三明治样微环境用于调控细胞/材料相互作用

本实验的总体目标是构建类似三明治的培养体系，以在更接近生理状态的三维环境中研究细胞行为。首先，用纤连蛋白等蛋白质准备并包被腹侧和背侧基质，实现这一目标。接着，将细胞接种，类似于标准的二维培养。

然后覆盖背侧基质，使细胞受到腹侧和背侧的共同刺激。最后，可进行如伤口愈合实验等实验操作。最终，这类类似三明治结构的培养物可通过已建立的标准二维培养分析方法进行分析，例如活细胞成像、免疫荧光或细胞提取。

为进一步分析。与现有的三维培养系统相比，该培养技术的主要优势在于能够同时在细胞腹侧和背侧研究材料相互作用中的多种参数，例如形貌、化学性质、刚度以及蛋白质含量，具有高度的多功能性。此外，一些在三维系统中可能受阻的实验操作，如脂质染色、免疫荧光以及细胞提取，在该系统中均可轻松实现。为通过溶剂浇铸法制备聚乳酸（PLLA）薄膜，需在通风橱中操作：将两克PLLA加入100毫升氯仿中，在室温下搅拌约三小时，直至完全溶解。

将不锈钢垫片置于玻璃培养皿中，然后向垫片内加入 200 µL 的 PLLA 溶液。用带有若干小孔的铝箔覆盖培养皿，在室温下静置 30 分钟，使 PLLA 缓慢蒸发。

接下来，将样品在120摄氏度下加热5分钟，以蒸发残留的溶剂。随后，让样品在室温下冷却约30分钟，然后加入18.2兆欧·厘米的水覆盖培养皿中的样品，并在室温下孵育8分钟。孵育结束后，使用刀片将垫圈从培养皿上剥离下来。

然后使用镊子去除垫圈边缘的任何缺陷，并让样品自然晾干。由于聚左旋乳酸（PLLA）可通过水解降解，因此需将样品存放在真空干燥器中，直至实验当天使用。此外，可根据文本方案制备ELLA纤维，并在无菌培养罩内用作背侧基质。

在蛋白包被后，向样品中加入含钙和镁的 docos PBS 或 DPBS，其中 FI nin 的浓度为每毫升 20 微克，在室温下孵育一小时。用 DPBS 将样品洗涤两次，然后保存在含钙和镁的 DPBS 中，直至准备在玻璃盖玻片上接种细胞。将细胞接种后，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育三小时，使细胞贴附于腹侧基质。随后将样品转移至 12 孔板的新孔中。

使用镊子将背侧基质小心地覆盖在细胞上，然后加入 1 毫升培养基。垫圈的重量可防止背侧基质上浮。

将样品放回37摄氏度、5%二氧化碳的环境中，在类似三明治的培养体系中研究细胞迁移，每周更换两次培养基。如前所述，用纤连蛋白包被腹侧和背侧基质后，以高密度将细胞接种于玻璃盖玻片上，孵育样品并让细胞达到汇合状态。接着，使用移液器枪头划伤细胞单层，以形成两个被间隙隔开的细胞群体。

将腹侧培养基质置于适合延时成像且空间足够容纳背侧基质的新孔中。随后用镊子如前所述将背侧基质覆盖于细胞上，并补充培养基。将样品置于延时显微镜下，每20分钟拍摄一次细胞间隙闭合的图像。

使用 Image J 中的 mito BO 等软件分析三明治培养中的间隙闭合。硫酸盐的反应高度依赖于背侧受体被刺激的时间以及背侧相互作用的特性。

与其他三维系统（例如此处所示的水凝胶）类似，当背侧电纺PLLA纤维包被纤连蛋白时可引导细胞排列，而包被非黏附性蛋白（如BSA）时则不能。此外，使用C2C12细胞进行的类似三明治结构的培养表明，普通的背侧PLLA可促进成肌作用水平的提高。这同样取决于背侧的生物学刺激。

由于与不同背侧蛋白的相互作用会导致如本视频所示的分化速率差异，在伤口愈合实验中，以类似三明治结构培养的成纤维细胞呈现出细长的形态，并且迁移距离较短，相较于在二维基质上培养的细胞，其行为更类似于在三维纤维连接蛋白和胶原凝胶中的细胞。与二维培养条件相比，三明治样培养可增强细胞介导的细胞外基质（ECM）重组。

该过程依赖于背部机械刺激和细胞骨架的稳定性。由于使用如BLEs、他汀类等收缩性抑制剂会阻碍该过程。好的，观看完本视频后，您应能清晰掌握如何构建类似三明治的培养体系。该方法可为药物反应和癌症研究构建类似三维的微环境，包括在疾病模型、发育研究以及药物测试中的应用。