将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

本实验的总体目标是建立一种新型的体外三维神经元网络模型，并将其与微电极阵列耦合。首先，用多聚赖氨酸和层粘连蛋白的混合溶液对微电极阵列（MEA）的中央区域进行预处理，然后用黏附蛋白层粘连蛋白和多聚赖氨酸包被微珠。第二步是将处理后的微珠悬液分配至多孔板中，使其自发组装并形成均匀的单层结构。

该操作流程的第三步是将细胞以每平方毫米2000个细胞的密度接种到MEA的活性区域，以构建二维神经元网络。接种后6至8小时，将悬液从多孔板转移至MEA，使微珠自发组装成六方密排结构。最终，采用共聚焦显微镜观察三维神经网络，并将其与在MEA上培养的传统二维神经元网络进行比较。

与现有的方法（如体外二维BDI细胞培养）相比，该技术的主要优势在于，在二维BDI模型中，细胞体和生长锥被压平，轴突和树突无法向各个方向自由延伸。此外，二维神经网络的电生理动力学以爆发样放电活动为主，而在三维模型中，随机散在的放电活动也同时存在。我们最初产生这一方法的构想，是源于阅读了Sophie Potto于2008年发表在《自然·方法》上的研究论文，该研究使用MICROBITS作为支架构建三维神经网络。

随后，我们改进了该方法，以实现首次三维体外记录。制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体时，按体积比1:9将固化剂与聚合物在培养皿中混合。然后振荡混合物，并将其置于真空室中10分钟，以去除气泡。

为制备PDMS约束装置，先将PDMS材料注入模具中，随后在120摄氏度下烘烤30分钟。PDMS约束装置应呈圆柱形，其外径和内径分别为22.0和3.0毫米，高度为650 µm，在包被前一天完成制备。在体视显微镜下将掩膜与MEA的活性区域对准并贴合，随后将PDMS掩膜置于120摄氏度的烘箱中灭菌。

接下来，将玻璃微珠置于含有70%乙醇的锥形小瓶中灭菌两小时，每隔30分钟旋转一次，以确保所有微珠均得到充分暴露。随后移除小瓶中的乙醇溶液，并用无菌水冲洗微珠两次。然后，用24微升含多聚赖氨酸和层粘连蛋白的混合溶液（浓度为0.05微克/毫升）处理由PDMS掩膜界定的MEA区域中央部分。

将微珠用黏附蛋白、层粘连蛋白和多聚赖氨酸在 0.05 微克/毫升的浓度下进行包被。随后，将微珠置于 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜，以获得稳定且持久的神经元网络。之后，将处理后的微珠悬浮液分配到带有膜插件的多孔板中，微珠将自行组装并形成均匀的单层。

然后向膜的每个孔中加入 0.5 毫升培养基。将其置于 37°C 和 5% 二氧化碳的培养箱中，直至神经元准备进入本步骤的接种阶段。处死一只 E18 孕鼠后，取出大鼠胚胎，然后从每只大鼠胚胎中分离海马组织。

将它们放入冰冻的Hanks平衡盐溶液中（不含钙和镁）。接下来，在37摄氏度下，用含有0.05% DNase的0.125%胰蛋白酶Hanks溶液消化组织18至20分钟。

随后，用移液器吸去上清液。加入含10% FBS的培养基孵育5分钟，以终止酶消化反应。然后吸去含FBS的培养基，并用生长培养基洗涤一次，该培养基补充1% L-谷氨酰胺和10 µg/mL的庆大霉素。

随后，移除培养基，再加入 500 µL 生长培养基，补充 1% L-谷氨酰胺和 10 µg/mL 的庆大霉素。

使用窄口PEs移液管机械性地解离组织沉淀，直至出现乳白色细胞悬液。随后，取少量细胞悬液用培养基稀释，最终体积为2.0毫升。使用血细胞计数板测定获得的细胞浓度。

然后将该浓度按1:5的比例稀释，以获得每微升600至700个细胞的目标细胞浓度。以每平方毫米2000个细胞的密度将细胞接种到由PDMS约束所定义的MEA活性区域上，以构建二维神经元网络。接着，将MEA装置放入37°C、含5%加湿二氧化碳气氛的培养箱中。

为完成三维培养构建的初步步骤，将细胞浓度为每微升600至700个细胞的悬浮液160微升均匀分布于置于多孔板内的微珠单层表面。随后将多孔板放入37摄氏度、5%加湿二氧化碳环境的培养箱中孵育。接种后六至八小时，将含微珠和神经元的悬浮液30至40微升转移至由PDMS约束结构限定的MEA区域。每次转移后，等待约半分钟，以使微珠自组装形成六边形结构。

当所有层均已沉积并在PDMS约束区域顶部自发组装，且上层培养基体积为300微升时，将与MEA耦合的3D结构置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养48小时。此后，加入1毫升含补充物的生长培养基。体外培养三周后，3D结构已稳定，此时即使去除PDMS约束仍可维持结构。

这是一张微电极阵列（MEA）表面偶联的单层微珠的微分干涉差（DIC）图像。黑色圆点的位置代表了电极的空间排布。针对map2的免疫荧光染色所显示的红色信号，反映了神经元树突分支及轴突起始段（ADA）在直接与MEA电极平面偶联的微珠周围的分布情况。

该图像显示了一个Zack序列的最大投影，三维培养物呈现出高度相互连接的网络结构，其中神经元被标记为成熟后有丝分裂神经元中新表达的N蛋白，以及GABA。以下是三维构型下海马神经网络的代表性电生理记录。此外，为二维构型下海马神经网络的代表性电生理记录。

一旦掌握，该操作可在七小时内完成。然而，需要注意的是，由于该操作包含多个在不同日期进行的步骤，因此完成整个操作的时间估计仅作为参考。在尝试该操作时，务必记住首先将一层二维神经元培养物接种到微电极阵列（MEA）的电极上，然后非常小心地将多孔板中的微载体和神经元悬浮液转移至MEA，以构建三维结构。

该技术为计算神经科学领域的研究人员探索网络连接性如何塑造涌现的网络动力学特性奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何构建与微电极阵列耦合的体外三维神经元网络。