协议主要人肝细胞的分离和相应的非实质肝细胞的主要种群

这种方法可以帮助回答肝病学和毒理学领域的关键问题，并为我们开发新的体外共培养和组织工程肝脏模型提供了机会。这种新技术的优点是从同一供体和同一小块肝组织中分离出所有肝细胞群。要开始此过程，请在 stile 条件下称量新鲜解剖的肝组织，并将肝组织样品放入层流罩中。

然后清除组织样本表面的血液。接下来，使用 1X 灌注溶液 1 冲洗插管。使用组织胶将插管的橄榄固定在较大的血管中。

然后，测试灌注并检查套管是否渗漏。随后，用组织胶封闭所有渗出透明 1X 灌注溶液 1 的血管。之后，将空心肝组织样品放入 Buchner 漏斗中。

然后，将蠕动泵的流速设置在每分钟 7.5 到 14.6 毫米之间，具体取决于所用插管的数量和肝组织的阻力。灌注组织，直到全血冲洗出至少 20 分钟，最多持续 30 分钟。在某些情况下，可能需要用塑料夹夹其中一个插管，或者用刮刀轻轻按压肝包膜来增加某个区域的内压，以优化灌注。

从棕红色到浅棕色或浅黄色的完全颜色变化表明灌注良好。之后，将灌注液更换为含有胶原酶 P 的消化液，然后，重新安排消化步骤的设置。随后，对消化溶液进行长达 15 分钟的循环流流。

定期停止灌注并检查消化程度。当肝组织样品被充分消化时，必须立即停止消化液灌注。准备好后，将肝脏从设备中取出，放入玻璃盘中。

用冰冷的终止液冲洗组织样品的外部。从肝组织样本中取出套管。然后，用手术刀切开插管连接区域的中间，打开肝组织样本，并确保 Glisson 囊保持完整。

冲洗组织样品的内部，然后用 Stop Solution 覆盖整个组织样品。接下来，轻轻摇晃组织，以便将细胞从组织中释放出来。然后，收集细胞悬液并通过纱布漏斗过滤到 10 个 50 毫升塑料管中。

向肝组织样品中加入更多的终止液，直到消耗完 500 毫升的最终体积。然后，离心细胞悬液，收集上清液用于稍后的 NPC 分离，并将细胞沉淀汇集到 250 毫升塑料管中。随后，用 PBS 洗涤细胞沉淀。

为此，离心细胞悬液。收集上清液，合并沉淀，并将沉淀重悬于肝细胞孵育培养基中。然后，使用台盼蓝染色测定所得细胞悬液中的细胞数量和活力。

为了分离非实质肝细胞，将收集的上清液离心以消除剩余的红细胞和肝细胞。收集上清液并离心两次，以获得用于沉淀 HCS、LEC、部分 KC 和剩余 KC 的细胞沉淀。接下来，将沉淀重新悬浮在 HBSS 中。然后，通过将密度梯度溶液和 PBS 混合进行密度梯度离心，制备 25% 和 50% 密度梯度。

小心地将 25% 密度梯度溶液放在 50% 密度梯度溶液层的顶部。随后，小心缓慢地将 NPC 悬浮液放在 25% 密度梯度溶液层的顶部，以实现两层的明确分离。在密度梯度上离心细胞悬液，不要中断。

NPC 位于 25% 和 50% 密度梯度层之间的间相中。从最上层吸出死细胞和细胞碎片，并仔细收集间期。双重离心后，对 KC 和 MPC 组分进行细胞计数。

然后，用前面描述的双离心步骤离心 NPC 组分，并将 NPC 重悬于 Kupffer 细胞接种培养基中。将含 KC 的级分以 5 倍 10 至每平方厘米第 5 个 KC 的密度接种在塑料细胞培养容器上。将 KC 培养物在 37 摄氏度 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 20 分钟。

原代 KC 应在短时间内粘附在细胞培养塑料器具上。然后，收集含有主要由 LEC 和 HSC 组成的未粘附 NPC 的上清液。要将 LEC 与 HSC 分离，首先离心上清液。

然后，用 PBS 洗涤沉淀。第二次离心后，将细胞重悬于星状细胞内皮细胞分离培养基中，并对所有剩余细胞进行细胞计数。接下来，将 1000 万个细胞重悬于 1 毫升星状细胞内皮细胞分离培养基中。

然后，加入 20 μL 来自 MAX 试剂盒的封闭溶液和 20 μL CD31 微珠进行免疫标记，并将所得悬浮液在 4 °C 温度下孵育 15 分钟。随后，按照磁激活细胞分选系统 max 的制造商方案中的说明，将 LEC 与 HSC 分离并收集 HSC 分数。洗脱磁性保留的 CD31 阳性 LEC 并将它们悬浮在星状细胞内皮细胞培养基中。

在这里，这些图像在相差显微镜视图中显示了分离过程后直接不同的分离肝细胞群。这组图像显示了培养 24 小时后的分离和培养的细胞。此处显示了不同细胞组分的基于免疫荧光的表征。

分离后 24 h PHH 显示肝细胞标志物 CK18 阳性信号，分离后 24 小时KC 标志物 CD68 阳性，LEC 在分离后 72 小时显示波形蛋白阳性信号，分离后 72 h HSC GFAP 阳性。在尝试此过程时，重要的是要记住，成功的分离取决于肝组织样本的最佳消化。观看此视频后，您应该对如何控制酶解以及如何进行密度梯度分离有很好的了解，这些是该程序的关键步骤。

开发后，这项技术为医学研究领域的研究人员在新创建的体外细胞培养和组织工程肝脏模型中探索肝脏功能和疾病铺平了道路。