 与 50% 密度梯度层之间的界面处（图 2）。收集该界面处的 NPC，用 HBSS 洗涤，并按照上述双次离心步骤（步骤 7.2）对细胞悬液进行离心洗涤。</li>
</ol>
8. 枯否细胞的分离（贴壁分离步骤）（1 小时）
<ol>
	<li>按照步骤 4.6 所述方法对 NPC 组分中的 KC 进行细胞计数（悬浮液中 KC 的形态参见图 3B）。采用上述双次离心步骤（步骤 7.2）离心 NPC 组分，并用 Kupffer 细胞接种培养基（表 2）重悬 NPC。</li>
	<li>将含有 KC 的组分以 5 × 105 KC/cm2 的密度接种于塑料细胞培养器皿中。将 KC 培养物置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 20 分钟。原代 KC 可在短时间内黏附于细胞培养塑料表面（图 2.3）。</li>
	<li>收集未黏附的 NPC 上清液，其中主要含有 LEC 和 HSC。合并上清液，用于后续 LEC 的分离（见第 9 节）和 HSC 的分离（见第 10 节）。用 HBSS 洗涤已黏附的 KC，并将其在 Kupffer 细胞培养基（表 2）中，于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中进行培养。</li>
</ol>
9. 内皮细胞的分离（1.5 小时）
<ol>
	<li>将收集的上清液（步骤 8.5）在 300 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。用 PBS 洗涤沉淀。再次在 300 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟后，将细胞重悬于星形细胞/内皮细胞分离培养基中，并按照步骤 4.6 所述方法对所有剩余细胞进行细胞计数。</li>
	<li>将 1 × 107 个细胞重悬于 1 ml 星形细胞/内皮细胞分离培养基中，加入 MACS 试剂盒中的 20 µl 封闭液和 20 µl CD31 微磁珠用于免疫标记，将所得悬液在 4 °C 下孵育 15 分钟（图 2.4）。</li>
	<li>按照磁性激活细胞分选系统 MACS 的制造商说明书所述方法，将肝淋巴内皮细胞（LEC）与肝星状细胞（HSC）分离（图 2.5）。洗脱磁性保留的 CD31 阳性 LEC，并将其悬浮于星形细胞/内皮细胞培养基中（表 2）。</li>
	<li>按照步骤 4.6 所述方法对 LEC 进行细胞计数。将 LEC 以 1.25 × 105 个细胞/cm2 的密度接种于经大鼠尾胶原包被的细胞培养器皿中（参见步骤 6.1）。在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养细胞。</li>
</ol>
10. 星状细胞的分离（0.5 小时）
<ol>
	<li>在MACS过程中，未标记的肝星状细胞（HSC）会通过分离柱。收集HSC组分（参见步骤9.5，图2.5）。按照步骤4.6所述进行细胞计数。</li>
	<li>将HSC以5 × 104 个细胞/cm2的密度接种于涂有大鼠尾胶原的细胞培养容器中，使用肝星状细胞/内皮细胞培养基（表2），在37 °C、5% CO2的湿润化培养箱中进行培养。</li>
</ol>
<img alt="灌流液配方表，浓度、pH值及实验配制步骤。" src="/files/ftp_upload/53069/53069table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1： 灌流液与分离液。
<img alt="肝细胞、枯否细胞、星状细胞培养基成分表：浓度" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2： 培养与分离培养基。

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</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

已发表的实验方案描述了一种从同一样本人类肝组织中同时高质量、高纯度分离纯化原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC），即库普弗细胞（KC）、肝星状细胞（HSC）和肝窦内皮细胞（LEC）的技术。大多数关于肝细胞分离的研究仅针对上述细胞群中的一种18-20，而使用人源组织进行的分离操作则较为罕见（Damm et al.对此进行了综述）21。将原本建立于动物组织（e.g., 大鼠肝脏）的方法应用于人肝组织时，发现动物与人类细胞群在细胞特性上存在多个差异。在建立涵盖多种肝细胞类型的分离方法过程中发现，由于实质细胞与非实质细胞在消化时间上的需求不同，将两者分离过程相结合是一个关键步骤。为应对这一挑战，我们开发了一种肝细胞分离方案，整合了多种技术，并将其适配于我们既有的PHH分离方案10。
通过在含有胶原酶P的溶液II中添加10% FCS，我们能够降低蛋白酶的蛋白水解活性。该改进使得更长时间的消化成为可能，这对于获得大量NPC是必要的。因此，我们能够同时分离出高质量且高产量的PHH和NPC。...

人类肝脏组织具有高度复杂性，由两种不同的细胞实体组成：实质细胞和非实质细胞（NPC）。肝脏实质细胞包括肝细胞和胆管上皮细胞。肝细胞占肝脏细胞总数的60%至70%，负责执行大部分肝脏代谢功能，&#160;例如胆汁酸和补体因子的合成、生物转化以及能量代谢2,3。
非实质细胞（NPC）占肝脏总细胞的30-40%。NPC包括多种细胞群体，即库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）。这一异质性细胞组分在肝脏的生理过程中发挥着核心作用。此外，NPC还参与介导急性肝损伤&#160;，例如药物性肝损伤（DILI），以及在肝硬化等慢性肝损伤中发挥作用4。
近年来，人肝细胞在药物测试、药物开发以及肝病中新生化通路鉴定等研究中变得越来越重要。体外测试中，原代人肝细胞（PHH）单层培养仍被视为&#34;金标准&#34;5。当前同型肝细胞模型的主要局限性在于肝细胞在数天内即发生去分化并丧失功能4。三维（3D）培养技术的建立表明，这些局限性可以得到弥补4,6。然而，即使是现代的3D培养技术，也无法完全再现所有肝毒性作用模式7。现有体外模型中非实质肝细胞（NPC）群体的缺失，被认为是导致与体内情况存在差异的可能原因。已有研究表明，不同肝细胞群体之间的细胞间通讯在生理稳态以及病理生理过程中均起着核心作用8。因此，科学界对NPC及其细胞间相互作用的关注日益增加。在共培养和组织工程系统中有目的地利用这些细胞，可能是满足对尽可能接近体内状态的体外肝模型高需求的一种解决方案8,9。
目前主要的挑战是开发一种标准化的人肝共培养模型，该模型包含明确定义比例的原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC）。因此，需要建立针对高度异质性肝细胞的分离技术，并优化这些方法以获得高纯度的细胞群体。尽管已有标准化的PHH分离方案10，但人源NPC的标准化分离仍处于发展阶段。大多数已发表的NPC分离方案均基于非人源细胞的实验11,12。仅有少数文献描述了人源NPC的分离过程，且其中大多数仅涵盖单一细胞类型的分离方法11-16。目前用于细胞分离的最重要细胞特性包括细胞大小、密度、贴壁行为以及表面蛋白的表达。基于这些特性，我们此前在《实验生物学与医学》（Experimental Biology and Medicine）期刊上发表了一种简化的分离方案，可用于分离PHH、库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）1。鉴于该技术受到广泛关注，本文旨在提供更为详细的肝脏细胞分离操作流程，包括配套视频，以便更易于重现该技术。本方案还包括用于评估细胞得率和活力的质量控制方法，以及利用特异性免疫染色进行细胞鉴定和纯度评估的方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;通用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-培养箱</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流台</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Varifuge 3.0R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿液烧杯</td><td>Sarstedt</td><td>2041101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 注射器泵</td><td>B.Braun</td><td>12F0482022</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶过滤器</td><td>Nalgene</td><td>1058787</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 聚丙烯圆锥管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 聚丙烯圆锥管</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>533047</td><td>24 孔</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>BD Biosciences</td><td>357525, 357551, 357543</td><td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>SARSTEDT</td><td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td><td>100 &amp;micro;l, 200 &amp;micro;l, 1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分离设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Carl Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环恒温器</td><td>Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chner 漏斗</td><td>Haldenwanger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料漏斗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带橄榄头的套管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>12068760</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 计数板</td><td>Optic Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞刮</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>Charit&amp;eacute; Universit&amp;auml;tsmedizin Berlin</td><td>A2013027</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Fuhrmann</td><td>40013331</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Gammex PF</td><td>1203441104</td><td></td></tr><tr><td>组织胶</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 P</td><td>Roche</td><td>13349524</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 分离液</td><td>Biochrom</td><td>L6145</td><td>密度 1.124 g/ml</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s BSS</td><td>PAA</td><td>H00911-3938</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS</td><td>PAA</td><td>H15 - 002</td><td>不含 Mg/Ca</td></tr><tr><td>Ampuwa</td><td>Plastipur&amp;nbsp;</td><td>13CKP151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>133196836</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基设备&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-005</td><td>低葡萄糖 (1 g/L) (不含 L-谷氨酰胺)</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 1&amp;nbsp;M</td><td>GIBCO</td><td>1135546</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO</td><td>25030-024</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15 - 039</td><td>不含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>GIBCO</td><td>1137663</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>William&amp;rsquo;s E&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>32551-020</td><td></td></tr><tr><td>含 GlutaMAX&amp;trade;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Fortecortin</td><td>Merck</td><td>49367</td><td>8 mg/2 ml</td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td>100 I.E./ml</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FCS)</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫染色设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD 68</td><td>R&amp;D Systems, USA</td><td></td><td>单克隆</td></tr><tr><td>CK 19</td><td>Santa Cruz</td><td>D2309</td><td>多克隆</td></tr><tr><td>CK18</td><td>Santa Cruz</td><td>K2105</td><td>单克隆</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>单克隆</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>单克隆</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23.472-9</td><td></td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG1-PE</td><td>Santa Cruz</td><td>C0712</td><td></td></tr><tr><td>羊抗兔 IgG-FITC</td><td>Santa Cruz</td><td>L0412</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>J.T.Baker</td><td>1104509006</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>Herbeta Arzneimittel</td><td>200-001-8</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

除了实质性的肝细胞外，肝脏还包含非实质细胞（NPC），即库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）。原代人肝细胞（PHH）的二维（2D）培养仍被认为是 &#34;金标准&#34; 用于 体外 药物代谢与肝毒性的测试。众所周知，原代人肝细胞（PHH）的二维单层培养存在去分化和功能丧失的问题。最近研究表明，肝非实质细胞（hepatic NPC）在肝脏（病理）生理学及维持PHH功能方面发挥着核心作用。目前的研究重点在于重建 体内 利用三维共培养模型构建组织结构，以克服二维单层培养的局限性。此前，我们在《实验生物学与医学》杂志上发表了一种分离人肝细胞的方法，并研究了这些细胞用于细胞培养的适用性。1鉴于该技术受到广泛关注，本文旨在提供更为详尽的肝细胞分离操作流程，包括配套视频，以便于该技术的简便重现。
通过两步EGTA/胶原酶P灌注法，从人肝脏组织手术标本中分离人肝细胞。将肝组织灌流液以50 × g离心，初步分离出原代人肝细胞（PHH）与非实质细胞（NPC）。采用密度梯度离心法去除死细胞。利用特定的细胞特性及细胞分选技术，从富集的NPC组分中分离出不同的肝细胞亚群。除分离PHH外，我们还成功分离出库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC），用于后续培养。
综上所述，本方案可从一个供体组织样本中高质量、高产量地分离出原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC）。获得纯化的肝细胞群体有助于建立 体内 类似于人类肝脏模型。

通过密度梯度离心法分离出实质和非实质细胞组分，结合细胞贴壁特性及磁珠分选（MACS）进行纯化处理，可成功分离原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC）。PHH 和 NPC 均可实现高质量和高产量的分离。图1展示了肝脏灌注与消化所用设备的典型配置。在含有胶原酶 P 的灌注液 II 中添加 10% 胎牛血清（FCS），以降低蛋白酶的蛋白水解活性，同时稳定胶原酶 P 的活性。因此，在分离 NPC 所需的较长消化时间条件下，仍可避免对 PHH 活性产生不利影响。
<img alt="肝脏灌注示意图，泵系统，39°C水浴，实验PI与DG设置，废液流出。" src="/files/ftp_upload/53069/53069fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1： 灌注与消化装置示意图。<...

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。

除了实质性的肝细胞外，肝脏还包含非实质细胞（NPC），即库普弗细胞（KC）、肝内皮细胞（LEC）和肝星状细胞……

该方法有助于解答肝病学和毒理学领域的关键问题，并为我们开发新的体外共培养和组织工程肝脏模型提供机会。这种新技术的优势在于能够从同一供体和同一小块肝组织中分离出所有的肝细胞群体。开始该操作时，在无菌条件下称量 freshly dissected 肝组织，并将肝组织样本置于超净工作台中。然后将组织样本表面的血液清洗干净。接着使用1倍灌注液一冲洗套管。利用组织胶将套管的橄榄头固定在较大的血管中。然后，测试灌注情况并检查灌注管是否存在泄漏。随后，使用组织胶将所有渗漏清晰1×灌注液的血管逐一封闭。之后，将插管的肝组织样本放入布氏漏斗中。然后，根据所使用的套管数量和肝组织的阻力，将蠕动泵的流速设置在每分钟 7.5 至 14.6 毫升之间。灌注组织直至完全冲洗出全部血液，灌注时间至少 20 分钟，最长不超过 30 分钟。在某些情况下，可能需要使用塑料夹夹住其中一根套管，或用刮勺轻轻按压肝包膜以增加某一区域的内部压力，从而优化灌注效果。颜色完全由棕红色变为浅棕色或浅黄色，表明灌注效果良好。随后，将灌注液更换为含有胶原酶 P 的消化液，然后重新调整装置以进行消化步骤。接着，循环灌流消化液，持续时间最长可达 15 分钟。定期停止灌注并检查消化程度。当肝组织样本消化充分时，必须立即停止消化液的灌注。待组织完全消化后，将其从装置中取出，并放入玻璃培养皿中。用预冷的终止液冲洗组织样本外表面。从肝组织样本中移除套管。然后，用手术刀在套管连接区域的中部切开肝组织样本，注意保持格利森氏囊完整。用终止液冲洗组织样本内部，然后将整个组织样本浸没在终止液中。接着轻轻振荡组织，以释放其中的细胞。随后收集细胞悬液，并通过纱布漏斗过滤至10个50毫升塑料离心管中。继续向肝组织样本中加入终止液，直至总体积达到 500 毫升。随后，离心细胞悬液，收集上清液用于后续 NPC 的分离，并将细胞沉淀汇集至 250 毫升塑料管中。之后，用 PBS 清洗细胞沉淀。为此，离心细胞悬液。收集上清液，合并沉淀，并将沉淀重悬于肝细胞孵育培养基中。然后，使用台盼蓝染色法测定所得细胞悬液中的细胞数量和活力。为了分离非实质性的肝脏细胞，将收集的上清液离心以去除残留的红细胞和肝细胞。收集上清液并离心两次，以获得用于沉淀肝血窦内皮细胞（HCS）、LEC、部分库普弗细胞（KC）以及剩余KC的细胞沉淀。接着，将沉淀重悬于HBSS中。然后，通过将密度梯度溶液与PBS混合，配制25%和50%的密度梯度，用于密度梯度离心。将25%密度梯度溶液小心地叠加在50%密度梯度溶液层上方。随后，将NPC悬液小心且缓慢地加在25%密度梯度溶液层上方，以实现两层之间的清晰分离。在密度梯度上对细胞悬液进行离心，离心过程中不得破坏梯度层。NPC 位于 25% 与 50% 密度梯度层之间的界面处。吸除最上层的死细胞和细胞碎片，并小心收集界面层。经过两次离心后，对 KC 和 MPC 组分进行细胞计数。随后，采用先前所述的双步离心法对 NPC 组分进行离心，并将 NPC 重悬于枯否细胞接种培养基中。将含有枯否细胞的组分以每平方厘米 5 × 10⁵ 个枯否细胞的密度接种至塑料细胞培养器皿中。将枯否细胞培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 20 分钟。原代KC应在短时间内贴附于细胞培养塑料表面。随后，收集含有未贴壁NPC的上清液，其中主要包含LEC和HSC。为分离LEC与HSC，首先对上清液进行离心。然后，用 PBS 洗涤沉淀。第二次离心后，将细胞重悬于星状细胞-内皮细胞分离培养基中，并对所有剩余细胞进行细胞计数。接着，将一千万个细胞重悬于一毫升星状细胞-内皮细胞分离培养基中。然后，加入20 µL MAX试剂盒中的封闭溶液和20 µL用于免疫标记的CD31微珠，将所得悬液在4°C温度下孵育15分钟。随后，按照磁性激活细胞分选系统MAX的制造商说明书所述方法，将LEC与HSC分离，并收集HSC组分。洗脱磁性保留的CD31阳性LEC，并将其悬浮于星状细胞内皮细胞培养基中。此处这些图像显示了分离后立即在相差显微镜下观察到的不同肝细胞群体。这组图像展示了细胞分离后培养24小时的细胞状态。此处展示了基于免疫荧光的不同细胞组分的表征结果。分离后24小时，原代人肝细胞（PHH）对肝细胞标志物CK18呈阳性信号，库普弗细胞（KC）对标志物CD68呈阳性信号；分离后72小时，肝内皮细胞（LEC）对波形蛋白（vimentin）呈阳性信号，肝星状细胞（HSC）对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性信号。在进行该操作时，需注意成功的细胞分离依赖于肝脏组织样本的充分消化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何控制消化过程以及如何进行密度梯度分离，这两项是该实验流程中的关键步骤。该技术问世后，为医学研究领域的研究人员探索新建立的体外细胞培养和组织工程肝脏模型中的肝功能与肝病铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

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原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

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