Name: 铁磁金属裸支架对血管内皮细胞捕获和保留 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 了解铁磁金属裸支架捕获和保留磁性纳米颗粒标记内皮细胞的技术。该方法利用CAD和FEA设计2205不锈钢支架，并通过猪体内实验验证细胞捕获效果，有助于促进心血管器械的愈合和血液相容性。

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作者感谢Tyra Witt、Cheri Mueske、Brant Newman以及Peter J. Psaltis博士（MBBS，PhD）所做出的宝贵贡献。本研究获得了欧洲区域发展基金－FNUSA-ICRC（编号：CZ.1.05/1.100/02.0123）、美国心脏协会科学家发展基金（AHA #06-35185N）、美国国立卫生研究院（T32HL007111）以及Grainger创新基金－Grainger基金会的资助。

所有动物实验均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
2205不锈钢支架的设计与分析
<ol>
	<li>使用 CAD 设计金属裸支架
	<ol>
		<li>选择“拉伸凸台/基体”特征，创建一个壁厚等于支架杆厚度的拉伸空心圆柱体。</li>
		<li>在与拉伸圆柱体相切的另一个草图平面上设计支架图案。使平面展开图的宽度等于拉伸空心圆柱体的周长。</li>
		<li>使用“包覆”特征将平面图案设计转移到空心圆柱体上。</li>
		<li>以原生格式保存该零件，并另存为 ACIS 格式，以便导出用于有限元分析（FEA）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架模型的有限元分析
	<ol>
		<li>将保存为 ACIS 格式的实体几何模型导入有限元分析（FEA）软件的零件模块中，以进行后续分析。</li>
		<li>在 FEA 软件的零件建模器中，沿同轴方向为支架建模两个解析圆柱体。外圆柱体的初始直径大于支架直径，用于模拟压握器；内圆柱体的初始直径为 1 mm，用于模拟扩张用球囊。</li>
		<li>双击装配建模器中的“实例”树项目，将上述部件按相对位置装配。</li>
		<li>使用 FEA 软件的网格模块，指定单元类型为带缩减积分的 20 节点六面体单元，设定单元尺寸，并对支架进行网格划分。</li>
		<li>在模型树的“相互作用属性”中，分别定义支架与两个圆柱体之间的无摩擦刚性接触对。</li>
		<li>为支架模型赋予 2205 不锈钢的弹塑性应力-应变行为。</li>
		<li>定义边界条件：首先将外圆柱体压缩至 1 mm，以模拟支架的压握过程；随后移除外圆柱体，以模拟压握后支架的回弹；接着将内圆柱体扩张至 3 mm，以模拟支架扩张；最后移除内圆柱体，以模拟支架的弹性回缩。</li>
		<li>在“分析”模型树项目中定义仿真参数，包括分配的处理器数量和内存容量，并运行仿真。</li>
		<li>仿真完成后，打开结果文件（filename.odb），对结果进行后处理，分析主应变，并迭代优化支架设计，使主应变达到 20%，低于材料的失效极限。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 支架的制备及压缩与扩张性能测试
<ol>
	<li>支架制造
	<ol>
		<li>通过在俄亥俄州先锋市的精密加工公司（如 Action Precision Products）对棒材进行枪钻和精密研磨，获得2205不锈钢管。</li>
		<li>将精密研磨后的管材和平面图案支架设计送至伊利诺伊州沃基根市的支架切割公司（如 Laserage Technology Corporation），进行激光切割和电化学抛光。</li>
		<li>将电化学抛光后的支架浸入强酸（50% HCl）中10分钟，随后再浸入碱液（10% NaHCO3）中10分钟，以实现表面钝化。注意：操作化学品时须佩戴适当的防护装备，并在通风橱内进行。最后，用乙醇和去离子水清洗支架。该过程称为酸洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对制造的支架进行压握和扩张测试
	<ol>
		<li>使用手持式压握工具将支架压握到三折球囊上。将支架和三折球囊固定在压握工具中，按下手柄使支架在径向上发生变形，从而压握在球囊上。</li>
		<li>使用显微镜检查压握后的支架，观察压握是否均匀，以及结构是否存在因塑性变形导致的失效迹象。</li>
		<li>通过向三折球囊注水加压，将支架扩张至设计直径3 mm。检查扩张后的支架是否存在微观裂纹及扩张是否均匀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 支架残余磁场的表征
注意：本研究中使用了直径为 2 英寸、高度为 1 英寸的圆柱形磁体。磁体的磁极沿轴向排列，其表面磁通密度约为 1 T。
<ol>
	<li>使用强钕磁铁对支架进行径向或轴向磁化。&#160; 将支架靠近强磁铁约1分钟，以完成磁化。</li>
	<li>若需进行径向磁化，请将支架的一个平面置于磁场方向上，使其直径方向与磁力线平行；若需进行轴向磁化，请将支架置于磁铁的圆柱面附近，使其轴线方向与磁力线平行。支架的剩磁场至少在24小时内保持稳定，但建议在磁化后尽快使用。</li>
	<li>将支架单独安装在玻璃芯棒上，然后将玻璃芯棒装入磁性探测夹具的精密卡盘中。利用磁性探测夹具的XYZ位移平台组件，可将磁性微传感器探头精确定位至支架附近，且不接触其表面（图4）。</li>
	<li>首先将磁性微传感器移至远离支架的位置，测量基线读数，然后利用磁性探测夹具的XYZ位移平台调整探头位置，测量支架表面的剩磁场。</li>
</ol>
4. 磁性细胞捕获研究
<ol>
	<li>获取细胞、使用SPION标记及荧光染料染色
	<ol>
		<li>从猪外周血中分离内皮祖细胞（EOC），方法如所述5,7在T-75培养瓶中培养至约80%汇合度（5×10⁶ cells）6 至 8×106 细胞）</li>
		<li>合成10 nm直径的四氧化三铁（Fe3O4）核心，外覆50 nm厚的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）壳层，如文中所述 8,9.</li>
		<li>将衍生的EOC与SPION在细胞培养基中以200 µg/ml的浓度于37℃孵育16小时 oC.</li>
		<li>轻轻吸除细胞培养基。向培养瓶中加入10 ml磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻晃动后吸除PBS，以此轻柔洗涤细胞。</li>
		<li>用荧光染料（CM-DiI）对细胞进行染色，以便在实验过程中观察。按照制造商说明书操作：将染料以5 µl/ml的浓度加入10 ml细胞培养基中，与细胞在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞，步骤同 4.1.4，随后加入 3 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟，使细胞从培养瓶中脱落。</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 ml锥形管中，用PBS补足体积，于500 × g离心5分钟，以形成细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于PBS中，浓度为1-2×10⁶ cells/mL。6 细胞/ml，并用移液器在锥形管中反复吹打数次以充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 细胞研究
	<ol>
		<li>设计与制造（例如， 3D打印一个简单的夹具，用于将支架固定在玻璃盖玻片表面稍上方的位置。</li>
		<li>使用电磁消磁器对支架进行消磁，或使用强钕磁铁对支架进行径向或轴向磁化。</li>
		<li>将悬浮于PBS中的SPION标记的EOC用移液器加入含有轴向磁化、径向磁化或非磁化对照支架的培养皿中。立即使用倒置荧光显微镜对含有悬浮于PBS中EOC的支架进行荧光成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 体内 动物实验研究
<ol>
	<li>支架植入
	<ol>
		<li>在支架植入前3周，分别从4只健康约克夏猪（体重约50 kg）采集外周血，并按照文献5,7所述方法培养内皮祖细胞（EOC）。</li>
		<li>术前3天开始给予抗血小板药物治疗（每日口服阿司匹林325 mg和氯吡格雷75 mg）。</li>
		<li>在支架植入当天，根据相关机构动物护理与使用指南，通过肌内注射Telazol、Xylazine和Atropine（剂量分别为5/2-3/0.05 mg/kg）对猪进行麻醉。</li>
		<li>进行气管插管，并以吸入1–2.5%异氟烷维持麻醉状态。</li>
		<li>剃除猪颈部腹侧区域的毛发，并在常规无菌条件下进行操作。</li>
		<li>采用标准心脏导管技术，将1枚磁化支架和1枚非磁化支架分别植入右冠状动脉（RCA）。
		<ol>
			<li>动物导管操作应由经过培训的介入心脏病专家执行。通过9 French鞘管进入右侧颈总动脉。</li>
			<li>插入目标冠状动脉并注射含碘造影剂，获取透视图像。</li>
			<li>将直径为0.014英寸的标准冠状动脉导丝置入血管，沿该导丝推送球囊及支架，将支架释放于直径为3–3.5 mm的血管段内。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用导丝球囊阻断支架近端右冠状动脉的血流，随后经中心导管在2分钟内注入约2×106个用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记的自体EOC，细胞悬浮于4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>在额外阻断2分钟后恢复右冠状动脉的血流。</li>
		<li>将动物转移至恢复室，并密切监测直至其完全清醒。</li>
		<li>术后继续给予抗血小板药物治疗（阿司匹林325 mg和氯吡格雷75 mg），直至动物被处死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支架取出与组织学分析
	<ol>
		<li>术后7天，首先按前述方法对动物实施麻醉，随后根据相关机构动物护理与使用指南，静脉注射致死剂量的戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死动物。</li>
		<li>手术取出带支架的动脉节段，将取出的动脉组织置于10%福尔马林缓冲液中固定，至少30分钟。将样本保留在福尔马林缓冲液中以备后续组织学分析。</li>
		<li>将固定后的样本送至具备金属支架组织学处理能力的机构进行处理。在此过程中，样本将被包埋于甲基丙烯酸甲酯中，进行横切面切片，并采用Mallory染色法结合普鲁士蓝染色对铁颗粒进行组织学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们开发了一种磁性支架，既可作为裸金属支架使用，又能吸引SPION标记的内皮细胞。在以往关于磁性支架的研究中，由于缺乏铁磁性支架，研究人员曾采用镍涂层的商用支架，或由磁性材料制成的线圈或网格5,10-14。其他研究团队还利用市售304级不锈钢支架的顺磁性，靶向载有纳米颗粒的内皮细胞3。然而，镍涂层可能引起接受支架植入患者的过敏反应，而顺磁性支架需要外部磁场才能吸引并滞留磁性纳米颗粒3,5。因此，设计和开发具有功能性的铁磁性支架，对于细胞递送及其他临床应用具有重要意义10,15-20。本研究所选用材料——2205不锈钢——具有双相结构，使其呈现弱铁磁性。此外，与用于制造支架的其他不锈钢（如316L不锈钢，其极限应变为70%）相比，2205不锈钢的极限应变较低，仅为30%6,21,22。
基于2205不锈钢的这一新型应用，本研究提供的方案阐述了设计、制造和测试弱磁性支架的方法。首先，参考现有支架结构，开发出一种简化的支架设计图案。有限元分析（FEA）模拟结果表明，为使最大主应变...

植入由不锈钢、钴铬合金和铂铬合金等促血栓形成材料制成的血管支架（包括裸金属支架（BMS）和药物洗脱支架（DES））的患者需要接受抗血小板治疗，以预防血栓形成。BMS 愈合较快，但由于愈合不完全，易发生晚期再狭窄。DES 因愈合延迟，需要长期抗血小板治疗。为防止因不完全或延迟愈合导致的血栓形成而进行的抗血小板治疗会增加出血风险，可能不适用于某些患者1,2。理想的支架应能够快速且完全地愈合，从而避免长期抗血小板治疗和晚期再狭窄。这种完全愈合只有在支架植入后迅速被单层内皮细胞覆盖的情况下才能实现。已研究表明，使用金或其他生物聚合物等生物相容性材料对支架进行涂层可改善抗血栓性能，但这些技术均未能达到如同内皮细胞涂层可能实现的理想血液相容性3,4。
支架植入后可通过募集循环中的祖细胞使其表面覆盖内皮细胞。这种自体接种技术可利用配体和抗体来实现。但该方法受限于循环内皮祖细胞数量较少。一种有前景的策略是在植入后短暂阻断血流期间，将细胞直接输送至支架表面3,5。该策略需要一种能够在血流恢复后仍快速捕获并牢固保留细胞的技术。我们开发了一种利用磁性支架吸引并保留植入后输送的磁标记内皮细胞的技术。为实现这一目标，需要一种具有足够磁性功能的金属裸支架（BMS），以有效捕获并保留磁标记的内皮细胞6。
本文讨论了2205不锈钢支架的设计、制造与测试方法。支架采用计算机辅助设计（CAD）和有限元分析（FEA）进行设计。制造后的支架使用钕磁铁进行磁化，并利用磁阻微传感器探针测量其残余磁场。随后，我们在培养皿中对支架进行了磁标记细胞捕获性能的测试。 体外 实验。最后，对支架进行了测试 体内 通过在4只猪体内植入磁性与非磁性支架，并对支架植入的动脉进行组织学分析。

<table><tbody><tr><td>2205 不锈钢</td><td>Carpenter Technology Corporation</td><td></td><td>圆棒坯料</td></tr><tr><td>Abaqus</td><td>Dassault systems</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>阿托品</td><td></td><td></td><td>处方药</td></tr><tr><td>氯吡格雷</td><td></td><td></td><td>商品名：Plavix。处方药</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Life Technologies</td><td>V-22888</td><td>Molecular Probes，美国俄勒冈州尤金市</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>手持式压接工具</td><td>Blockwise engineering</td><td>M1-RMC</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00011324</td><td>注意：请佩戴防护装备，并在通风橱中操作</td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂</td><td>Piramal Critical Care, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>NdFeB 磁铁 2&quot; 直径 × 1&quot; 厚</td><td>Amazing magnets</td><td>D1000P</td><td>轴向磁化圆盘磁铁，磁极位于平面两端</td></tr><tr><td>经导丝三腔球囊</td><td></td><td></td><td>可使用任何市售的经导丝三腔球囊</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>通常称为 PBS</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO3）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00003528</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Zoetis</td><td></td><td>商品名：Sleepaway（26%）、FatalPlus、Beuthanasia。&amp;nbsp; 仅限持证兽医订购的管制药品</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault systems</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>SpinTJ-020 微型传感器</td><td>MicroMagneitcs Sensible Solutions</td><td></td><td>长探针 STJ-020 微型传感器</td></tr><tr><td>SPION</td><td>梅奥诊所</td><td></td><td>内部合成的纳米颗粒（参考文献：Lee, S. J. 等。磁性三氧化二铁纳米颗粒包封聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)及其在磁共振成像造影剂中的应用。J Magn Magn Mater 272, 2432–2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004)）</td></tr><tr><td>替拉唑尔</td><td>Zoetis</td><td></td><td>仅限持证兽医订购的管制药品</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Gibco，美国纽约州格兰德岛</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer Animal Health</td><td></td><td>商品名：Rompun。仅限持证兽医订购的管制药品</td></tr></tbody></table>

用于内皮细胞捕获与滞留的铁磁性裸金属支架

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

快速实现心血管支架的内皮化对于减少支架内血栓形成以及避免使用抗血小板治疗（从而降低出血风险）至关重要。既往研究已证实，利用磁力捕获并滞留经超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记的内皮祖细胞（EOC）具有可行性。但该技术需要开发一种兼具磁性、生物相容性和机械功能的支架材料，随后进行 体外 和 体内 测试以验证快速内皮化。我们采用计算机辅助设计（CAD）开发了一种由2205双相不锈钢制成的弱铁磁性支架，并通过有限元分析（FEA）进一步优化其设计。该支架的最终设计在机械压握和扩张过程中表现出低于材料断裂极限的主应变。共制造了100个支架，其中一部分用于机械测试、剩磁测量， 体外 细胞捕获研究，以及 体内 植入研究。为验证支架在压缩和扩张循环中是否会发生失效，共测试了10个支架的释放性能。另取10个支架使用强钕磁铁进行磁化，并测量其残余磁性。结果表明，支架所保留的磁性足以在实验中捕获SPION标记的EOC 体外 研究中，通过在4只猪体内分别植入1个磁化支架和1个非磁化对照支架，验证了大动物模型中SPION标记的内皮祖细胞（EOC）的捕获与滞留效果。支架植入7天后取出动脉组织并进行组织学分析。本研究开发的弱磁性支架能够吸引并滞留SPION标记的内皮细胞，从而促进血管快速愈合。

基于有限元分析（FEA）的迭代支架设计（图1）显示，该支架可实现压握和扩张，其主应变为20%，低于30%的极限应变。压握与扩张测试（图2）未发现任何断裂迹象。变形后支架的照片与FEA计算的形变结果高度一致，显微镜图像也未发现裂纹（图3）。根据残余磁场测量结果（图4和图5）可知，SPION标记的细胞优先聚集于轴向磁化支架的弯曲段，而在径向磁化支架中则更均匀地吸附于直段（图6）。组织学图像显示支架支柱附近存在铁染色，证实了在7天植入期间内皮祖细胞（EOC）被吸引并滞留在支架上（图7）。
<img alt="支架扩张过程示意图：从CAD模型到有限元、压握状态、扩张后支架的各个阶段。" src="/files/ftp_upload/53100/53100fig1.jpg" data-altupdatedat="17...

我们的目标是设计、制造并测试用于捕获内皮细胞的铁磁性支架。对10个支架进行了断裂测试，另10个支架进行了残余磁性测试。最后，对10个支架进行了测试 体外 在4头猪体内植入8个支架，以展示细胞的捕获与滞留效果。

快速实现心血管支架的内皮化对于减少支架内血栓形成、避免抗血小板治疗及其相关的出血风险至关重要。

以下实验的总体目标是开发一种铁磁性裸金属支架，该支架能够捕获并保留磁性纳米颗粒标记的内皮细胞。通过使用计算机辅助设计（CAD）和有限元分析（FEA）软件对2205不锈钢支架进行设计，以充分理解支架材料和结构在压握与扩张过程中的力学行为。随后，对制备的支架进行机械压握和扩张，以验证其机械完整性，并研究支架磁性保持能力，从而确认其磁学性能。随后将支架植入猪体内，并递送磁性纳米颗粒标记的内皮细胞，以验证冠状动脉循环中的细胞捕获与滞留情况。结果表明，本研究开发的铁磁性支架能够捕获并滞留磁标记的内皮细胞，该结论基于体内实验中取出的血管组织学分析。该技术的应用前景涵盖多种心血管器械的开发，因为快速内皮化可促进组织愈合并改善血液相容性。通常，初学者由于支架设计过程中涉及的计算机辅助设计（CAD）和有限元分析（FEA）步骤较为复杂，因此在掌握该方法时会遇到困难；同时，细胞培养对初学者而言也可能具有挑战性。由于严格维持无菌环境至关重要，我们希望改进支架的愈合效果，因而提出了利用磁力将活细胞固定到支架上的设想。该方法的可视化演示至关重要，因为支架制备和细胞接种步骤的学习难度较大，这主要源于支架在压握和扩张过程中材料行为的复杂性，以及支架磁性捕获细胞技术的新颖性。首先，使用 CAD 软件创建一个拉伸的空心圆柱体：选择一个拉伸凸台基体特征，并将壁厚设置为等于支架杆的厚度。在与拉伸圆柱体相切的另一个草图平面上设计支架图案。将平面图案的宽度设置为与拉伸空心圆柱体的周长相匹配。使用包裹功能，将平面图案设计转移到空心圆柱体上。将零件以其原生格式保存，同时另存为ACEs格式，以便导出用于有限元分析。为进行有限元分析，将保存为ACEs格式的实体几何模型导入有限元分析软件的零件模块中，以便在软件的零件建模器中进一步分析。创建两个与支架同轴的解析圆柱体。在装配建模器的实例树项目上双击，使用有限元分析软件的网格模块将各零件组装至相对位置。指定单元类型为采用缩减积分的20节点六面体单元。在模型树的相互作用属性中，指定支架的单元尺寸并对其进行网格划分。分别指定支架与两个圆柱体之间的无摩擦刚性接触对。将2205不锈钢的弹性体应力-应变行为分配给支架模型。定义边界条件，首先将外层圆筒压接至1毫米，以模拟压接过程；随后移除外层圆筒，以模拟压接后支架的松弛过程。扩张内筒至三毫米以模拟扩张过程，最后移除内筒以模拟支架的回缩。仿真完成后，打开结果文件并进行后处理，以研究主应变并进行迭代分析。优化支架设计，使主应变达到20%，低于材料的失效极限。在通风橱内按照文本方案切割2205双相不锈钢管并制备支架后，佩戴适当的防护装备，将电化学抛光的支架浸入50%盐酸中10分钟，以酸洗钝化其表面；随后再将其浸入10%碳酸氢钠溶液中10分钟，完成酸洗过程。接着用乙醇和去离子水依次清洗支架。然后进行支架压握性能测试时，取一个支架和一个三折球囊进行操作。使用手持式压接工具，按压手柄以将支架压接至球囊上。在显微镜下检查压接后的支架是否压接均匀，并观察有无损坏迹象；随后通过向三重折叠球囊注入水压，使支架扩张至设计直径3毫米。使用强钕磁铁检查扩张后的支架是否存在显微裂纹及是否均匀扩张。将支架沿直径方向磁化时，用其一个平面接触磁铁，使支架的直径方向与磁场线方向一致。或者，将支架沿轴向磁化时，将其圆柱面靠近磁铁，使支架的轴线与磁场线方向一致。将支架紧贴强磁铁保持约一分钟。进行磁化时，将支架单独安装在玻璃芯棒上，然后将玻璃芯棒装入磁探测夹具的精密卡盘中。利用X、Y、Z位移平台，调整磁探测夹具的组装位置，使磁微传感器探头精确地靠近支架表面但不接触。首先在远离支架的位置测量磁微传感器的基线读数，然后使用X、Y、Z位移平台定位探头，测量支架表面的剩余磁场。按照文本方案所述，从猪外周血中分离获得内皮祖细胞（EOCs）后，将细胞置于T75培养瓶中培养，直至细胞融合度达到约80%。随后，将合成的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（pyon）以200微克/毫升的浓度加入含EOCs的细胞培养基中，在37摄氏度下孵育16小时。轻柔地吸去培养基，向培养瓶中加入 10 毫升 PBS。然后轻轻摇晃并吸去 PBS。将 5 微克/毫升的荧光染料（如 CM DAI）加入 10 毫升培养基中，按照生产商说明书对细胞进行染色，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。用 PBS 轻柔地洗涤细胞，方法同前，然后加入 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，在 37°C 下孵育 5 分钟，使细胞从培养瓶中脱落。将细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中。用 PBS 补充体积至满，倾去上清后，在 500 ×g 离心 5 分钟以沉淀细胞。使用 PBS 将细胞重悬，浓度为每毫升 100 万至 200 万个细胞。针对体外细胞实验，设计并制作一个简易装置，用于将支架固定在玻璃盖玻片表面稍上方的位置。使用电磁退磁器对支架进行退磁处理，或使用强钕磁铁对支架进行径向或轴向磁化。将悬浮于 PBS 中的 SpyTag 标记的 eGFP 卵母细胞滴加到含有轴向磁化、径向磁化或未磁化对照支架的培养皿中。然后，使用倒置荧光显微镜观察支架，将携带内皮祖细胞（EOC）并悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中的支架，在对四只健康的约克夏猪给予抗血小板药物并按照文本方案进行麻醉后，采用标准心脏导管技术，将一枚磁化支架和一枚非磁化支架植入右冠状动脉（RCA）。通过导丝推送球囊扩张导管（over-the-wire balloon），将支架送至目标位置，并暂时阻断RCA近端血流。随后，在两分钟内，经中心导管注入约200万个用s scions标记并悬浮于4 mL PBS中的自体EOCs；再继续阻断血流额外两分钟，之后恢复RCA血流，取出支架并进行组织学分析。根据此处所示文本方案，基于有限元分析（FEA）的迭代支架设计表明，该支架可实现压握与扩张，其主应变约为20%，低于30%的极限应变。将激光切割、电化学抛光的支架压握在球囊导管上，并使用球囊将其扩张至三毫米，未观察到任何断裂迹象。变形支架的图像与有限元分析（FEA）计算的变形结果高度一致，显微镜图像也显示无骨折，这与基于残余磁场测量的预期结果相符。SPY标记的细胞优先被轴向磁化的支架的弯曲段吸引，而对直段的吸引则更为均匀。在径向磁化的支架中，组织学图像显示支架支柱附近存在铁染色，证实了在七天的植入期间内皮祖细胞被支架吸引并滞留。在尝试该操作时，必须理解有限元分析（FEA）和计算机辅助设计（CAD）的概念，若输入参数不当，可能导致错误的支架设计，支架可能过于僵硬或易于发生断裂。通过该方案，还可进行加速疲劳测试和毒性测试等其他方法，以回答支架的长期耐久性和生物相容性等进一步问题。经过数年的研发，我们现已获得一项在猪模型中得到验证的功能性技术。观看本视频后，您应充分了解如何研制一种铁磁性支架，并对磁标记的动脉细胞捕获与滞留进行检测。

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