协议星形胶质细胞的三维共聚焦形态分析

该程序的总体目标是通过分析通过共聚焦显微镜获得的星形胶质细胞的三维图像来评估星形胶质细胞形态。该方法可用于评估可能出现在各种细胞类型的形态变化，无论是在病理条件下还是作为干预策略的效果。该技术的主要优点是可以同时研究与细胞结构相关的许多参数。

Mariam Bodel 博士将演示此程序：在制备用于免疫组织化学染色的载玻片后，将切片浸入二甲苯中 2 次，持续 10 分钟。将玻片在 99.8%、95% 和 70% 乙醇中分别孵育 10 分钟，以在洗涤后使切片再水化。PBS 将载玻片在 1 至 1500 稀释的神经胶质纤维酸性蛋白或 GFAP 一抗溶液中于 4 摄氏度孵育过夜。

孵育后，在 PB S3 中洗涤切片 5 分钟。然后将玻片与 1 比 100 碱性磷酸酶偶联的二抗溶液在室温下孵育 1 小时。同样，在使用前不到 30 分钟，在 PB S3 中洗涤切片 5 分钟。

将一滴红色显色剂溶液加入 3 毫升底物缓冲液中。将每张玻片放入 100 μL 此溶液中，在黑暗中孵育 15 至 20 分钟。然后在 PB S3 中洗涤玻片 5 分钟。

最后，用 PBS 中稀释 1 至 500 的 DPI 对细胞核进行染色。在切片上滴一到两滴 Antifa 培养基，并立即用盖玻片密封。显微镜检查前，将载玻片在 4 摄氏度下孵育 24 至 48 小时，以确保密封。

要开始共聚焦显微镜检查，请将载玻片放在显微镜载物台上并选择 63 x 物镜。打开采集软件后，单击采集选项卡中的智能设置，然后选择合适的 4 下限。这里，dappy 和 Alexa，使用了 5 楼 55。

接下来，单击 best signal，然后单击 apply。然后单击设置曝光以允许计算机确定最佳曝光参数要优化图像，请打开通道窗口并将图像切换到实时图像。如果需要，请调整焦距。

然后单击一个 au 以优化针孔，调整增益以获得最佳强度。最后，将数字增益设置在 2 到 3 之间。优化后，停止实时图像并打开采集模式窗口。

通过单击调整帧大小 X x Y 并选择 10 24 x 10 24。还要选择较慢的速度。接下来，打开 averaging 选项卡并选择一个大于或等于 4 的数字。

然后单击捕捉按钮并保存捕获的 2D 图像。要设置 3D 成像，请打开智能设置选项卡并标记 ZS 堆栈项，这将导致 Zs 堆栈窗口打开。要设置 Zack 的第一个和最后一个位置，请再次单击实时并将焦点调整到星形胶质细胞的最高位置。

首先点击 set。现在将焦点调整到星形胶质细胞的最低位置，然后单击最后设置，然后停止实时取景。接下来，通过单击最佳选择间隔。

要在此处设置切片数，间隔为 1.01 微米。最后，单击"开始"、"实验"，并在扫描完成后保存图像。此外，使用 10 x 或 20 x 物镜获取 2D 图像。

对于荧光强度测量，在图像窗口中选择矩形或圆形工具并突出显示要测量的区域，以量化星形胶质细胞核胞体和区域的体积和表面积。将 3D 图像传输到适当的分析软件程序，例如分析软件中的 Velocity 6.1。创建一个新库并将所有图像拖动到左侧的灰色列。

选择一个 3D 图像并打开其中一个采集的感兴趣通道，例如 dapi。对于核测量，请手动调整亮度以优化对比度。现在选择 tools 菜单。

选择 make volume （生成体积），然后从 Zack 图像生成单个 3D 图像。打开编辑菜单并单击 properties。确保显示 X、Y 和 Z 属性。

在此之后，从工具栏中选择手绘 ROI 工具。使用所选工具，在 DPI 标记的细胞核周围画一条线，以测量星形胶质细胞核的体积和表面积。同样，使用手绘 ROI 工具，沿着所有分支的表面在胞体周围画一条线，测量整个星形胶质细胞的体积和表面积。

单击图像窗口顶部的测量菜单，将查找对象拖动到窗口顶部，并为 population one 指定一个描述性名称，选择关联的颜色，然后单击 measure，这将打开一个新窗口。在这个新窗口中。选择 Volume 或 surface area 作为参数，然后单击 okay。

要保存数据，请单击测量菜单并选择 Make measurement item。选择名为 from the window 的新测量项。输入数据的文件名，然后单击 "确定"。

最后，将测量数据导出到适当的软件包中，以执行统计分析并生成数据图。在这里，研究人员比较了用 β 1 40 淀粉样蛋白 40 或β 1 淀粉样蛋白 40 和 Ian 治疗的大鼠固定脑组织中的星形胶质细胞。用淀粉样蛋白治疗注射导致星形胶质细胞具有更粗和更长的分支。

这些来自 Ian 处理动物的星形胶质细胞呈星状，具有短而细的分支。Ian 治疗的大鼠还显示脑切片中星形胶质细胞 GFAP 阳性荧光降低。特定星形胶质细胞体积的形态学分析显示，与单独淀粉样蛋白处理相比，Ian 处理后星形胶质细胞核、细胞体、整个星形胶质细胞和星形胶质细胞区域的体积减少。

一旦掌握了这个图像，如果执行得当，分析技术可以在几分钟内每个单元格完成。在尝试此过程时，重要的是要高精度地标记结构。最好在开发实验后开始实验之前手动练习标记感兴趣的结构。

这项技术为细胞生物学、组织学和病理学领域的研究人员在健康或疾病环境中探索细胞结构铺平了道路。观看此视频后，您应该对使用 3D 图片测量单个细胞的 12 个不同参数有很好的了解。