Name: 生物膜制作的溶剂辅助脂质双分子层（SALB）方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习溶剂辅助脂质双分子层方法制备支撑生物膜，用于研究膜蛋白和脂质特性。该技术简化传统流程，适用于药物发现和分子诊断领域。

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作者希望感谢新加坡国家研究基金会（NRF -NRFF2011-01 和 NRF2015NRF-POC0001-19）、新加坡国家医学研究理事会（NMRC/CBRG/0005/2012）以及南洋理工大学对 N.J.C. 的支持。

1. 在亲水性固体基底上形成支撑脂双层
<ol>
	<li>通过将相应脂质粉末（预先用分析天平准确称量）溶解于异丙醇溶液中，制备浓度为 10 mg/ml 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和浓度为 1 mg/ml 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)（Rh-PE）脂质储备液。</li>
	<li>将储备液在异丙醇中稀释并混合，以制备所需最终浓度的脂质混合物。用于荧光显微镜和荧光漂白后恢复（FRAP）实验时，脂质混合物中应包含 0.5 wt% 的 Rh-PE。</li>
	<li>将异丙醇中的脂质混合物注入微流控通道，直至完全充满。</li>
	<li>让脂质混合物在玻璃表面孵育约 10 分钟。</li>
	<li>使用蠕动泵以极低流速（10–50 µl/min）逐步用水或缓冲液替换脂质溶液。或者，可通过反复移液方式替换脂质混合物。</li>
	<li>用过量缓冲液彻底冲洗通道，以去除残留的异丙醇。</li>
</ol>
2. 富含胆固醇支撑膜的形成
注意：固体表面（SiO2）支持囊泡融合，但膜组成（高胆固醇）会抑制囊泡融合，因为富含胆固醇的囊泡具有较高的弯曲刚度30。
<ol>
	<li>通过将相应的粉末溶解在异丙醇中，制备含有10 mg/ml DOPC脂质、10 mg/ml胆固醇和1 mg/ml Rh-PE的储备溶液。</li>
	<li>使用步骤2.1中制备的储备溶液，重复步骤1.2-1.6。</li>
</ol>
3. 膜流动性检测
<ol>
	<li>将载玻片浸入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（1%）中 10 分钟。</li>
	<li>用去离子水彻底清洗载玻片，并用乙醇冲洗。</li>
	<li>使用温和的氮气气流吹干载玻片。</li>
	<li>将载玻片置于氧气等离子体腔室中，在最大射频功率下进行 30 秒的氧气等离子体处理。</li>
	<li>使用镊子去除无底商用微流控腔室底部的保护膜涂层，并将载玻片粘附到腔室的粘性面（图 1A 和 图 1B）。</li>
	<li>将连接器和管路组装到腔室的进样口和出样口位置，并将微流控通道放置在显微镜载物台上（图 1C）。</li>
	<li>在微流控通道内形成荧光标记的支持性脂双层 [重复步骤 1，使用所需的脂质组成（例如，0.5 mg/ml DOPC），并在有机溶剂中包含 0.5 wt% Rh-PE]。</li>
	<li>使用 60 倍油浸物镜（NA 1.49）定位脂双层平面，以采集图像。</li>
	<li>采集两张漂白前图像，然后使用 532 nm、100 mW 的激光束对直径 30 µm 的圆形区域进行光漂白。光漂白前需预热激光器，直至其强度稳定。光漂白后立即开始，每隔 1 秒采集一次图像，持续 2 分钟，以追踪漂白区域荧光强度的恢复过程。</li>
</ol>
4. 胆固醇定量检测
<ol>
	<li>将二氧化硅涂层石英晶体传感器芯片置于氧气等离子体腔室中，在最大射频功率下暴露于氧气等离子体中处理30秒。从腔室中取出芯片，并立即将其安装至测量腔室中。</li>
	<li>实验开始前，首先在空气中获取传感器芯片的频率和耗散值，以确认芯片安装正确。
	<ol>
		<li>对于商用Q-Sense E1或E4 QCM-D仪器，运行Q-Soft软件程序，点击“Acquisition”（采集），选择“Setup Measurement”（设置测量）。</li>
		<li>在弹出的新窗口中，选中3、5、7、9、11和13次谐波，然后点击Find and Run（查找并运行），以检查共振谱。将温度设定为24 °C。若一个或多个共振频率与预期值不符，需检查芯片安装情况，并重复此步骤直至结果一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动蠕动泵，以100 µl/min的流速将缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5）注入测量腔室。</li>
	<li>在软件程序中，点击“Acquisition”（采集），选择“Restart Measurement”（重新开始测量），以记录共振频率和能量耗散信号。重复此步骤，直至频率和耗散偏移达到稳定基线。注意：此后各步骤中将出现额外的频率和耗散偏移，可记录其随时间的变化。</li>
	<li>注入异丙醇（不含脂质）持续10分钟。</li>
	<li>注入DOPC脂质与胆固醇按所需摩尔比混合的溶液，总脂质浓度为0.5 mg/ml，溶剂为异丙醇，持续10分钟。</li>
	<li>以100 µl/min的流速注入缓冲液持续20分钟。</li>
	<li>注入用缓冲液配制的1 mM甲基-β-环糊精（MβCD）溶液（流速100 µl/min），直至频率信号达到稳定值。</li>
	<li>测量由MβCD处理步骤引起的相对正向频率偏移，并利用Sauerbrey方程将Δfcho和ΔfDOPC值转换为质量值，从而计算胆固醇和DOPC脂质的质量[Δm = -(C/n)×Δf，其中C=17.7 ng/cm2，n：谐波次数]。</li>
	<li>根据DOPC脂质（786.1 g/mol）和胆固醇（386.6 g/mol）的分子量，计算SLB中胆固醇的摩尔分数。</li>
</ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
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作者声明无竞争性财务利益。

本研究介绍了一种溶剂交换方案，该方案将溶于醇类（异丙醇、乙醇或正丙醇）中的脂质与固体基底孵育，随后逐步用缓冲水溶液替换醇类溶剂，从而驱动一系列相变过程，最终形成层状脂双层结构24。结果表明，该方法能够在诸如金等难以通过囊泡融合法构建支撑脂双层的表面成功制备支撑脂双层。
已确定在迄今为止测试的标准实验条件下，形成完整双层膜的最佳脂质浓度范围为0.1–0.5 mg/ml。当脂质浓度低于0.1 mg/ml时，会形成离散的、显微可见的双层膜小片。另一方面，当浓度在0.1 mg/ml以上且低于0.5 mg/ml时，可形成完整且均匀的双层膜。当脂质浓度超过此范围时，荧光漂白恢复（FRAP）分析证实仍可形成流动性的双层膜，但荧光显微镜观察显示双层膜上方存在额外的脂质结构。引人注目的是，通过QCM-D分析确定，这些额外脂质结构的形态取决于孵育步骤中使用的醇类。在乙醇的情况下，相对较高的Δf 和 ΔD 频移特征与吸附囊泡层在QCM-D中获得的信号相似。当改用异丙醇或正丙醇时，Δf 略高于双层膜预期值（最终 Δf 在-30至-40 Hz之间），而ΔD 明显更高。对于延伸的脂质结构，预期会出现此类QCM-D响应（例如，从膜表面向外延伸的蠕虫状胶束（在某些情况下可通过荧光显微镜观察到）。
溶剂交换速率是另一个重要参数，尤其在较低脂质浓度下，该参数可能至关重要。例如，0.1 mg/ml）被使用。在低脂质浓度下快速溶剂交换可能导致不完整双层膜的形成。在本文所用的QCM-D标准测量腔室（Q-Sense E4测量腔室）中，约100 µl/min的流速适用于高度可重复的完整双层膜形成。对于具有其他几何形状和体积的流动池，最佳流速可能有所不同，必须根据本文建议的步骤通过实验确定。
除了可在难以通过囊泡融合形成支撑脂双层的表面上制备脂双层外，SALB 方法还可避免使用可能发生破裂的脂质囊泡，从而为构建具有复杂组分的支撑膜开辟了途径。作为一个示例性组分，本研究考察了含有高比例胆固醇的脂质混合物。胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要组分，其在膜脂组成中的摩尔分数可高达 45−50 mol%（例如在红细胞中）。因此，即使是一个表示人类细胞膜的简单脂质双分子层模型，也应包含胆固醇。
尽管通过囊泡融合可制备仅含10-15%胆固醇的流体脂双层，但SALB方法能够形成含有高比例胆固醇的流体脂双层（QCM-D测量结果显示最高可达57 mol%）36。然而，当胆固醇含量进一步升高（高达63 mol%）时，观察到条纹状结构的区域37。这些共存的区域呈液态，类似于在气-水界面处胆固醇/磷脂单层相图的β区域中所观察到的结构。
总体而言，SALB 方法被证明是一种形成支撑脂质双层的简单且高效的方法，尤其适用于传统囊泡融合法无法实现的情况。迄今为止，主要采用石英晶体微天平耗散技术（QCM-D）和荧光显微镜来表征通过 SALB 方法形成的支撑脂质双层。展望未来，一系列表面敏感的分析测量技术，包括表面等离子共振（SPR）38、原子力显微镜（AFM）39,40、傅里叶变换红外光谱41、X射线42和中子反射率43，均可用于进一步表征和研究由 SALB 方法制备的简单与复杂双层结构。这些新兴能力为更多科研人员探索人工细胞膜提供了可能，使其能够利用一种简单且稳健的实验方案开展研究。

固相支撑的脂质双层1 （SLB）是一种多功能平台，可保留生物膜的基本特性，如双层膜厚度、二维脂质扩散性以及容纳膜相关生物分子的能力。由于天然细胞膜结构复杂，该简化平台已被证明可作为高效的研究平台 体外 膜相关过程的研究，例如筏状结构的形成2蛋白质结合3病毒与病毒样颗粒结合4,5和细胞信号传导6在固体支撑表面附近形成，SLB 平台可兼容多种表面敏感测量技术，如全内反射显微镜（TIRF）、石英晶体微天平-耗散（QCM-D）和阻抗谱法。
已开发出多种方法用于制备不同类型的支撑脂双层（SLB），包括利用气泡塌陷7和蘸笔纳米光刻技术8制备亚微米尺度的脂质斑点，旋涂法9用于制备脂双层堆叠结构，以及朗缪尔-布洛杰特（Langmuir−Blodgett, LB）10和囊泡融合（vesicle fusion, VF）11方法用于制备完整覆盖的单层脂双层膜。VF方法包括将小单层囊泡吸附到固体基底上，随后自发破裂并融合形成连续的脂双层结构。然而，在生理条件下，囊泡的自发破裂主要局限于二氧化硅、玻璃和云母等硅基材料。此外，对于含有高比例胆固醇或带负电荷脂质等复杂脂质组成的囊泡，其破裂通常不会自发发生。根据具体体系的不同，可通过进一步优化实验条件来诱导囊泡破裂，例如调节温度12、溶液pH13、盐度14、渗透冲击15或施加压力16，或添加Ca2+ 17 等二价离子。另一种方法是引入具有膜活性的AH肽，以破坏吸附囊泡层的稳定性，从而在多种表面上诱导囊泡破裂并形成脂双层18-22。
此外，成功的双层膜形成需要制备出大小均一、结构可控的单层小囊泡群体，而这一过程可能耗时较长，且对于某些膜组成而言难以实现。因此，尽管该方法在理想条件下具有较高的效率（例如，经过囊泡的多次冻融预处理后23），囊泡融合的广泛应用受到合适底物和膜组分范围的限制。
溶剂辅助脂质双层（SALB）方法24-28是一种无需脂质囊泡的替代性制备技术。该方法基于在存在水溶性有机溶剂的条件下，将脂质分子沉积到固体表面，随后通过逐步用缓冲水溶液置换该有机溶剂，从而触发支撑脂质双层（SLB）的形成。在溶剂置换过程中，随着水相比例的增加，脂质、有机溶剂和水组成的三元混合体系经历一系列相变，导致体相溶液中形成层状相结构，并在固体基底上形成SLB。重要的是，这种自组装路径避免了囊泡破裂的必要性，而囊泡破裂通常是吸附囊泡转化为SLB过程中的限速步骤。该方案适用于多种表面，包括二氧化硅、氧化铝、铬、氧化铟锡和金。本文及配套视频中，对SALB法与囊泡融合法在脂质沉积方面的应用进行了比较。特别讨论了实验参数（包括脂质浓度、流速以及所选水溶性有机溶剂的种类）对SALB法所形成双层膜质量的影响。所制备SLB的分析表征采用石英晶体微天平耗散监测（QCM-D）、荧光显微镜以及荧光漂白后恢复（FRAP）技术进行。QCM-D监测是一种对表面质量变化敏感的测量技术，自Keller和Kasemo29的开创性工作以来，已被广泛用于定量研究双层膜的形成过程。荧光显微镜可用于检测膜的均一性以及观察膜结构域。FRAP技术是测定SLB中脂质分子侧向流动性的标准工具，而侧向流动性是流体膜的一项关键特性。
本研究的第一部分涉及采用石英晶体微天平耗散监测（QCM-D）技术，分析在二氧化硅和金表面应用SALB法和囊泡融合法尝试形成双层膜的情况。第二部分展示了利用SALB法构建含不同胆固醇浓度的支撑膜并对其进行表征的过程，并将结果与囊泡融合法所得结果进行比较。

<table><tbody><tr><td>QCM-D 二氧化硅涂层基底</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; 瑞典</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D 金涂层基底</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; 瑞典</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Sense E4 模块</td><td>QSense AB,&amp;nbsp; 瑞典</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪，PDC-32G</td><td>Harrick Plasma，纽约州伊萨卡</td><td>PDC-001 (115V)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(丽丝胺罗丹明B磺酰) (铵盐) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>甲基-&amp;beta;-环糊精</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>673773</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>正丙醇</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer 流通池</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; 雄性弯头接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管，内径 1.6&amp;#160;mm</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 No. 1.5H，25 mm × 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

利用溶剂辅助脂质双层（salb）法构建生物膜

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

为了模拟细胞膜，支撑脂双层（SLB）是一种极具吸引力的平台，能够在体外研究膜相关过程的同时，赋予固体基底以生物相容性和生物功能性。in vitro条件下，磷脂囊泡的自发吸附与破裂是形成SLB最常用的方法。然而，在生理条件下，囊泡融合（VF）仅限于特定的脂质组成和固体支持材料。本文介绍一种无需囊泡的一步通用方法——溶剂辅助脂双层（SALB）形成法，用于构建SLB。SALB方法涉及在水混溶性有机溶剂（例如，异丙醇）存在下将脂分子沉积到固体表面，随后通过水相缓冲液进行溶剂置换，从而触发SLB的形成。连续的溶剂交换步骤使得该方法可应用于流通式配置，适用于利用多种表面敏感型生物传感器实时监测脂双层的形成及其后续变化。SALB方法可用于在多种亲水性固体表面（包括那些难以通过囊泡融合实现的表面）上制备SLB。此外，该方法还能制备出无法通过囊泡融合法获得的特定脂质组成的SLB。本文以二氧化硅和金两种典型的亲水表面为例，比较了SALB法与传统囊泡融合法的实验结果。为优化SALB法制备高质量脂双层的实验条件，本文讨论了沉积步骤中有机溶剂种类、溶剂交换速率以及脂浓度等多种参数的影响，并提供了故障排除建议。同时，本文还展示了利用SALB法构建含高比例胆固醇的支撑膜，突显了SALB技术在多种膜结构配置中的广泛适用性。

在亲水性基底上制备支撑脂双层。
在二氧化硅和金表面尝试了VF和SALB的形成方法，并通过QCM-D测量技术实时监测其形成过程。QCM-D仪器可测量共振频率的变化（Δf石英晶体微天平-耗散（QCM-D）技术通过测量压电石英晶体在表面吸附质量时振荡频率的变化，来检测吸附物的质量。此外，QCM-D仪器还测量振荡能量的耗散，以表征吸附层的粘弹性性质（刚性与柔软性）。囊泡融合实验按先前所述方法进行。31简而言之，首先在水相缓冲溶液［10 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.5；（图2A和B)]。接着，将相同缓冲液中的小单层DOPC脂质体注入 t = 10 分钟（箭头 1）至二氧化硅（图2A）和金（图2B）。对于二氧化硅表面的囊泡融合，观察到两步吸附动力学，最终频率变化为 −26（± 1）Hz，能量耗散变化为 0.3（± 0.2）× 10−6，分别。这些数值与支撑脂质双层的形成一致29.
如图2B所示，将囊泡溶液加入金表面后，Δf和ΔD信号分别同时出现下降和上升，直至其值达到−150（± 10）Hz和（7.5 ± 2）× 10−6。这些数值对应于吸附囊泡层的形成。因此，与预期一致，通过囊泡融合方法未能在金表面形成支持性脂双层（SLB）。
通过SALB方法在二氧化硅和金表面形成双层膜的QCM-D分析结果如图2C和D所示。在二氧化硅表面，最终的Δf和ΔD偏移值分别为−25.6（±0.55）Hz和0.4（±0.27）×10−6，这些数值表明已形成支撑性脂质双层膜（SLB）。在金表面也观察到类似范围的Δf和ΔD值（ΔfAu：−27.3±2.7 Hz，ΔDAu：0.48（±0.26）×10−6）。这些结果证明，SALB方法能够在抑制囊泡破裂的表面上实现支撑性脂质双层膜的形成。
溶剂交换流速对支撑脂双层质量的影响。
为了确定通过SALB方法制备高质量支撑脂双层的最优条件，研究了脂质浓度、溶剂交换速率以及有机溶剂选择的影响。
图3展示了在二氧化硅表面进行SALB实验最后一步时，QCM-D频率的变化情况，实验在两种不同的流速（100 和 600 µl/min）以及两种不同的脂质浓度（0.125 和 0.5 mg/ml）下进行。
当使用0.5 mg/ml DOPC脂质时（图3A），双分子层的形成不受流速影响，在两种流速下均获得约−26 Hz的最终Δf偏移。
相比之下，当使用较低的脂质浓度时，在完全溶剂交换后吸附脂质的量显著受到流速的影响（图3B）。在平均流速为100 µl/min时，双层膜形成完全（Δf约为−26 Hz）；然而，在高6倍的流速（600 µl/min）下，双层膜未能完全形成（Δf约为−17 Hz）。这些结果为选择合适的实验条件以成功利用SALB方法结合异丙醇作为有机溶剂形成双层膜提供了指导依据。
在不同醇溶液中由不同脂质浓度形成的支撑脂双层的表征。
脂质浓度是影响SALB方法所获得的SLB质量的另一个参数。荧光显微镜显示，在0.05 mg/ml的脂质浓度下，仅形成孤立的、亚微米级的脂质结构（图4A）。随着SALB实验中使用的脂质浓度增加，脂质结构的荧光强度变得更加均匀。在0.1 mg/ml的脂质浓度下，出现了显微可见的脂质斑块，但这些结构并未覆盖整个视野（图4B）。然而，当使用0.25 mg/ml的脂质浓度时，则形成了均匀的脂质双层（图4C）。因此，形成完整且覆盖整个表面的SLB需要达到最低脂质浓度。
还考察了脂质浓度对SALB实验最终结果的影响，浓度范围更广（0.01至5 mg/ml），并在不同的有机溶剂（异丙醇、乙醇和正丙醇）中进行。SALB实验最后一步对应的Δf和ΔD值如图5所示。
我们根据频率和能量耗散的最终变化来定义双层膜的形成，其范围分别为 -25 至 -30 Hz 和小于 0.5 × 10-6。基于这些标准，形成支撑脂质双层膜的最佳脂质浓度范围被确定为 0.1 至 0.5 mg/ml，该范围在很大程度上与有机溶剂的类型无关。在此上述范围之外所获得的 Δf 和 ΔD 偏移的差异，是由于存在额外的质量（例如，双层膜堆叠）、出现非双层结构形态（例如，囊泡、蠕虫状胶束），以及在基底上存在形态不完整的断裂双层膜岛所致。
尽管通过SALB方法制备受支持的脂双层具有较高的可靠性，但获得高质量脂双层的最佳脂质浓度可能需要根据具体的实验条件进行优化。通常情况下，采用SALB方法形成优质脂双层不仅需要最低脂质浓度，也存在一个上限浓度。最佳浓度范围取决于流速，并可能受到基底材料和脂质组成的影响。根据经验，在许多情况下，我们发现0.5 mg/ml的脂质浓度和100 µl/min的流速是形成均一受支持脂双层的最佳条件组合。然而，由于脂质组成以及流动池几何结构（后者会影响溶剂交换过程中的流体分布）的不同，可能需要进一步优化脂质浓度。因此，我们建议首先以0.5 mg/ml的脂质浓度进行预实验，并利用QCM-D或荧光显微镜技术评估所形成脂双层的质量。如果脂双层显示不完整，则应以10%为增量逐步提高脂质浓度，直至获得满意结果；如果观察到脂双层与额外的脂质结构共存，则应以10%为增量逐步降低脂质浓度，直至达到理想效果。
制备具有不同脂质组成和不同胆固醇比例的支撑脂双层。
接下来，采用 SALB 和 VF 方法制备富含胆固醇的支撑脂双层（SLB）。图6展示了通过 SALB 方法制备的含胆固醇支撑膜的代表性荧光图像（100 × 100 µm）。这些膜由圆形的染料排斥区域组成，周围被具有均匀荧光亮度的连续相包围。随着前体脂质混合物中胆固醇比例的增加，暗区面积随之增大。随后进行荧光漂白后恢复（FRAP）测量，以检测脂双层膜的流动性。FRAP 测量结果显示周围相几乎完全恢复荧光，表明脂质具有侧向流动性，从而证实形成了单层脂双层结构。由于 Rh-PE 优先分布于流动相中，暗区很可能由致密的富胆固醇结构组成。
作为对比，也尝试了采用垂直过滤法（VF法）制备DOPC/Chol双层脂膜。通过囊泡挤出法制备含有不同胆固醇摩尔分数（10 - 40 mol%）的DOPC囊泡。使用Rh-PE脂质（0.5 wt%）作为荧光标记用于成像。图7展示了将含胆固醇囊泡与玻璃基底孵育后形成的结构的代表性荧光图像（100 × 100 µm）。FRAP分析表明，使用含20 mol%或更低胆固醇的囊泡可形成具有流动性的脂双层。然而，使用更高胆固醇比例囊泡制备的样品未显示出荧光恢复，表明存在吸附但未破裂的囊泡。
通过SALB方法在有机溶剂中的前体脂质混合物中或VF方法在水溶液中的囊泡中所加入的胆固醇比例，定量分析最终掺入支撑脂双层中的胆固醇比例。利用QCM-D技术监测脂双层的形成，随后加入MβCD以特异性地从支撑脂双层中提取胆固醇32。由于胆固醇被去除导致的质量损失，引起与SLB相关的频率偏移绝对值（|Δf|）下降。MβCD处理步骤引起的相对正向频率偏移如图8A所示。基于频率偏移计算出胆固醇的摩尔分数，结果如图8B所示。
通过SALB法制备的支撑脂双层中掺入的胆固醇比例与前体脂质混合物中的胆固醇含量几乎呈线性正比关系。有趣的是，采用VF法（囊泡中胆固醇含量高达20 mol%）制备的脂双层中的胆固醇比例显著低于前体囊泡中的含量。事实上，通过VF法获得的脂双层中胆固醇的最高比例仅为约10 mol%。
胆固醇-磷脂支撑脂双层的β双相共存区中条纹超结构的观察。
进一步使用胆固醇比例更高的脂质混合物进行了SALB实验。当采用4:6的DOPC与胆固醇混合物时，观察到均匀的液相逐渐分离为两个共存相，表现为暗色（染料排斥区域）背景上的亮条纹状结构（图9）。已知Rh-PE会被排除在富含胆固醇的区域之外33，因此作为背景出现的主要暗区为胆固醇富集区域。在高胆固醇比例（>50 mol%）下，暗背景上形成微米级亮条纹结构，这与胆固醇/磷脂混合物单层相图中的β区域特征一致34,35。此外，条纹状结构的形成源于较弱的线张力，表明该混合物处于混溶临界点附近。
<img alt="用于流体动力学实验的微流控装置和设置，显示了设备和设计的差异。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 适用于表面辅助脂质双层（SALB）形成的微流控腔室，配置适合落射荧光显微镜观察。（A）商用微流控腔室，（B）粘附侧朝上固定于腔室的玻璃盖玻片，（C）安装在显微镜载物台上的完整装置，管道连接至腔室的进样口和出样口，以及（D）用于控制溶剂交换速率的蠕动泵。通过蠕动泵将溶于异丙醇中的脂质注入测量腔室。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="囊泡融合，溶剂辅助方法；频率与耗散图；二氧化硅、金表面。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图2. 囊泡融合与SALB方法在二氧化硅和金基底上的QCM-D分析。 在脂质吸附过程中，记录了第三泛音（n = 3）的QCM-D频率（Δf，蓝色）和耗散（ΔD，红色）随时间的变化，分别对应于（A 和 C）二氧化硅、（B 和 D）金基底。图 a 和 b 展示了囊泡融合方法：在 t = 10 min 时注入DOPC脂质囊泡（箭头1）。图 c 和 d 对应SALB形成方法。箭头表示依次注入缓冲液（1）、异丙醇（2）、脂质混合物[0.5 mg/ml DOPC脂质溶于异丙醇；（3）]以及缓冲液置换（4）。图 B 中的虚线代表未注入脂质的对照实验。各表面最终的Δf和ΔD值均已标明。示意图展示了根据最终频率和耗散偏移推断出的组装脂质结构。改编自参考文献24，经美国化学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="频率变化图，Δ频率 vs. 时间，流体流速，数据分析，Hz 变化。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 溶剂交换速率对 SALB 形成过程的影响。在二氧化硅表面，采用两种不同的交换速率（100 和 600 µl/min），分别使用（A）0.5 mg/ml 和（B）0.125 mg/ml 的 DOPC 脂质异丙醇溶液，测定了 SALB 方法最后一步（见图 2C中的箭头 4）对应的 QCM-D 频率偏移（Δf）。最终的 Δf 值也已标出，参照的是在水相缓冲溶液中的测量基线。改编自参考文献 24，经美国化学学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示红色荧光下30μm尺度细胞结构的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 完全形成SALB所需的脂质浓度阈值。 使用SALB方法在二氧化硅表面形成的脂质层的落射荧光显微镜图像，所用脂质浓度分别为（A）0.05 mg/ml；（B）0.1 mg/ml；以及（C）0.25 mg/ml。改编自参考文献26，经美国化学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="溶剂对双层膜的影响；异丙醇、乙醇、正丙醇的频率与耗散图。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 脂质浓度和有机溶剂对SALB法形成支撑脂双层膜的影响。 使用不同有机溶剂进行SALB实验时，QCM-D（A）频率和（B）能量耗散随脂质浓度变化的最终结果。绿色虚线表示完整双层膜预期的频率和耗散偏移值（-30 Hz &lt; Δf &lt; -25 Hz 且 ΔD &lt; 1 × 10-6）。改编自参考文献26，经美国化学学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胆固醇含量变化的SALB中结构域形成；荧光显微镜；数据直方图分析。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 采用SALB法在玻璃基底上制备含不同胆固醇比例的支持性脂双层的光漂白后荧光恢复分析。（A-E）使用不同胆固醇比例前体混合物制备的脂双层的荧光显微图像。图像分别在光漂白后立即（上图）和1分钟（中图）采集。图像中心的暗斑对应光漂白区域。比例尺为20 µm。同时展示了各样品中各单个染料排斥结构域的表面积直方图（下图）。改编自参考文献36，经美国化学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="对囊泡进行动态光散射实验；荧光显微镜显示囊泡随时间的稳定性。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 通过囊泡融合法制备的含胆固醇支撑双层膜的FRAP分析。（A-D）使用不同胆固醇摩尔分数（10至40 mol%）的前体囊泡所制备的双层膜的荧光显微图像。图像分别在光漂白后立即（上图）和1分钟（下图）时记录。图像中心的暗斑对应光漂白区域。比例尺为20 µm。改编自参考文献36，经美国化学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂质混合物分析：时间与频率图；胆固醇耗竭与囊泡融合研究结果。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 8"> 
图8. 支持性脂双层中胆固醇摩尔分数的定量分析。（A）将1 mM MβCD注入含有不同胆固醇摩尔分数（0至50 mol%）前体混合物所形成的支持性脂双层后，QCM-D频率的正向偏移。（B）采用SALB法和囊泡融合法制备的脂双层中，胆固醇被耗竭的摩尔百分比与前体混合物或囊泡中胆固醇分数之间的关系。改编自参考文献36，经美国化学会许可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微图像序列；随时间变化的蛋白质聚集，t=0，t=10 min，t=20 min。" src="/files/ftp_upload/53073/53073fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 采用SALB法制备的DOPC/Chol（摩尔比4:6，含0.5% Rhodamine-PE）支撑双层膜中荧光微结构随时间依赖性的演化。 在完全溶剂交换后，均匀相逐渐分离为液-液共存区域。改编自参考文献37，经美国化学会许可使用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53073/53073fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种在固体基底上形成支持性脂双层的实验方案，该方法无需使用脂质体。我们展示了一种一步法，可在二氧化硅和金表面形成脂双层，并可制备富含胆固醇结构域的支持性膜，适用于多种生物应用。

利用溶剂辅助脂质双层（SALB）法构建生物膜

为了模拟细胞膜，支撑脂质双层（SLB）是一种理想的平台，可实现对膜相关过程的体外研究……

本实验的总体目标是采用溶剂辅助脂双层法制备支撑脂膜。该方法有助于解答膜生物学领域的关键问题，例如理解脂质和膜蛋白的基本特性，同时也可推动药物发现和分子诊断等应用。该技术的主要优势在于，能够在许多情况下实现支撑脂质层的逐层构建，而这是传统方法无法实现的。该方法操作简便，且所需样品前处理步骤极少。该技术的应用意义延伸至我们的治疗与诊断领域，因为它能够用于研究膜蛋白等重要的药物靶点。该方法还可用于制备适用于材料科学应用的生物相容性基底。我们最初在讨论传统成膜方法的困难时提出了本方法的构想，该方法将用于向本实验室的研究生逐步传授操作流程。通过将脂质粉末溶解于异丙醇溶液中，配制浓度为10毫克/毫升的DOPC脂质储备液。然后将罗丹明标记的DOPE脂质粉末溶解于异丙醇溶液中，得到浓度为1毫克/毫升的脂质储备液。将储备液用异丙醇稀释并混合，配制成用于荧光、显微镜观察及光漂白后荧光恢复（FRAP）实验的所需脂质混合物，终浓度为0.5 wt% 的R域标记DOPE应包含在脂质混合物中。将含异丙醇的脂质混合物注入微流控通道，直至完全充满。让脂质混合物在玻璃表面孵育约10分钟。盐交换应在极低流速下进行，否则双层膜的质量会较差。使用蠕动泵以极低流速逐渐用水或缓冲液替换脂质溶液。随后用过量缓冲液彻底冲洗通道，以去除残留的异丙醇，从而形成富含胆固醇的支持膜。首先将DOPC、胆固醇脂质和标记有罗丹明的DOPE脂质的相应粉末溶解于异丙醇中，配制储备液，然后重复之前的相同步骤进行膜流动性测定。先将玻片浸入1%十二烷基硫酸钠（sodium ESAL sulfate）溶液中10分钟，随后用去离子水彻底清洗玻片，并用乙醇冲洗。使用氮气的温和气流吹干载玻片。然后将载玻片置于氧气等离子体腔室中，在最大射频功率下暴露30秒。接着，用镊子去除无底商用微流控腔室的保护膜，并将载玻片粘附到腔室的粘性面。将连接件和管路组装到腔室的进样口和出样口位置，并将微流控通道置于显微镜载物台上。通过使用所需的脂质组成（包括0.5 wt%的罗丹明标记DOPE脂质有机溶剂），在微流控通道中制备荧光标记的支撑脂双层，方法与之前相同。接下来，使用60倍油浸物镜定位脂双层平面。为进行成像，首先在光漂白前采集两张预漂白图像。将激光器预热至光强稳定。随后使用532纳米、100毫瓦的激光束对一个直径30微米的圆形区域进行光漂白。光漂白后立即进行下一步操作。每秒采集一次图像，持续两分钟，以追踪漂白区域的荧光恢复及荧光强度，从而进行胆固醇定量分析。首先，将涂覆二氧化硅的石英晶体传感器芯片置于氧气等离子体腔室中，在最大射频功率下暴露于氧气等离子体中30秒。从腔室中取出芯片，并立即将其安装至测量腔室中，在本实验中使用Q Sense E4 A4通道石英晶体微天平。获取传感器在液体和空气中的频率与耗散值，以确保正确安装。为此，请运行 qof 软件程序。点击“acquisition”（数据采集），在弹出的新窗口中选择“setup measurement”（设置测量），并选中 3、5、7、9、11 和 13 次泛音。然后点击查找并运行。为检查共振谱，将温度设定为24摄氏度。待样品正确固定后，启动蠕动泵，并通过软件程序以100微升/分钟的流速将缓冲液注入测量室，点击采集并选择重新开始测量，以记录共振频率和能量耗散信号。重复此步骤直至获得稳定的基线。针对频率和耗散变化，注入不含脂质的异丙醇持续10分钟。随后注入DOPC脂质与胆固醇的混合物，摩尔比按所需比例设定，总脂浓度为0.5毫克/毫升，溶剂为异丙醇，注入时间为10分钟。接着，以每分钟100微升的流速注入缓冲液20分钟。然后注入用缓冲液配制的1毫摩尔甲基-β-环糊精溶液，直至频率信号达到稳定值。测量甲基-β-环糊精处理步骤引起的相对正频率偏移，并根据文本方案计算结合的胆固醇和DOPC脂质的量。随后，根据DOPC脂质和胆固醇的分子量，计算支撑脂双层中胆固醇的摩尔分数。图中所示为通过SAL方法在玻璃表面形成的含0.5 wt％罗丹明标记的DOPE脂质的A-D-O-P-C脂双层的代表性荧光显微镜图像。光漂白后荧光恢复实验显示几乎完全的荧光恢复，表明脂双层具有侧向流动性。此处展示了采用QCMD技术监测支撑双层膜形成的代表性频率和耗散变化曲线。使用SAL方法后，最终达到了稳定的共振频率变化和耗散变化，对应于平面双层膜的形成，一旦掌握该技术即可实现。如果操作得当，该技术可在30分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用溶剂辅助脂质双层法来制备支撑型生物膜。在尝试该操作过程中，需注意在实验前新鲜配制脂质溶液，并根据您的实验装置优化溶剂交换过程。完成该步骤后，可进一步采用原子力显微镜等其他方法，以回答诸如膜结构域形成等方面的问题。

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