Name: 电从新生儿鼠害隔离脑干，脊髓准备允许呼吸中枢网络输出记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 学习从新生大鼠分离脑干脊髓标本并记录呼吸节律的电生理学方法。该技术可用于药理学研究及评估呼吸中枢网络功能，为神经科学研究提供可靠手段。

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作者衷心感谢加拿大卫生研究院（MOP 130258）、儿童健康研究星基金会以及莫莉·托威尔基金会为本研究提供的实验设施和经费支持。作者还衷心感谢Kinkead Richard博士在稿件校对和建议方面提供的帮助。

本方法需使用动物实验对象，已获拉瓦尔大学动物伦理委员会批准（方案编号 # 2012-170）。
1. 设置与准备

<ol>
	<li>溶液
	<ol>
		<li>根据以下配方制备 aCSF 储存液 7,17其他具有浓度变化的配方可在文献中找到。储存储备液于4 °C，最长可保存一个月。
		<ol>
			<li>盐溶液：加入75.39 g NaCl（终浓度129 mM）；2.5 g KCl（终浓度3.35 mM）；0.81 g NaH2PO4（终浓度0.58 mM）；2.33 g MgCl2（终浓度1.15 mM）；1.85 g CaCl2（终浓度1.26 mM）。溶于800 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。</li>
			<li>碳酸氢盐溶液：加入17.65 g NaHCO₃3 （终浓度21 mM）。先溶于900 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。碳酸氢盐浓度的改变将导致pH值的变化。</li>
			<li>葡萄糖溶液：加入54.06 g葡萄糖（终浓度30 mM），溶于400 ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至500 ml。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将100 ml盐溶液、100 ml碳酸氢盐溶液和50 ml葡萄糖溶液加入1 L蒸馏水中进行稀释，配制aCSF。4 °C保存备用。</li>
		<li>通过加热和拉伸玻璃管制备玻璃电极，直至其断裂。使用前将尖端打磨光滑。只要保持清洁，该电极可多次重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验装置 
	注意：设置细节如下所示 图2.
	<ol>
		<li>打开放大器、移动平均器、数据采集系统、温度控制器和泵。检查信号放大倍数（增益 = 10,000）、滤波设置（低频阈值 10 Hz；高频阈值 5 kHz）以及原始信号模数转换的采样率（2.5 kHz）。</li>
		<li>用aCSF填充瓶子，并用碳合气（95% O₂，5% CO₂）通气2，5% CO₂2在记录室（体积5 ml）中以4 ml/min的流速灌注含气泡并预热的aCSF，维持记录室温度为26（±1）°C。在这些标准条件下，pH值应为7.4。</li>
		<li>在解剖室附近准备一个50 ml注射器，内含50 ml室温且通入碳合气（carbogen）的aCSF。</li>
		<li>打开计算机并启动记录软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 解剖
<ol>
	<li>称重并目视确定动物性别（雄性肛殖距较长&#160;，而雌性肛殖距较短&#160;；雄性生殖器通常呈深色，雌性生殖器则呈粉红色）。</li>
	<li>通过以下任一方法对新生啮齿类动物进行麻醉：低温麻醉（将动物完全浸入冰中4–5分钟18）、注射麻醉（按4 ml/kg剂量注射equitensine）19，或吸入挥发性麻醉剂（异氟烷20或乙醚21）。通过观察肢体回缩反射是否消失来确认麻醉深度是否足够。</li>
	<li>将动物腹面朝下置于实验台面上。使用手术刀在前囟（bregma）水平位置（可通过皮肤和颅骨观察到）对头部进行冠状面切割。此步骤应在动物麻醉后立即进行。</li>
	<li>使用手术刀在前肢下方对躯体进行冠状面切割。</li>
	<li>使用手术剪和细剪以及镊子去除皮肤、肌肉、脂肪组织和内脏。由于此阶段骨骼较软，操作时需小心避免损伤神经系统。该步骤在实验台面上进行。</li>
	<li>将制备好的标本放入解剖室中。使用注射器中储存的人工脑脊液（aCSF）对组织进行氧合。从此时起至记录结束，均需使用显微镜进行操作。</li>
	<li>在标本背侧，使用手术剪和细剪及镊子沿中轴线从头端至尾端剪开颅骨和椎骨。打开切开的颅骨和椎骨以暴露神经组织。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。</li>
	<li>使用镊子去除覆盖在神经组织表面的蛛网膜（一层薄膜组织）。保留紧贴神经组织的软脑膜和血管。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。</li>
	<li>将标本背侧朝下放置，用剪刀在固定标本的同时剪断神经和结缔组织，小心地将脑干和脊髓下拉。也可采用背侧入路方式。尽可能保留神经根和神经的长度。去除骨骼以分离出脑干和脊髓。使用注射器中储存的aCSF对组织进行氧合。</li>
	<li>使用手术刀切断小脑及其余头端结构并予以去除。使用针头中储存的aCSF对组织进行氧合。</li>
	<li>根据实验设计需要，可选择使用手术刀在小脑下动脉前方进行冠状切面切除脑桥22。需注意，保留完整脑桥会使大鼠的节律变慢，并完全抑制小鼠的节律。仅包含脑桥尾侧部分的标本可在C4神经根处表现出频率稳定的呼吸样活动。</li>
</ol>
3. 记录
<ol>
	<li>将制备好的标本置于记录室中，腹面朝上。用固定针将标本固定在脊髓最下部和脑干最前端。</li>
	<li>使用通过针头与电极相连的注射器，向外拉动注射器活塞，使电极内产生负压（玻璃尖端直径：150 - 225 µm），从而部分充满人工脑脊液（aCSF）。</li>
	<li>利用显微操作器，小心地将电极靠近第四腹根之一。其他腹根也可能表现出类似呼吸的活动（例如，舌下神经 XII，C1 腹根）。</li>
	<li>通过拉动注射器活塞，在电极储液腔内产生负压，轻柔地吸住神经根丝。然后小心移动电极，使其紧贴脊髓表面。 
	注意：理想情况下，根丝的直径应与电极开口大小相匹配，从而在电极内外腔之间形成密封。由于此类记录通常使用差分放大器，电极内部与记录室之间的任何泄漏都会降低信号质量，并增加背景噪声的去除难度。</li>
	<li>开始记录。</li>
	<li>在常氧条件下（即，用碳合气饱和的 aCSF：95% O2 和 5% CO2）至少记录 20 分钟，以确定标本的基础节律参数。</li>
	<li>将灌流液从碳合气饱和的 aCSF 切换为刺激性 aCSF（即，用 95% N2 和 5% CO2 饱和以产生缺氧刺激），持续 15 分钟。根据实验方案调整刺激持续时间。在记录文件和动物数据表中记录暴露时长。尽可能使用不锈钢管连接 aCSF 瓶与记录室，以避免气体向管外扩散。</li>
	<li>将灌流液重新切换回标准的碳合气饱和 aCSF，至少灌流 15 分钟以进行恢复期记录。在记录文件和动物数据表中记录此过程。</li>
	<li>结束记录。</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>根据整合信号，计算频率（以每分钟脉冲次数表示，单位为 bursts/min）、振幅（基线与脉冲峰值之间的差值，单位为 mV）、脉冲持续时间（脉冲起始到结束的持续时间，单位为 s）以及脉冲面积（整合信号中脉冲曲线下面积，单位为 mV·s）图3).</li>
	<li>在常氧（基线）、低氧（刺激）和低氧后（刺激后恢复）条件下，分别取每种条件下记录的最后5分钟数据进行平均，计算频率、振幅、簇状放电持续时间和簇状放电下面积。每种条件的初始阶段不进行分析，因为在切换灌流液与记录室中人工脑脊液（aCSF）达到均匀混合之间存在延迟。</li>
	<li>表达随后刺激（即， 缺氧）和刺激后（即， 以相应记录的基线值的百分比表示缺氧后恢复值。结果以均值 ± 标准差表示。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何竞争性财务利益或利益冲突。

准确量化呼吸活动可能具有挑战性。事实上，呼吸是一种既可自动进行又可受意识控制的功能，且会根据环境、机体需求、情绪状态和行为而发生调节。该技术的优势在于能够分离出产生呼吸指令的神经元结构。因此，脑干-脊髓离体标本的电生理记录与体积描记法分别作为互补技术，可用于在体外和体内研究完整的呼吸神经网络in vitro和in vivo。在脑干-脊髓离体标本上进行膜片钳记录（例如，从腹侧表面接近）也是可行的，可在保持完整的呼吸神经网络环境中研究特定神经元24。
该方案包含若干关键步骤，主要集中在解剖过程。为避免神经组织损伤，所有解剖操作均应迅速而精确地进行。神经组织不得受损，并须通过持续浸入人工脑脊液（aCSF）中加以小心保护。如前所述，神经根丝与电极之间连接的质量是第二个关键步骤。通过吸吮根丝可使电极更贴近制备样本。虽然电极与脑干之间的接触可提高封接质量，但必须避免造成凹陷或对样本产生物理性损伤。
分析时应始终使用积分信号，但原始信号有助于区分真实的簇状放电与背景...

呼吸是一种由大脑控制的复杂而重要的活动，能够实现氧气（O2）的摄取和二氧化碳（CO2）的排出。中枢呼吸驱动由位于脑干的复杂神经网络产生，在哺乳动物1、两栖动物2、爬行动物3、鸟类4以及鱼类5中均存在。尽管呼吸研究可以在体内（in vivo）进行，但深入的机制性研究需要直接接触呼吸控制网络。为此，Adrian 和 Buytendijk 开发了一种简化版的金鱼模型，通过在脑干表面放置电极，记录与鳃部通气相关的节律活动5。此后，Suzue 于1984年6将该方法改进并应用于新生啮齿类动物。这一模型的出现极大地推动了呼吸神经生物学的发展。由于该技术相对简便，本文所介绍的方法适用于对新生啮齿类动物节律性运动行为及其起源开展广泛的基礎研究。
该方法的总体目标是记录呼吸网络产生的、与吸气活动相关的神经信号，即一种称为“拟呼吸”的呼吸样节律。该方法可广泛应用于多种研究目的，旨在探究野生型7和转基因8动物中吸气活动对呼吸变化或药物干预的响应。由于实验在低温条件下进行，缺乏感觉传入神经，且人工脑脊液（aCSF）中葡萄糖和O2浓度较高，因此有人对所记录信号的生理相关性提出了质疑。尽管体内（in vivo）与体外（in vitro）条件之间存在明显差异（例如，吸气爆发的频率），但呼吸网络核心组分的存在6使得研究与重要稳态功能相关的稳定节律成为可能9,10。
开发和使用该技术的原理在于便于直接接触呼吸网络的脑干组成部分，这些部分在体内极难接近，尤其是在新生儿中。in vivo 条件下，脑干处于严格控制的环境中：所记录的节律不受来自肺部或颈动脉体的外周传入信号的调节，从而可使研究集中于中枢呼吸驱动本身11。因此，可通过该途径施加刺激并记录输出信号。与体积描记法记录相比，呼吸节律受到全身各组成部分（e.g., 肺扩张、外周化学感受器）的调节，难以施加精确的刺激。
在新生大鼠中，该方案包括记录离体脑干和截短脊髓的第四腹根信号，标本置于人工脑脊液（aCSF）中维持。脑干-脊髓制备物产生的节律由单个慢爆发组成，这些爆发与吸气信号相关联。 9分离的脑干-脊髓标本在出生后第0至4天（P0 - P4）的大鼠中易于记录 7该方法常用于评估呼吸网络对低氧的反应，以及对高碳酸血症、酸中毒或药物的反应。本文介绍了一种急性低氧实验方案。该刺激通过撤除O₂2 在aCSF中；该方法常用于评估对缺氧损伤的耐受性和反应性。该方案在第一分钟内即引发节律抑制&#160;直到缺氧暴露结束图1)12该抑制效应在缺氧后恢复期间得以逆转 12关于实验设计，需要注意的是，位于脑干头端的脑桥对节律发生器具有抑制作用 8因此，包含完整脑干和头段脊髓的标本表现出较慢的节律。在分离标本中是否包含脑桥，应根据实验目的来确定。 13；要研究脑桥对延髓网络的影响，需在有脑桥和无脑桥的情况下进行记录，以比较结果 14此外，该技术的一个优势在于可延伸制备样本的吻侧部分，以包含中脑和/或间脑区域。 15,16，从而可以评估这些区域对脑桥-延髓呼吸网络的影响。

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>在通风橱中使用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>碳酰气</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>吸引电极</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>型号 573000</td><td></td></tr><tr><td>差分交流放大器</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>型号 1700</td><td></td></tr><tr><td>移动平均器</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>型号 MA-821</td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统</td><td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td><td>型号 DI-720</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 软件</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 软件</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖室</td><td>塑料盒（例如培养皿）即可</td><td></td><td></td></tr><tr><td>记录室</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>底座</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>底座</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录可实现神经呼吸网络输出信号的监测

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

尽管已知中枢呼吸驱动位于脑干，但其基本功能、发育过程以及对刺激的反应仍有许多方面尚未完全阐明。为了克服在完整动物体内难以接触脑干的困难，可分离脑干及部分脊髓进行研究。该标本被置于人工脑脊液中，其中气体浓度、成分和温度均受到控制并持续监测。呼吸神经网络的输出信号通过放置在第四腹根上的吸吮电极记录。通过这种方式，可直接向脑干施加刺激，并直接记录其效应。所记录的信号与经由膈神经传递至膈肌的吸气信号相关，表现为规律性爆发活动（约每分钟8次爆发）。通过对这些爆发活动（包括频率、幅度、持续时间及曲线下面积）的分析，可精确表征刺激对呼吸神经网络的影响。该方法的主要局限在于标本在出生后早期阶段之外难以维持活性。因此，该技术主要集中于研究新生大鼠中不受外周输入影响的完整呼吸网络。

如引言中所述，该技术最重要的优势之一是能够直接接触脑干以施加各种刺激。例如，本实验中应用了低氧刺激。 图1.A.B. 展示了完整实验方案的记录，包括常氧和低氧条件。 图1.C.E. 显示在常氧条件下记录的节律（即，用95% O₂混合气体饱和的aCSF2 和5% CO2 在 26 °C）。如先前在此完全相同的制备中已证实的那样 11，频率约为每分钟8次爆发，振幅约为0.800 mV。需要注意的是，由于不同样本之间存在显著差异，振幅仅具有参考意义。上部曲线表示积分信号，下部曲线表示原始信号。 图1.D.F. 显示在缺氧条件下记录的节律（即，用95% N₂混合5% CO₂饱和的aCSF2 和5% CO₂2 在 26 °C）。如先前所描述的那样23在缺氧期间，频率显著降低。 图1.G.H. 显示单次爆发，呈现常氧...

中枢呼吸驱动位于脑干。通过在第四腹根放置电极，可记录离体脑干-脊髓自发产生的呼吸运动输出。该实验方法对于研究药物作用、评估呼吸挑战以及遗传操作对节律性运动行为的影响具有重要价值。

尽管众所周知中枢呼吸驱动位于脑干，但其基本功能、发育过程及对……的反应等方面仍有许多问题有待阐明。

本实验的总体目标是在不同条件下，记录脑干呼吸神经核团在缺乏外周传入信号时所产生的节律。该目标通过以下步骤实现：首先去除大鼠的颈部和上背部组织，以暴露位于其中的脑干；第二步是分离神经系统，并移除颅骨和椎骨。接着，将电极置于第四腹根并开始记录。最终，通过离体脑干和脊髓的电生理记录，利用这些制备标本展示脑干在不同刺激下产生的节律性活动。该方法有助于解答呼吸研究领域的一个关键问题，例如该分子是否参与呼吸节律的调控。生成R对照组旨在观察药物干预对呼吸神经元核团的作用效果。开始实验时，将一只麻醉后的新生大鼠放置于培养皿上。立即用手术刀在 bgma 水平处沿冠状面切除头部的吻侧部分。然后在前肢冠状面以下去除其身体部分。接下来，去除覆盖在颅骨上的皮肤、肌肉和脂肪组织。随后，去除黏性物质，并注意不要损伤神经系统。然后将标本转移至解剖室。将解剖室置于显微镜下。随后使用注射器将充氧的 A 型人工脑脊液（A CSF）施加于标本的背侧以进行氧合。沿中轴线切开颅骨并打开，以暴露神经组织。对椎骨执行相同的步骤。然后用充氧的 A 型人工脑脊液（A CSF）灌注以氧合标本。随后将标本背侧朝下放置。在固定好标本的同时，仔细切断神经和结缔组织，以分离脑、脑干和脊髓。然后去除小脑及剩余的吻端结构。在此步骤中，将神经组织置于记录室中，使其腹侧朝上，并用大头针固定于脊髓的最下部和脑干的最吻端部分。向制备好的组织施加充氧的人工脑脊液（A CSF）。随后，去除覆盖在神经组织表面的薄层组织——蛛网膜。注意不要损伤神经组织的软脑膜及其血管。接下来，用人工脑脊液（A CSF）填充电极。使用显微操作器小心地将电极放置在第四腹侧根附近。用注射器轻轻抽吸神经根丝。然后将带有神经根丝的电极贴附于脊髓上。随后，在常氧条件下记录神经组织产生的电生理活动，持续至少20分钟。为确定制备样本的基线参数，将灌注液从通入碳酰气的A型人工脑脊液（A CSF）更换为缺氧刺激用A型人工脑脊液（hypoxia stimulus A CSF），并记录15分钟。之后，再将灌注液恢复为标准的碳酰气饱和溶液。继续向人工脑脊液中通入气泡，并至少再记录15分钟，然后结束记录。以下是来自正常氧、低氧及低氧后恢复条件下P4大鼠脑干-脊髓标本C4腹侧神经根记录的呼吸输出信号。此为整合后的信号，此为原始信号。以下是发育后每种条件下放大记录的单个爆发波形。该方法为呼吸研究领域的科研人员探索新生儿呼吸调控和呼吸节律产生过程中涉及的神经元群及分子机制提供了有效途径。

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

电从新生儿鼠害隔离脑干，脊髓准备允许呼吸中枢网络输出记录

用于电生理研究的新生小鼠脊髓分离示例。...

脊髓电生理学

演示用于记录新生啮齿类动物脊髓电生理信号的细胞外吸吮电极的制备与使用方法...

脊髓电生理学 II：细胞外吸吮电极的制备

本视频演示了对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行的电生理记录。将标本置于记录槽中，在含氧和缺氧条件下，通过脊髓的第四腹根记录来自脑干的吸气爆发活动。...

新生啮齿类动物脑干-脊髓标本的电生理记录

本文描述了一种用于暴露新生大鼠腹侧颅骨的手术方法。利用该方法，可在麻醉的幼鼠脑干上进行开颅，以开展急性电生理记录和双光子显微成像实验。...

一种在新生啮齿类动物腹侧颅骨上制作颅骨开窗的方法

该方法可在生理相关的脑状态期间以及完全消除持续电活动后（导致脑电静息状态）对单个神经元进行持久的体内细胞内记录。在动物过渡至人工昏迷状态的过程中，其生理常数被严密监测。...

诱导等电位脑状态以研究内源性突触活动对神经元兴奋性的影响 In Vivo

我们展示了如何制备幼鼠脊髓的斜切片。该制备方法可用于刺激腹根。...

斜向脊髓切片的制备用于腹根刺激

本文介绍了一种用于在自由活动的新生癫痫幼犬中记录脑电图（EEG）的新技术，并详细描述了该技术的操作步骤、特点及其应用。该方法可实现持续超过1周的脑电图记录。...

使用一种新方法在自由活动的新生大鼠中记录脑电图

本研究介绍了在乌拉坦麻醉条件下对超直接通路进行多部位体内电生理记录的方法学。...

急性麻醉大鼠超直接通路局部场电位与多单元活动的体内电生理记录

本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。...

自由活动大鼠皮层局部场电位、心电图、肌电图与呼吸节律的同步记录

本方案以可视化方式展示了脑干-脊髓制备过程，并全面、分步详解了脑干横切片的制备方法。该方案旨在提高实验可重复性，并增加成功获取存活时间长、具有节律性活性、可用于记录脑干呼吸区神经输出信号的脑片的可能性。...

新生啮齿类动物脑干-脊髓节律性活动体外制备及薄片制备

本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。...

固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

学习从新生大鼠分离脑干脊髓标本并记录呼吸节律的电生理学方法。该技术可用于药理学研究及评估呼吸中枢网络功能，为神经科学研究提供可靠手段。

对新生啮齿类动物离体脑干-脊髓标本进行电生理记录可实现神经呼吸网络输出信号的监测

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