调查器官脊髓联合培养物中生长多电极阵列功能再生

以下实验的总体目标是使用多电极阵列（即所谓的 meas）研究器官型脊髓共培养物中椎管内连接的功能再生。这是通过在 meas 上彼此相邻地培养两个横向脊髓切片来实现的，以模拟不同脊髓节段之间的椎管内连接。在体外，切片生长，并在几天内沿着彼此相对的侧面融合。

作为第二步。在培养的不同时间范围后进行病变，这导致切片完全分离。接下来，将培养物在培养箱中放置至少两周。

为了给脊髓网络时间再生，两个切片之间的活动爆发表明，在早期病变的培养物显示出很高的功能再生潜力，而这种能力在较晚的病变培养物中明显降低。与切片、膜培养、解离培养物或 BSA 等现有方法相比，该技术的主要优点是 Ergon 典型培养物与多电极阵列的结合使我们能够通过直接实验途径评估脊髓微环境中再生的功能方面要开始制造或购买预制的多电极阵列，如此处所示， 通过冲洗 30 秒、100% 乙醇两次、70% 乙醇一次，然后蒸馏水两次来对多电极阵列进行消毒。干燥后，将 10 至 12 个阵列芯片放入玻璃培养皿中，并在 120 摄氏度下高压灭菌 20 分钟后盖上盖子。

将每个多电极阵列放入单独的无菌 35 毫米培养皿中。从冰箱中取出冷却的移液器。用它将 150 μL 冷冻的细胞外基质涂层溶液放在电极顶部。

盖上培养皿的盖子，在室温下孵育阵列芯片 1 小时。大约 10 分钟后，检查电极顶部是否有气泡，然后用覆盖橡胶的刮刀轻轻去除。如有必要，检查所有气泡是否消失。

接下来，吸出涂层溶液。用针对产前和胚胎神经元优化的培养基洗涤擦除物，然后用蒸馏无菌水冲洗两次。冲洗后，让它们在室温下静置直至干燥。

从母亲中提取后，立即将斩首的 E 14 大鼠胚胎转移到装有无菌冷冻洗涤液的培养皿中。用手术刀在后肢上方进行一次完整的横向切割，在四肢上方进行另一次横向切割，然后将肢体从身体中取出。接下来，在额平面上切开，将内脏与包含脊髓的背面分开。

接下来，将包含脊髓的背片一次一个地转移到安装盘上。使用组织切碎机将脊髓剪成 225 至 250 微米的厚度。然后将一滴洗涤液滴在切碎的组织上，将切片转移到装有无菌冷冻洗涤液的 35 毫米 x 10 毫米培养皿中。

脊髓从每个切片上的任何剩余组织中解剖出来。注意保持背根神经节的连接。将切片转移到装有无菌冷冻洗涤液的 35 毫米 x 10 毫米培养皿中。

然后让切片在 4 摄氏度下静置 1 小时。将带有涂层微电极阵列的培养皿放在立体显微镜下。将阵列置于焦点和中心位置。

电极阵列上的 6 μL 鸡血浆液滴。使用小刮刀小心地将两个脊髓切片滑入血浆液滴中，使其腹侧大小彼此相对。接下来，在鸡血浆液滴周围注入 8 微升凝血酶。

然后使用移液器吸头小心混合和涂抹鸡肉、血浆和凝血酶混合物。就在鸡血浆和凝血酶混合物变得太粘并开始凝固之前，吸出多余的液体，然后盖上培养皿并将其放入加湿室中。将腔室置于 37 摄氏度的培养箱中约一小时孵育后，小心地向样品中加入 10 微升营养培养基。

盖上培养皿的盖子，将其放回培养箱中再放置 45 分钟。接下来，将每个多电极阵列培养组件放入滚轮管中，并加入 3 毫升营养培养基。盖紧盖子，将滚轮管放入滚轮滚筒中。

使用无菌橡胶尖镊子在培养箱中以 37 摄氏度将鼓旋转 1 到 2 RRP M。从滚轮管中取出多电极阵列培养组件，并将它们放入立体显微镜下的培养皿中。聚焦组织并验证两个切片是否已融合。

接下来，保持组件稳定，并将手术刀刀片放入多电极阵列的凹槽中。靠近组织切片。水平握住手术刀，然后向上提起手术刀手柄。

但是让手术刀刀片留在阵列的凹槽中，使刀片从底部滚动到尖端，切开组织，覆盖凹槽。如有必要，用 25 号针尖切断任何残留的组织连接，仅在凹槽内的区域工作，不要接触柔软的边缘。将多电极阵列培养组件放回滚轮管中，并向培养物中加入 3 毫升新鲜营养培养基。

然后将滚轮管放回 37 摄氏度的培养箱中的滚轮滚筒上。将多电极阵列培养组件安装到记录室中，并将约 500 微升细胞外溶液涂到阵列中。然后将组件安装在显微镜上。

等待 10 分钟，让系统稳定下来，然后记录每个活性检测电极的基本自发活动 10 分钟。总共重复记录两次，以确保稳定的细胞外条件。如果需要，在每次录制会话后更换蜂窝外溶液。

通过应用含有一个严格 9 和 10 微摩尔凝视的微摩尔的细胞外溶液来消除网络，并在记录电活动之前等待至少两分钟，以研究源自 E 14 大鼠胚胎脊髓的共培养物的功能恢复的可能性。在体外 8 至 28 天的时间窗口内进行病变检查。两到三周后，记录到自发的神经元活动。

然后使用多电极阵列，将原始数据转换为光栅图，然后是网络活动图，以分别可视化每个切片中每侧的总活动。自发活动通常以爆发的形式组织，此处显示在年轻时分离的去抑制切片下，此处显示为功能连接。然而，那些在较大年龄分离的人似乎是异步的。

使用此信息，可以确定和可视化不同年龄的切片之间的同步突发量，如下所示。按照此过程。可以进行其他方法，如免疫组织化学染色，以回答其他问题，例如哪些细胞类型有助于两个脊髓夸脱切片之间的功能连接。