一种用于单细胞分泌物时空成像的无标记技术

以下实验的总体目标是以前所未有的时间与空间分辨率，测量单个细胞的蛋白质分泌。该目标通过在玻璃盖玻片上采用光刻技术制备金等离激元纳米传感器，实现对单细胞分泌物的无标记成像。第二步，将传感器芯片清洗后涂覆自组装单分子层，并进一步用对分泌的分析物蛋白具有高亲和力的配体进行功能化修饰。

接下来将细胞集成到功能化的传感器芯片上，以在空间和时间上测量其分泌物。结果表明，无需标记即可在空间和时间上绘制单个细胞的蛋白质分泌图谱。该方法有助于回答细胞间通讯领域中的关键问题，例如旁分泌和自分泌信号通路如何调控细胞运动性。

开始此操作时，通过电子束蒸发在预先清洗过的盖玻片上沉积一层10纳米厚的铬薄膜，以避免在纳米结构的图形化和成像过程中产生电荷效应。随后，以2000 RPM的转速旋涂双层抗蚀剂的第一层，该层由乳酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯共聚物组成，旋涂时间为45秒。然后，在让基底冷却至室温后，将基底在150摄氏度下进行烘烤。

以 3000 RPM 的转速旋涂第二层聚甲基丙烯酸甲酯 45 秒，并将基底在 150 摄氏度下烘烤。使用电子束光刻（EBL）对双层抗蚀剂进行图形化。用异丙醇（IPA）与甲基异丁基酮（MIBK）按 2:1 的比例混合的显影液显影，然后用 IPA 漂洗。

在室温下使用CR seven刻蚀液进行湿法刻蚀10秒，以去除纳米结构区域中的铬，随后用去离子蒸馏水冲洗。采用电子束蒸发器在基底上沉积钛金薄膜，顺序进行金的沉积。通过将基底浸泡在丙酮中四小时，剥离共聚物双层抗蚀剂。

接下来，使用扫描电子显微镜检查基底，以确认纳米结构的形状和尺寸。所得到的纳米结构通常以300纳米的节距分隔。20乘20的纳米结构阵列中心间距为30微米。

为细胞成像留出充足空间，一个典型的芯片将包含 300 个阵列。在室温下使用 CR7 蚀刻液通过湿法刻蚀去除基底上剩余的铬，持续 60 秒。然后用去离子蒸馏水冲洗基底。

然后使用原子力显微镜检查部分阵列，以验证其尺寸和均匀性。只要遵循适当的清洗程序对局域表面等离子体共振（LSPR）芯片进行清洗和再生，这种图案化玻璃盖玻片可多次重复使用。在300毫托的气体环境中，使用5%氢气和95%氩气的混合气体，以40瓦的功率进行等离子体灰化处理，持续45秒。

在等离子体灰化后立即对金表面和纳米结构进行功能化处理。将芯片浸入由SPO和SPC按3:1比例组成的乙醇硫醇双组分溶液中。将芯片在硫醇溶液中静置过夜，以形成自组装单分子层，随后用乙醇冲洗，并用氮气吹干。将LSPR芯片置于定制的微流控夹持装置中，放置在铝制底座上。

然后用四颗螺丝将芯片夹在底部部件、硅胶垫圈和透明塑料顶部部件之间，以固定整个组件。对于典型的基于SPC的巯基应用，将300微升由133毫摩尔EDC和33毫摩尔NHS按1:1混合的去离子蒸馏水溶液滴加到表面，以活化SPC巯基组分中的羧基。等待10分钟后，用10毫摩尔PBS手动冲洗表面，随后通过滴加300微升配体溶液，将活化的羧基与目标配体进行偶联。

等待一小时后，用10毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）滴加冲洗表面，然后在芯片上加入300微升含0.1摩尔乙醇胺的PBS溶液，以最大限度减少非特异性结合。等待10分钟后，用含有0.005%吐温20的PBS（PBST 20）洗涤乙醇胺。接下来，将一块石英片置于芯片上方，以减少因弯月面变化引起的数据波动。

将芯片安装到显微镜上时，需用 PBST 20 缓冲液保持芯片湿润。将微流控管路连接至组件，并通入缓冲液直至达到稳态。然后将 LSPR 芯片组件牢固地放入加热载台的样品架中。

该方法的光学装置如图所示。来自卤素灯的光通过一个593纳米长通滤光片，以消除不参与纳米等离基元响应的波长成分。随后，光被线性偏振，并通过一个40倍、数值孔径为1.4的物镜照射样品，以激发等离基元金纳米结构。

通过物镜收集散射光，并使其穿过一个交叉偏振器，以减少来自玻璃基底的背景信号。在收集的光路中插入一个50/50分束器，以实现光谱和成像的同步分析。在等待装置和显微镜至少平衡两小时后，使用操纵杆对准芯片，使中央阵列与用于光谱分析的光纤对齐。

将杂交DOMA细胞经培养并离心沉淀后收集细胞，随后在将其接种至LSPR芯片前检测细胞活力。接着，使用微量移液器手动将50微升细胞悬液加至LSPR芯片表面。最后，利用微流控灌注系统以新鲜无血清培养基冲洗去除未贴附的细胞，以完成LSPR芯片的成像前准备。

此处展示了一张 LSPR 成像图像与透射光照明图像的叠加图，其中高亮显示了方形阵列以及左下角的细胞。使用荧光膜染料罗丹明 DHPE 染色的细胞表现出类似丝状伪足的突起。如果此类突起与阵列发生重叠，则在向经 cmic 修饰的阵列引入抗 cmic 抗体的饱和溶液前后，可能导致蛋白质分泌检测数据出现假阳性结果。

该方法用于校准阵列。阵列的校准有助于标准化传感器的响应，并根据每次实验的生物功能化特征确定分数占有率。采用商用 SPR 仪器测定解离常数，并使用与 LSPR 芯片所述相同的实验方案研究对非特异性结合的抗性。

此处显示了两个阵列的归一化值。其中一个阵列距离细胞10微米以内，而对照阵列距离细胞130微米。与对照阵列平稳的响应相比，靠近细胞的阵列归一化响应出现突然升高，表明存在局部抗体分泌的爆发事件。

观看本视频后，您应能够充分理解如何以高空间和时间分辨率测量单个细胞的蛋白质分泌。