Name: 执行永久远端大脑中与老年大鼠颈总动脉闭塞研究皮层缺血具有持续残疾 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习在老年雌性大鼠中执行永久性远端大脑中动脉闭塞手术的方法，以建立大面积皮层梗死和持续行为缺陷的卒中模型。该方法通过结构磁共振成像确认病灶大小，为研究老年卒中病理机制和治疗策略提供可靠的实验基础。

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我们感谢格拉斯哥大学的 I Mhairi Macrae 教授和 Debbie Dewar 博士，他们热情地接待了 CW 和 DD，并为他们提供了该实验技术的培训。本研究工作获得了欧洲研究理事会（European Research Council）在欧盟第七框架计划（FP/2007-2013）下的资助，项目编号为 309731，授予 LM。此外，本研究还得到了邓希尔医学信托基金（The Dunhill Medical Trust）向 LM 提供的“偶然发现资助”（Serendipity Grant）支持 [资助编号：SA21/0512]。

本方案已获得伦敦国王学院机构指南的批准，并按照英国政府内政部指南及1986年《动物（科学程序）法》的规定实施。不同机构的指南可能有所差异；在实施本方案前，请确保遵守所在机构的相关规定。在接触设备时，为保持无菌操作技术，可将一大块铝箔进行高压灭菌，并用其包裹显微镜和麻醉机等设备的把手部分。也可使用无菌保鲜膜（塑料薄膜）。
1. 准备
<ol>
	<li>在卒中手术前至少 48 小时，让大鼠适应凝胶流质包（兽用恢复凝胶）和软质饲料。由于动物在手术后常出现进食和饮水困难，术前引入这些物品可最大限度减少新奇恐惧。将老年大鼠与木质啃咬块同笼饲养，以降低牙齿过度生长的发生率（见第 6 节）。</li>
	<li>手术开始前，通过高压灭菌（最低 121 °C，15 PSI，持续 15 分钟）对所有手术器械进行灭菌。使用含 1% 氯己定的 70% 乙醇对所有工作表面进行消毒，并在手术全程中使用手术巾并保持无菌操作技术。</li>
	<li>在偏侧前爪对侧的大脑半球诱导病灶。根据每只大鼠术前在 Montoya 楼梯测试15中确定的优势前爪基线（见图 4），将病灶分配至左侧或右侧半球。为简化描述，本文所述操作中以左前爪为优势爪，手术在右侧半球进行。建议使用 Lister Hooded 或 Long Evans 大鼠进行此类行为学测试，因其学习速度快。 
	注意：楼梯测试旨在测量运动系统损伤后精细与粗大技能运动的变化。该装置在中央平台两侧各设有七个台阶。若无法获得楼梯测试设备，可采用圆筒测试作为评估利手的替代方法；但需注意，在该卒中模型中，圆筒测试仅表现出短暂的功能缺陷，因此不适合用于评估治疗后的长期恢复情况。
	<ol>
		<li>在每个台阶的凹槽内放置三粒糖丸（每侧共 21 粒）。将大鼠放入楼梯装置中持续 10 分钟，记录每侧取回和移位的糖丸数量。 
		注意：为纳入术后任务评估，大鼠在基线阶段必须至少取回 75% 的糖丸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>使用16至18月龄（250至400 g）的雌性老年Lister-Hooded大鼠，以1.5 L/min氧气中的5%异氟烷诱导麻醉2. 麻醉诱导后，降低异氟烷浓度，并将其维持在满足手术需求的最低有效深度例如，1.5-2%）。通过面罩为动物输送麻醉剂，并使用废气清除系统以减少外科医生接触异氟烷。
	<ol>
		<li>对假手术组动物执行除开颅术以外的所有操作步骤，因为开颅术本身可能导致行为学缺陷16设计MCAO实验时应考虑实验目标，并决定是否纳入假手术组以控制开颅手术的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术前或围手术期给予镇痛（Carprieve，0.25 mg/kg，皮下注射）。
	<ol>
		<li>加入 1 ml 至 19 ml 无菌 0.9% 生理盐水以制备储备液，按每 300 g 大鼠注射 0.6 ml。优先使用 Carprieve 而非 Carprofen，因为前者在室温下稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剃除右侧半球腹侧颈部区域和颞区的毛发，以暴露皮肤。使用乙醇棉片对手术部位进行消毒。务必遵循当地IACUC关于脱毛的指导原则。 
	<ol>
		<li>在远离操作区域的位置执行此步骤，以尽量减少切口部位的毛发残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大鼠仰卧位放置在覆盖无菌铺巾的软木板上，并置于加热垫上。在头部和颈部已剃毛的区域涂抹利多卡因乳膏。插入直肠探头以监测并维持动物体温在36.5–37.5 °C 配备恒温系统。
	<ol>
		<li>在眼睛上涂抹 Lacrilube 软膏以防止干燥。给予大鼠硫酸阿托品溶液注射（0.05 ml，浓度为 600 µg/ml 溶液，皮下注射）以减少气管分泌物。 
		注意：研究人员应考虑测量血液气体和血压等生理学指标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术开始前，检查后肢足垫夹捏回缩反射和眨眼反射，以确认麻醉完全。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用手术刀于暴露的颈部正中做一条长约2 cm的纵行切口。轻柔地将两侧位于气管外侧的唾液腺向侧方推开。</li>
	<li>在单侧颈总动脉表面的皮肤上，用不可吸收的丝线缝合打环。用丝线轻轻牵开该部位的皮肤，并用手术胶带将其固定于软木板上，以暴露颈总动脉。使用精细镊子仔细钝性分离动脉，使其脱离周围筋膜及迷走神经。
	<ol>
		<li>在此步骤中需小心，避免损伤肌肉或迷走神经，否则会影响摄食、吞咽和呼吸功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露颈总动脉后，使用不可吸收的丝线（5/0）分离颈动脉，先用精细镊子逆行解剖，将颈动脉与迷走神经分开，注意避免接触神经。将丝线穿过血管并环绕一周（暂不打结）后，用外科胶带将丝线两端粘在一起，以防此步骤松脱。随后移除牵拉固定皮肤的缝线。</li>
	<li>另一侧重复上述步骤（第2.7-2.8节）</li>
	<li>将无菌生理盐水浸湿的纱布放入伤口内，以保持组织在手术剩余过程中的湿润。 loosely 缝合皮肤，并在该区域覆盖额外的生理盐水浸湿纱布，以防止进一步脱水。</li>
	<li>将大鼠置于侧卧位，在右侧眼眶与外耳道之间的中点处做皮肤切口。使用最多五个3 mm弹性钩状牵开器将皮肤牵开并固定于软木板上，随后钝性分离颞肌以暴露颅骨。</li>
	<li>在开放部位上方放置一个由拇指旋钮调节的重力驱动生理盐水滴注装置（流速约为2 ml/min），并建立吸引系统，以清除骨碎片并吸除手术暴露区域的少量出血（步骤2.13–2.16）。
	<ol>
		<li>将生理盐水输送管置于靠近耳部的颅骨最高点，吸引管置于最低点。在出血过程中调节轮阀，向该区域补充更多生理盐水，以更清晰地观察出血来源，便于对血管进行电凝，从而缩短动物处于麻醉状态的时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于中风研究的大鼠大脑动脉阻断装置示意图，包含大鼠及光学仪器。" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 永久性远端大脑中动脉阻断模型的手术装置示意图。 图中显示了用于大鼠开颅手术的右侧半球设备设置，插图展示了吸除器和生理盐水滴注装置在颅骨切除部位周围的定位。同时标出了血管结构的关键特征：大脑中动脉（红色）和小脑下静脉（蓝色），阴影区域表示动脉凝固发生的部位。通过在小脑下静脉下方切断大脑中动脉（MCA）来确认阻断效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="13">
	<li>使用牙科钻机和直径为1.6 mm的粗颗粒金刚砂钻头（转速约8,000 rpm），在暴露区域（约5 mm × 5 mm）进行开颅手术，钻孔时应施加环形和侧向压力，避免向下施压。当骨片已磨至完全透明时，用镊子将其移除。</li>
	<li>使用自制的硬脑膜钩（将精细镊子的一端弯曲约180°形成弧形）小心地打开硬脑膜，操作时需避开较大的表层血管，因其较为脆弱，容易破裂。 
	注意：暴露的脑区将显示出大脑中动脉（MCA）；目标节段长度约为2 mm（见图1，插图）。</li>
	<li>使用双极电凝镊，从下脑静脉跨越大脑中动脉处开始，至动脉分叉点，再沿大脑中动脉的尾支进行电凝，直至血管完全闭塞17。建议使用尖端为0.25 mm的斜角珠宝匠电凝镊。
	<ol>
		<li>在闭塞血管过程中，根据需要调节生理盐水灌注流量，以保持该区域冷却，防止电凝镊粘附于血管壁。完全闭塞后，血管呈黑色，且无血流迹象；部分闭塞的血管仍可见血流。</li>
		<li>在此处切断大脑中动脉以确认闭塞完全。使用显微血管剪，在下脑静脉跨越大脑中动脉的下方进行剪断。</li>
		<li>在进入下一步操作前，用浸有生理盐水的纱布覆盖暴露区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大鼠转回仰卧位，重新打开颈部先前松扎的缝线，再次暴露颈总动脉。对与闭塞大脑中动脉同侧（右侧）的颈总动脉，使用丝线结扎永久性结扎；而左侧颈总动脉则使用13 mm不锈钢动脉夹（压力125 g）进行60分钟的暂时性阻断。在此期间，将颈部切口松松缝合，并在其上方覆盖无菌生理盐水浸湿的纱布，以防止组织脱水。</li>
</ol>
<ol start="1" style="margin-left: 40px;">
	<li>注意，由于动物处于仰卧位，其右侧将位于手术者左侧。</li>
	<li>对于假手术组动物，切开颈部腹侧和颞区，分离肌肉以暴露颈总动脉，但不进行阻断。假手术组动物应接受除开颅以外的所有操作步骤，因为开颅操作可能引起行为学缺陷16。为保持其他团队成员的盲法状态（例如，在后续行为学测试中），仍需进行皮肤切口和缝合操作。</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物脑部手术示意图；颈动脉阻断术；标注解剖结构；血管研究。" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 大脑中动脉阻断后行双侧颈动脉阻断。 右侧颈总动脉（CCA）通过在其血管上结扎一根丝线缝合线（5/0）实现永久性阻断（图像左侧）。左侧 CCA（图像右侧）则使用微血管夹阻断 1 小时。手术过程中需注意避免接触双侧迷走神经（白色部分）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<ol start="17">
	<li>在左侧颈总动脉阻断的1小时内缝合颞部切口。</li>
	<li>皮下注射20 ml生理盐水（每侧 flank 注射5 ml）以维持大鼠水分（参见6.2）。</li>
	<li>60分钟后，移除夹子。在周围肌肉局部应用生理盐水，并使用可吸收缝线（4/0）连续皮下缝合颈部切口。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol start="1">
	<li>将大鼠置于31 °C的培养箱中，以从麻醉状态恢复，最长可达4小时。 
	注意：研究人员可根据当地操作习惯选择其他温度和持续时间。</li>
	<li>在24小时时重复给予卡洛芬（Carprieve，0.25 mg/kg），以缓解疼痛。由于所有动物接受相同剂量的卡洛芬，该因素被系统性地控制。卡洛芬的神经保护作用可能微乎其微。</li>
	<li>每日注射生理盐水，以预防脱水，至少在前3天内进行。假设大鼠每千克体重每天需要65 mL液体（每24小时），应确保每只300 g的大鼠每日接受约22 ml液体。</li>
</ol>
4. 梗死的确认
<ol start="1">
	<li>使用结构磁共振成像（MRI）测量梗死体积。 
	注意：另一种方法是使用组织学染色，例如氯化三苯基四氮唑（TTC），该方法此前已与结构 MRI 数据相关联18。然而，该方法仅可用于研究终点，无法进行纵向评估。
	<ol>
		<li>大脑中动脉闭塞（MCAO）诱导后24小时，使用异氟烷（诱导浓度5%，维持浓度1–1.5%）在0.9 L/min医用空气和1 L/min O2条件下麻醉大鼠，将其固定于四通道鸟笼式磁共振线圈（直径43 mm）中，并置于7特斯拉水平磁共振扫描仪内。</li>
		<li>采用快速自旋回波序列获取T2加权图像：回波时间（TE）60毫秒，重复时间（TR）4,000毫秒，视野（FOV）40 × 40 mm，采集矩阵128 × 128，获取约40层厚度为0.5 mm的切片，耗时约8分钟。随后，利用医学影像软件中的重采样功能，将40层切片转换为20层厚度为1 mm的切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在医学图像显示软件中，通过测量20个切片中梗死灶的横截面积来获取病灶体积。将各面积之和乘以切片厚度（1 mm）得到总体积。计算组平均体积及标准差。在计算病灶体积百分比时，还需获取患侧和健侧半球的体积。</li>
	<li>为校正由水肿引起的脑肿胀，使用Gerriets公式18对上述数值进行调整。仅纳入包含皮层且不包含小脑或嗅球的标准大鼠脑图谱19所定义的切片，以避免过度校正，否则可能导致病灶体积为负值。
	<ol>
		<li>卒中手术后8周再次获取T2加权图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 评估神经保护与行为功能恢复的未来研究的样本量计算
<ol start="1">
	<li>进行样本量计算，以估算在未来的假设性神经保护实验中使用两组（对照组 vs. 治疗组）检测三种不同效应大小（25% 降低、50% 降低、75% 降低）所需的最小样本量，该计算采用功效分析软件中实现的a priori算法20。 
	注意：为便于读者使用其自身数据进行类似计算，文中提供了免费功效分析软件的截图（见代表性结果）。请使用以下参数：可接受的假阳性率（i.e.，I 类错误阈值；α）≤0.05，以及检验功效（即 1-β）≥0.80（i.e.，功效大于80%）。相关解释与讨论见下文21。</li>
</ol>
6. 脑卒中手术后老年动物的福利
<ol start="1">
	<li>除带有延长吸嘴以便取用的水瓶外，还需提供大鼠在术前已适应的额外软质饲料和补水凝胶包。此外，在术后最初24小时内，笼内应使用可吸收的恢复垫料代替松散垫料（即，避免使用木屑），并提供额外的筑巢材料。不要使用糊状食物（例如，婴儿食品），因为吞咽困难的大鼠可能会因此窒息。</li>
	<li>术后连续7天每日称量动物体重以监测恢复情况。体重下降是脱水和应激的主要指征。术后最初几天的体重下降主要反映的是脱水情况（而非因进食减少导致的体质量丢失）。</li>
	<li>若老年大鼠出现与手术无关的体重下降，应以等量液体补充丢失的体重，并检查上下门齿。若发现牙齿过长，使用异氟烷（如2.1节所述）对大鼠进行麻醉，并将其置于仰卧位
	<ol>
		<li>将1 ml注射器筒置于牙齿后方以保护软组织。使用手持式圆锯（例如，直径约3 cm）在高速旋转下进行切割，但手部动作应缓慢而稳定（例如，每次切割持续约3秒）。每次切割之间应让大鼠牙齿适当冷却。确保圆锯安装在夹头上时，锯齿朝向与旋转方向一致。建议预先准备单独包装并已灭菌的圆锯头，以应对此类情况。 
		注意：即使长期饲喂硬质颗粒饲料，老年大鼠仍可能出现牙齿过长。我们建议定期检查老年大鼠的牙齿状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若老年大鼠出现与手术无关的体重下降及毛发竖立现象，应与兽医讨论治疗方案，并考虑实施安乐死。此类动物的磁共振成像（MRI）可能显示存在垂体肿瘤（常发生于老年雌性大鼠），该肿瘤无法手术切除且具有致死性。</li>
</ol>

<ol><li>Pendlebury, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underfunding+of+stroke+research%3A+a+Europe-wide+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem.</a> Stroke. 35, 2368-2371 (2004).</li>
<li>Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interventions+for+sensory+impairment+in+the+upper+limb+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke.</a> Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331(2010).</li>
<li>Reep, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rodent+model+for+investigating+the+neurobiology+of+contralateral+neglect%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn+Behav+Neurol%22%5BJournal%5D)">A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect.</a> Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).</li>
<li>Carey, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+touch+impairment+and+brain+activation+after+lesions+of+subcortical+and+cortical+somatosensory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions.</a> Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).</li>
<li>Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Stroke%3A+Pathophysiology%2C+Diagnosis+and+Management%22">Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management</a>. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).</li>
<li>Sacco, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+and+intracerebral+hemorrhage%3A+Natural+history%2C+prognosis%2C+and+precursive+factors+in+the+Framingham+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study.</a> Neurology. 34, 847-847 (1984).</li>
<li>Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHossmann%2C+KA+%22Textbook+of+Stroke+Medicine%22">Textbook of Stroke Medicine</a>. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).</li>
<li>The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Plasminogen+Activator+for+Acute+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke.</a> N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).</li>
<li>Brott, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+Acute+Cerebral+Infarction%3A+Lesion+Size+by+Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography.</a> Stroke. 20, 871-875 (1989).</li>
<li>Lövblad, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+Lesion+Volumes+in+Acute+Stroke+by+Diffusion-Weighted+Magnetic+Resonance+Imaging+Correlate+with+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome.</a> Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).</li>
<li>Norrving, B. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorrving%2C+B+%22Textbook+of+Stroke+Medicine%22">Textbook of Stroke Medicine</a>. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).</li>
<li>Truelsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+incidence+and+prevalence+in+Europe%3A+a+review+of+available+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data.</a> Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).</li>
<li>Ord, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+impact+of+pre-stroke+surgery+on+survival+following+transient+focal+ischemia+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats.</a> J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li>
<li>Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27staircase+test%27%3A+a+measure+of+independent+forelimb+reaching+and+grasping+abilities+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats.</a> J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).</li>
<li>Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+neurochemical+asymmetries+following+unilateral+trephination+of+the+rat+skull%3A+is+this+control+operation+always+appropriate%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate?</a> Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).</li>
<li>Macrae, I. M. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacrae%2C+IM+%22Rodent+Models+of+Stroke%2C+Neuromethods%22">Rodent Models of Stroke, Neuromethods</a>. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).</li>
<li>Gerriets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Quantification+of+Brain+Edema+and+the+Space-Occupying+Effect+in+Rat+Stroke+Models+Using+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging.</a> Stroke. 35, 566-571 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AChE-stained+horizontal+sections+of+the+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates.</a> J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).</li>
<li>Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+power+analyses+using+G%2APower+3.1%3A+tests+for+correlation+and+regression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Res+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses.</a> Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).</li>
<li>Button, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+failure%3A+why+small+sample+size+undermines+the+reliability+of+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).</li>
<li>Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomic+variation+of+the+middle+cerebral+artery+in+the+Sprague-Dawley+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat.</a> Stroke. 24, 2087-2093 (1993).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在啮齿类动物中进行MCAO（大脑中动脉闭塞）是一种常用于模拟人类中风的技术。该模型在实验方案中有一些细节需要注意。首先，实验过程中必须维持动物的体温，因为这会影响梗死面积的大小以及研究中的死亡率。在短暂闭塞右侧颈总动脉（CCA）期间，可能可以停止使用异氟烷，将大鼠置于温暖且安静的环境中，以减少异氟烷暴露，从而提高存活率。研究人员应权衡较短的麻醉时间是否优于额外麻醉诱导所带来的应激。大鼠的血管结构（例如，大脑中动脉的分支）在同一批次及不同批次的动物之间均存在变异22。在启动新研究时，应牢记这一点。可评估不同的颈总动脉闭塞时间（例如，30、45、60 和 90 分钟）。本研究采用 60 分钟的闭塞时间。在其他研究中我们发现，45 分钟的闭塞可产生相似大小的皮层梗死，且有经验性证据表明其存活率有所改善。因此，建议外科操作人员从较短的闭塞时间（例如，30 分钟）开始，观察是否能够获得足够的病灶体积（和/或所需的神经行为缺陷），仅在必要时再逐步延长闭塞时间。与老年大鼠相比，相同闭塞时间下成年大鼠的神经行为缺陷并不持久。
磁共振成像（MRI）可用于判断（在特定阻塞时间后）病灶体积是否符合研究目标。小病灶累及少于40个0.5 mm冠状切片中的10个切片。中等大小病灶累及10至20个冠状切片。大病灶累及20至30个冠状切片。非常大的病灶累及40个切片中的30个以上。根据我们的经验，病灶非常大（超过30个切片）和/或出现中线结构疝出征象的大鼠通常预后较差：此时可考虑缩短阻塞时间。MRI还可用于评估梗死部位：部分梗死位置更偏尾侧，而另一些则更偏头侧。
在分离迷走神经与两侧颈总动脉时需格外小心。脑卒中手术后可能出现啰音（粗糙的呼吸音），这可能与某些动物的神经损伤有关，尽管目前病因尚不明确：根据我们的经验，这些动物的预后极差，通常建议实施人道安乐死。
永久性透热法大脑中动脉阻塞（MCAO）模型在老年大鼠中可产生可重复的皮质梗死灶，并具有可接受的术后存活率。然而，该技术确实需要在体视显微镜下进行侵入性手术。若要使动物术后恢复良好，必须严格维持无菌操作。在暴露并凝固大脑中动脉（MCA）时，需特别注意避免损伤该动脉，同时应尽量减少对皮质表面的损伤，否则暴露的皮质区域可能成为梗死区域的一部分。建议在开展正式研究（例如测试候选治疗方案）之前，尽可能积累操作经验，以建立稳定的操作流程，获得一致的梗死灶，并确定合适的阻塞时间。实验人员应尽可能在每次手术过程中对处理措施进行随机化（即“区组随机化”）。值得注意的是，该模型不涉及大脑中动脉再灌注（除非采用短暂性MCA结扎代替透热法）。老年大鼠在出现大面积皮质梗死时死亡率可能较高，但通过缩短阻塞时间以及尽可能减少全身麻醉的暴露时间，有望降低死亡率。例如，阻塞期间）。使用70% N2O 和 30% O2 作为载体可能允许使用较低浓度的异氟烷：这种降低的异氟烷暴露可能带来更高的存活率。
另一个需要考虑的问题是，动脉粥样硬化是一个渐进的过程，而本方案中我们通过急性颈总动脉闭塞来模拟该病理状态。然而，这种处理所导致的血流显著减少和持续性功能缺损，能够模拟许多脑卒中患者中出现的串联性闭塞。在大鼠中，若不联合颈总动脉闭塞而仅实施远端大脑中动脉闭塞（MCAO），则难以稳定地诱导出脑卒中模型14；此外，若无串联性颈总动脉闭塞，我们发现动物会出现明显的自发性功能恢复，从而无法对脑卒中治疗措施进行长达8周的长期行为学评估。相比之下，我们证明了在老年大鼠中，联合颈总动脉闭塞的远端MCAO可诱导出长期存在的神经功能缺损。
总之，该方法在大鼠中诱导的脑卒中在大小和位置上与人类脑卒中相似，并产生持续性功能障碍，可用于测试新型治疗方法并阐明缺血性脑卒中后的修复机制。

脑卒中目前是全球第三大死因，也是导致残疾的首要原因1。缺血性脑卒中占所有脑卒中病例的80%，常导致皮层梗死，引起感觉（例如，本体感觉）丧失、运动功能障碍以及对受累侧注意力的减退2-4。大脑中动脉（MCA）是源自 Willis 环且来自颈内动脉的最大血管5。MCA 是缺血性脑卒中最常受累的脑血管，该供血区域的卒中占所有缺血性脑卒中的65%6,7。MCA 为皮层和皮层下区域均提供血液供应，MCA 卒中引起的神经功能异常因闭塞的确切位置不同而有所差异7。近端 MCA 闭塞通过豆纹动脉影响深部区域，导致累及皮层和皮层下区域的大面积梗死。相比之下，远端闭塞仅使皮层区域血流中断，通常导致较小的皮层梗死。
在大规模人群研究中，人类脑卒中病灶占同侧半球体积的5-14%8,9；恶性脑卒中占所有脑卒中的10%，可导致更大范围的梗死，常需行去骨瓣减压术以降低颅内压，而病灶较小的患者更有可能存活10。我们展示了一种可重复的模型，该模型产生的病灶在半球中所占比例与许多人类脑卒中相似。
脑卒中是一种异质性疾病；75%的缺血性脑卒中由腔隙性梗死（颅内小血管阻塞所致）、心源性栓塞性脑卒中或大动脉粥样硬化引起，其中大动脉粥样硬化占所有脑卒中的30%。症状性动脉粥样硬化最常发生在颈总动脉（CCA）分叉为颈内动脉和颈外动脉的部位11。
为了模拟中风的病理生理学过程并纳入中风的危险因素，中风的临床前模型应尽可能接近人类疾病状态。92% 的缺血性中风发生在 65 岁以上人群中，其他危险因素包括肥胖、高血压和动脉粥样硬化，如前所述12。为了更好地体现这些危险因素，建议采用能够共享部分自然疾病病理生理特征的模型。在本方案中，我们纳入了高龄以及颈动脉血流受阻这两个因素。
大脑中动脉阻塞（MCAO）的经典模型是通过血管内线栓法实现近端大脑中动脉阻塞，该方法可减少大脑前动脉和大脑中动脉区域的血流。采用该模型时，短暂的阻塞时间主要导致皮层下区域的病灶，而较长时间的阻塞则可能引起更大范围的损伤，累及皮层和皮层下区域，从而导致老年大鼠的死亡率升高。相比之下，我们课题组所采用的模型是通过开颅术暴露并打开硬脑膜，随后使用双极电凝镊对大脑中动脉进行凝血并破坏其一小段血管。该电凝模型改编自Tamura et al.23 于1981年发表的研究，而开颅减压术的使用可能有助于限制颅内压升高——这是闭颅模型的特征之一，因此与某些其他模型相比，本手术模型具有更高的可重复性和更低的死亡率13。为了产生可重复的梗死灶并维持持续性功能障碍，我们按照Chen et al.14 的方法，永久性阻断颈总动脉（CCA）近端，并暂时性阻断其远端。我们采用无创T2加权磁共振成像（MRI）来评估脑梗死的范围与位置，以及感觉运动皮层区域脑肿胀的程度。

<table><tbody><tr><td>卡洛芬</td><td>Norbrook</td><td>Vm No; 02000/4229</td><td>给予 0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>硫酸阿托品</td><td>AmTech</td><td>RXATRINJ-100</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>UHS</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因乳膏（Emla）</td><td>AstraZeneca</td><td>0012901</td><td>在剃毛的颈部和颞区涂抹豌豆大小的一滴</td></tr><tr><td>恒温毯系统</td><td>Harvard Instruments</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>Harvard Apparatus</td><td>723288</td><td></td></tr><tr><td>电凝系统</td><td>Eschmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm 珠宝商用镀层电凝镊</td><td>Eschmann</td><td>8330349</td><td></td></tr><tr><td>精细 Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>手动驱动生理盐水滴注系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacusafe 吸引系统</td><td>INTEGRA BIOSCIENCES</td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>1.6 mm 粗粒金刚石涂层钢磨头</td><td></td><td>K801 104 016</td><td></td></tr><tr><td>手持式牙科钻机</td><td>NSK</td><td>NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>显微血管剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>501790</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血管夹及施夹器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紧凑型异氟烷单气体麻醉系统 K/F</td><td>VetTech Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳钢手术刀片 10 号</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>25 g 针头</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 ml 和 5 ml）</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1 / SS*05SE1</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（0.9% 氯化钠）</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Pl 08828/0178</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Johnson and Johnson</td><td>5000207582502</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>纱布</td><td></td><td></td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>医学影像处理软件包（Jim）</td><td>Xinapse</td><td></td><td>免费软件</td></tr><tr><td>统计参数映射软件（SPM8）</td><td>UCL</td><td></td><td>免费软件</td></tr><tr><td>功效分析软件（G*Power）</td><td>Universit&amp;auml;t D&amp;uuml;sseldorf</td><td></td><td>免费软件</td></tr></tbody></table>

在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉闭塞以研究伴有持续性功能障碍的皮层缺血

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

脑卒中通常发生在患有多种合并症的老年个体中，这些合并症包括颈动脉（或其他动脉）粥样硬化、高血压、肥胖和糖尿病。因此，在动物模型中评估脑卒中治疗方法时，选择具有良好表观效度的模型至关重要。缺血性脑卒中占所有脑卒中的80%，其中大多数发生在大脑中动脉（MCA）供血区域，常引起影响感觉运动皮层的梗死，导致身体对侧持续性瘫痪或轻瘫。本视频展示了一种在老年大鼠中诱导缺血性脑卒中的方法，该方法可导致持续的感觉运动功能障碍和显著的皮层梗死。具体而言，我们使用电凝镊永久性阻断老年雌性大鼠大脑中动脉远端的一小段血管，从而诱导永久性远端大脑中动脉闭塞（MCAO）。随后，对病变同侧的颈动脉进行永久性结扎，并对对侧颈动脉进行60分钟的暂时性阻断。我们通过结构T2加权磁共振成像（MRI）在脑卒中后24小时和8周时测量梗死体积。本研究中，脑卒中后24小时的平均梗死体积为同侧半球的4.5% ± 2.0%（标准差，n = 5），并通过Gerriet公式校正脑肿胀。该模型具有可行性且具有临床相关性，因其能够诱导持续的感觉运动功能缺损，这对于阐明病理生理机制和开发新型治疗策略具有重要意义。

通过开颅手术诱导永久性大脑中动脉闭塞（MCAO），随后使用电凝术凝固并破坏大脑中动脉，同时对同侧颈总动脉进行永久性闭塞，并对对侧颈总动脉进行60分钟的暂时性闭塞。设备设置及闭塞的大脑中动脉示意图见图1，颈总动脉的示意图见图2（上方）。
卒中后的结局在卒中后24小时和8周时进行评估，使用医学图像显示软件中的感兴趣区域（Region of Interest）工具，测量从嗅球前端至脊髓前端共40段、每段0.5 mm厚度的脑切片上的梗死体积。图3A展示了同一只动物在24小时和8周时的代表性T2加权结构MRI扫描图像。梗死区域通过大鼠脑组织中呈现高信号强度的区域来识别；由于T2加权图像中水或血浆表现为明亮的白色区域。已知卒中后水肿和脑肿胀会增加，这一现象可通过T2加权扫描进行测量，并且已与组织学测定的梗死体积相关联18。然而，卒中早期（例如，24小时时）存在的水肿可能导致对最终病灶体积（例如，8周时）的高估，因此我们还采用了Gerriet公式校正后的平均梗死体积数据。图3B显示了24小时未经校正（原始）病灶体积的平均值为62.8 mm3（± 25.4 mm3 标准差，上图）；该体积占病变半球的9.8%（± 4.2% 标准差，中图）。采用Gerriet公式对脑肿胀进行校正后，该值降低至4.5%（± 2.0% 标准差，下图）。
卒中严重程度还通过蒙托亚阶梯实验15进行评估。简言之，动物在大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中手术前接受为期4周的预训练，以获取糖丸；卒中后持续测试8周（图4），以确认存在持续性功能缺陷。将大鼠置于阶梯装置中10分钟，记录其获取的糖丸数量（共21粒），并以百分比形式表示（组均值 ± 标准误）。采用回归分析对数据进行直线拟合。
图5展示了使用梗死体积数据（用于评估候选疗法的潜在效应）进行的样本量计算，该计算通过功效分析软件中的算法完成，采用“两独立样本均值差异（两组）”的t检验方法，并使用了图3B中的（未经校正的）均值和标准差。图5和表1中的信息表明，每组需要12只大鼠，才能在24小时时检测到使梗死体积减少50%的治疗效应；而图6则展示了使用不同动物数量时所达到功效的“X-Y图”。表1汇总了所有时间点的样本量计算结果。
<img alt="脑卒中病灶 MRI 及体积图表；24 小时与 8 周分析；水肿校正；科学结果。" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 采用 T2 加权结构 MRI 测量脑卒中后梗死灶大小及脑肿胀程度。（A）同一鼠脑在诱导脑卒中后 24 小时和 8 周时的 T2 加权磁共振图像。白色区域代表病灶，但也包含部分血管源性水肿，该水肿在 8 周时已消退。（B）使用医学图像显示软件“感兴趣区域工具包”（Region of Interest Toolkit）测量梗死体积，并以图表形式展示三个时间点的均值 ± 标准差（n = 6）。图中显示了未经水肿引起的脑肿胀校正的原始病灶体积、占受损半脑百分比（未校正肿胀）以及使用 Gerriets 公式校正脑肿胀后的半脑病灶百分比。此处采用标准差（SD）而非标准误（SEM），以便进行样本量计算（见图 5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卒中恢复实验；大鼠抓取任务；图表：摄取的颗粒数；随时间变化的前肢功能。" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 阶梯测试显示抓取和取回颗粒的能力受损。 在此卒中模型中，自发恢复极为有限。老年大鼠卒中后灵巧性持续受损，通过每周进行“阶梯测试”评估颗粒抓取能力可观察到该现象。插图：大鼠执行行为学测试的照片。图表显示了受影响前肢每周取回的颗粒数（共21粒，以百分比表示）的平均值（±标准误差）。n = 5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="功效分析图示，包含样本量计算、t 检验、α、β、临界 t 值。" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 用于确定检测特定治疗效果所需大鼠分组数量的样本量计算。 此截图来自功效分析软件，显示若要检测在 24 小时使梗死体积减少 50% 的治疗效果，每组需要 12 只大鼠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="t检验功效分析图；样本量 vs 功效，效应量 d=1.23817，α=0.05，两组" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图6. 使用不同动物总数所达到的功效。 来自功效分析软件的“数值范围X-Y图”显示了在给定图5所示参数条件下，使用不同（总计）老年大鼠数量进行实验所能获得的功效。表1总结了我们所有的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">卒中后时间：</td>
			<td colspan="3">每组所需大鼠数量，以检测梗死体积减少：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="right">75%</td>
			<td align="right">50%</td>
			<td align="right">25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 小时</td>
			<td align="right">6</td>
			<td align="right">12</td>
			<td align="right">42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 周</td>
			<td align="right">4</td>
			<td align="right">5</td>
			<td align="right">17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 假设性未来实验中每组样本量的计算结果。 使用功效分析软件进行计算（见图5和图6）。该表显示了在本研究的各个时间点，为检测到病灶体积分别减少25%、50%和75%时，两组实验每组所需的大鼠数量。

本文介绍了一种在老年雌性大鼠中建立永久性远端大脑中动脉闭塞的实验方案，同时闭塞颈动脉以产生较大的皮层梗死灶并形成持续性神经功能缺损。我们通过脑卒中后24小时和8周时的结构磁共振成像（MRI）验证了梗死灶的大小。

卒中通常发生在患有多种合并症的老年人中，包括颈动脉（或其他动脉）粥样硬化、高血压、……

本实验的总体目标是在老年大鼠模型中进行永久性大脑中动脉（MCA）阻塞。首先暴露颈动脉并松散结扎以备后续结扎操作；第二步，钻开颅骨以暴露大脑中动脉。随后用镊子对血管进行凝固以启动闭塞。最后一步中，结扎右侧颈总动脉使其永久闭塞，同时暂时性阻断左侧颈总动脉。最终通过T2加权磁共振成像观察梗死灶大小，以确认手术操作成功。该模型可在老年大鼠的大脑中动脉区域产生大小可重复的梗死灶，并导致持续的行为功能缺陷。在开始操作前，通过夹捏16至18月龄雌性老年Lister Hooded大鼠脚趾无反应来确认其镇静程度是否合适，并给予适当的镇痛剂。随后，剃除动物颈部腹侧及右侧半球颞区的毛发，并使用乙醇棉片对暴露的皮肤进行消毒。将大鼠仰卧位放置在加热垫上的软木板上，软木板表面覆盖无菌手术巾，在头部和颈部已剃毛的区域涂抹利多卡因乳膏。插入直肠探头以维持体温在36.5至37.5摄氏度之间，并在动物眼睛上涂抹眼膏。随后，向大鼠注射0.05毫升硫酸阿托品，以减少气管分泌物，然后将动物置于体视显微镜下。在暴露的颈部正中做一条两厘米长的中央切口，然后将动物两侧位于气管外侧的唾液腺轻轻向侧方移开。接着，在颈部右侧，将不可吸收的5-0丝线穿过覆盖暴露区域的皮肤，形成结扎环，并利用缝线轻轻将皮肤从切口处拉开。使用手术胶带将缝线固定在软木板上，以充分暴露颈总动脉。然后，使用镊子小心地将动脉从周围的筋膜中钝性分离。暴露颈总动脉后，用精细镊子将动脉从迷走神经上逆行分离，注意避免接触神经。用不可吸收缝线环绕血管，并用外科胶带将缝线两端粘在一起。然后移除牵开表层皮肤的缝线，确保不干扰已环绕颈动脉的缝线环。按照刚刚演示的方法，在左侧重复此操作。双侧动脉均完成套环且移除多余缝线后，将无菌的生理盐水浸湿纱布放入伤口以保持组织湿润，并对皮肤进行疏松缝合。在该区域覆盖另一块浸有生理盐水的纱布以防止进一步脱水，并将大鼠置于侧卧位。在右侧眼眶与外耳道之间的中点处切开皮肤。随后钝性分离颞肌以暴露颅骨。然后，使用最多五个弹性的3毫米钩状牵开器，将皮肤牵拉并固定在软木板上。接着，在靠近耳部的颅骨最高点处，放置一个已调节好拇指轮的、重力驱动的生理盐水滴注装置，使其位于开放术区上方，并在最低点设置带有喷嘴的吸引装置，以清除任何骨碎片以及暴露区域的少量出血。根据需要调节拇指轮，以清晰观察出血来源。现在使用带有粗颗粒1.6毫米金刚石涂层钻头的牙科钻，在约8,000 rpm的转速下，在暴露区域进行5毫米×5毫米的颅骨开窗，钻孔时注意施加旋转和侧向压力，但避免施加向下的压力。当颅骨变得完全透明时，用镊子去除骨片。然后，使用自制的硬脑膜钩小心地打开硬脑膜，注意避免损伤较大的表层血管。接下来，使用一对尖端为0.25毫米的斜角珠宝匠电凝镊，从大脑中动脉（MCA）与下脑静脉交叉处开始，至动脉分叉点进行电凝，并沿MCA的尾侧分支继续电凝，直至血管完全闭塞。然后，为确认闭塞完全，使用显微血管剪剪断位于下脑静脉与MCA交叉点下方的闭塞段MCA。现在用浸有生理盐水的纱布覆盖暴露区域，并将大鼠恢复至仰卧位。重新打开颈部未完全结扎的缝线，再次暴露颈动脉，并在与大脑中动脉阻塞同侧的颈动脉周围缝线打结，以永久结扎该血管。随后，使用一个长约13毫米、压力约为125克的不锈钢动脉夹，对左侧颈动脉进行一小时的暂时性结扎。在暂时性阻断期间，将颈部切口 loosely 缝合，并在切口上方覆盖另一块无菌的生理盐水浸湿纱布。接下来，缝合颞部切口，随后进行四次皮下注射，每次五毫升生理盐水。在暂时性阻断结束时，移除夹子，并将生理盐水局部应用于周围肌肉。然后，使用可吸收的4-0缝线进行皮下连续缝合，关闭颈部切口，并将动物置于31°C的孵育箱中，使其从麻醉状态下恢复四小时。如果大鼠在手术后出现体重减轻，应检查其上下门齿。然后将动物置于仰卧位，将一个直径一毫米的注射器筒置于牙齿后方以保护软组织，使用手持圆形锯以高转速及缓慢而稳定的动作修剪动物的牙齿。为测量梗死体积，在大脑中动脉闭塞诱导后24小时，采用结构磁共振成像（MRI）获取T2加权扫描图像。然后在20个体积单位上测量梗死区域的横截面积，使用医学图像显示软件获得病灶体积，并将这些面积之和乘以层厚，以得到梗死的总体积。对于病灶体积百分比的计算，还需获取同侧和对侧半球的体积。为了计算未来研究的样本量，应使用功效分析软件来确定样本量计算，以估计识别不同效应大小治疗效果所需的组样本量。在本实验中，脑卒中结局在大脑中动脉闭塞后24小时和八周时进行评估，方法如前所述，梗死体积通过大鼠脑组织中呈现高信号强度的区域来确定。在此代表性实验中，24小时时未经校正的原始病灶体积为62.8立方毫米，病灶占受累半球体积的9.8%。采用Gerriets公式对脑肿胀进行校正后，该值降低至4.5%。卒中严重程度还通过蒙托亚阶梯实验进行评估，在大脑中动脉阻塞卒中动物模型中观察到糖丸取回率下降约40%。在实施该操作时，需注意在处理颈动脉进行结扎时应仔细分离迷走神经，因为这些神经的损伤可能对动物的恢复产生不利影响。完成该操作后，可给予相应治疗以回答进一步的问题，例如神经保护作用如何影响梗死灶的大小，以及哪些治疗可能改善卒中后的预后。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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我们介绍一种高度可重复的啮齿类动物主要脑血管永久性闭塞的方法。该技术可实现极小的周围组织损伤、最少的失血量、较高的长期存活率，以及与人类临床人群相符的稳定梗死体积。...

永久性脑血管阻塞 通过 双结扎与横断

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

大脑中动脉内栓线阻塞是啮齿类动物实验性脑卒中最常用的体内模型。本文采用一种可实现颈总动脉修复的替代性外科手术方法，能够恢复颈总动脉的血流，并实现大脑中动脉供血区域的完全再灌注。...

小鼠经颈总动脉修复实现再灌注的中脑动脉闭塞模型

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。...

一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。...

一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。...

大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

学习在老年雌性大鼠中执行永久性远端大脑中动脉闭塞手术的方法，以建立大面积皮层梗死和持续行为缺陷的卒中模型。该方法通过结构磁共振成像确认病灶大小，为研究老年卒中病理机制和治疗策略提供可靠的实验基础。

在老年大鼠中实施永久性远端大脑中动脉联合颈总动脉闭塞以研究伴有持续性功能障碍的皮层缺血

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