抑制细菌脓黑色素生成的方法及相应氧化应激敏感性增加的测定

以下实验的总体目标是确定NTBC对P mein产生以及对抗氧化应激敏感性的影响，同时测定抗生素的最低抑菌浓度（MICs）。通过向细菌培养物中添加NTBC，以确定能够减少p黑色素生成的NTBC浓度作为第二步。将细菌培养物分别用NTBC和抗生素处理，从而可判断NTBC处理是否对抗生素的MIC值产生影响。

在NTPC处理的培养物中，通过暴露于过氧化氢来检测其对氧化应激的敏感性。实验结果表明，使用NTPC处理产色素细菌可导致色素生成减少，并增加其对氧化应激的敏感性，而对基于氧化应激反应的抗生素MIC则无影响，分别通过氧化应激斑点平板法和微量稀释MIC测定法确认。与现有的活菌计数法和纸片扩散法相比，氧化应激斑点平板技术的主要优势在于可使用较低浓度的过氧化氢，而无需像其他方法那样使用高浓度过氧化氢。通常，初次使用本方法测定抗生素MIC的研究人员可能会遇到困难，因为移液操作不够精确会导致重复样本之间的变异。

这种变异性可能使得准确确定抗生素的最小抑菌浓度（MIC）变得困难。在进行 MIC 测定前一天，分别在含有和不含抗生素的 LB 培养基中制备待测菌株的培养物。

两种硝基、四三乙基苯甲酰环己二酮，或简称 NTBC。本实验采用 300 µM 的 NTBC 作为代表性浓度。测定 NTBC 适宜浓度的滴定方法详见实验方案文本：将培养物在 37 °C 有氧条件下孵育过夜，次日继续处理。

为 MIC 测定制备含 NTBC 的 LB 培养基和含 DMSO 的 LB 培养基主溶液，用于测试一种抗生素对一种菌株的作用，其中 NTBC 浓度为 600 微摩尔/升，加入体积为 2 毫升 LB 培养基，并混匀。制备 NTBC 主溶液时，NTBC 的添加浓度为 600 µM，因为在加入接种物后该溶液将被两倍稀释。

向2毫升LB培养基中加入等体积的溶剂DMSO，使终浓度达到300微摩尔，混匀，配制成NO NTBC母液。这两种母液将用于制备抗生素储备液，以及用于在96孔板中建立稀释系列。接下来，在LB加NTBC或LB加DMSO母液中配制抗生素溶液。

制备含或不含 NTBC 的庆大霉素（Gentamycin）储存液，浓度为 64 微克/毫升。制备含或不含 NTBC 的卡那霉素（KANAMYCIN）储存液，浓度为 256 微克/毫升。制备含或不含 NTB 的妥布霉素（tobramycin）储存液，浓度为 8 微克/毫升。

将两种抗生素溶液配制完成后，每种抗生素溶液各取 100 微升，加入 96 孔板的 A 行中的四个孔内。例如，庆大霉素应加入 A1 至 A4 孔，卡那霉素应加入 A5 至 A8 孔，妥布霉素应加入 A9 至 A12 孔。向 96 孔板的 B 至 H 行各孔中加入 50 微升 LB 加 NTBC 或 LB 加 DMSO 的母液，确保一个孔板使用 LB 加 NTBC，另一个孔板使用 LB 加 DMSO。使用微量移液器，通过将 50 微升溶液从 A 行转移至 B 行，对抗生素进行两倍系列稀释。混匀溶液后，更换移液器吸头，再将 50 微升溶液从 B 行转移至 C 行。依此操作继续对后续各行进行稀释，直至稀释至 G 行。在稀释 G 行后，从此行中移除 50 微升溶液并弃去。

使用 H 行作为细菌生长的无抗生素对照。在洗涤所有培养物以去除培养基中含有的兰宁后，取出过夜培养物，测定培养物在 600 nm 处的光密度（OD 600），并在 LB 培养基中稀释过夜培养物，使用多通道微量移液器进行操作。

向相应的孔中加入 50 µL 稀释后的细菌培养物。每种菌株和抗生素浓度分别加入三个孔中。向第四个孔中加入 50 µL LB 培养基，作为细菌污染的对照。

用封板膜覆盖96孔板，并于次日在37摄氏度下孵育约24小时。目视检查各孔中是否存在细菌生长。每种菌株三个重复孔中均未见细菌生长的最低抗生素浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。

开始此实验前，需在LB培养基中（根据前述方法，分别添加与不添加NTBC）对拟测试菌株进行过夜培养，于次日使用。制备含有过氧化氢作为氧化应激诱导剂的LB APL平板。首先将LB琼脂瓶熔化，并在室温下冷却培养基至约50摄氏度。

接下来，将过氧化氢直接加入已冷却的培养基中，达到所需的浓度。轻轻摇动烧瓶，使过氧化氢浓度从零到一毫摩尔范围内混合均匀。一毫摩尔是合适的起始浓度。

立即倒入培养皿，并用火焰灼烧表面以去除气泡。每100毫升LB琼脂可制备四块平板。用过氧化氢浓度标记培养皿。

将平板敞开放置在生物安全柜中，开启风机运行30分钟，以去除平板表面多余的水分。平板应在同一天内使用。在平板干燥的同时，进行清洗和测量准备工作。

将过夜培养物的 OD 600 调整为所测试菌株组中最低的 OD 600 值。为此，计算在总体积为一毫升时，将培养物稀释至最低 OD 600 所需的培养物体积。例如，若某培养物的 OD 600 为 3，而该菌株组中最低的 OD 600 为 2.5，则进行如下计算，结果为所需培养物体积为 0.833 毫升：将 0.833 毫升培养物加入一个微量离心管中。

接下来，计算所需 LB 加 NTBC 或 LB 加 DMSO 的体积，以将培养液体积补至 1 毫升。在此示例中，添加量为 0.167 毫升，混匀后涡旋振荡，以维持培养物中 NTBC 或 DMSO 的恒定浓度。在 PBS 加 NTBC 或 PBS 加 DMSO 中对归一化后的过夜培养物进行 10 倍系列稀释。配制 PBS 加 NTBC 和 PBS 加 DMSO 的储备溶液，根据待测菌株数量调整体积，可扩大或缩小规模。每种菌株的一组稀释液中加入 300 微摩尔的 NTBC 或等体积的 DMSO。用 PBS 配制，总体积为 720 微升，将 90 微升 PBS 加 NTBC 或 PBS 加 DMSO 分别加入相应标记为 10⁻¹ 至 10⁻⁷ 系列稀释的微量离心管中。

取10 µL菌液加入相应的10⁻¹稀释管中，涡旋混匀，然后将10 µL的10⁻¹稀释液转移至10⁻²稀释管。每次稀释均需更换移液器吸头，重复此操作直至完成所有稀释步骤。将10⁻³至10⁻⁷稀释度的菌液分别取5 µL，每个稀释度设两个重复，点样于含过氧化氢的LV平板上。

针对每种菌株，使用一个移液枪头。若从最稀释到最浓的顺序点样，需待液体完全干燥后方可倾斜或翻转培养皿。根据菌株的不同，在37 °C下培养培养皿24至48小时。

当出现大小合适的菌落后，使用置于透照仪上方的CCD相机拍摄平板。通过NTBC滴定实验，确定NTBC是否能够降低产p黑色素的p aerogen菌株中p黑色素的产生，并鉴定可消除或减少p黑色素产生的NTBC浓度，以便用于后续的其他检测，如本图所示。NTBC以剂量依赖性方式减少了产p黑色素菌株中PY黑色素的产生，但对不产生p黑色素的菌株的色素生成无影响。

本表格显示了不同肺炎克雷伯菌菌株在有无NTBC处理以及不同抗生素作用下的MIC测定结果，MIC记录为能够抑制细菌生长的最低抗生素浓度。NDBC处理对所测试菌株的抗生素MIC值无影响。对PIO黑色素产生型和非产生型菌株在有无NDBC处理条件下进行了氧化应激反应的点板实验。

0 毫摩尔过氧化氢平板显示，所有菌株均已被适当稀释，并且当产生PIO黑色素的细菌经NTBC处理后，其对氧化应激的敏感性增加。不产生PIO黑色素的NTBC菌株比产生PIO黑色素的菌株对氧化应激更为敏感。观看本视频后，您应能充分理解如何通过检测对氧化应激的敏感性及抗生素最低抑制浓度（MICs），来确定NTBC处理对PIO黑色素产生的影响。