Name: 调查器官脊髓联合培养物中生长多电极阵列功能再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 了解利用多电极阵列研究脊髓切片共培养中功能再生的方法。该技术可评估损伤时间对再生潜力的影响，为神经修复研究提供可控的体外模型。

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本研究由瑞士国家科学基金会（n° 3100AO-120327 和 31003A_140754/1）资助

动物护理遵循瑞士当地主管部门（伯尔尼州农业与自然局，兽医服务处，动物实验秘书处，批准编号52/11和35/14）批准的指南。这些指南符合欧洲共同体指令2010/63/EU的规定。
注意：第1至第5步（包括子步骤）的所有操作均需在超净工作台中使用无菌仪器和无菌溶液进行。
1. 微电极阵列（MEA）的制备
注意：多电极阵列（MEA）由玻璃基底、微加工金属电极和SU-8聚合物绝缘层组成（另见Tscherter et al. 3）。本研究中使用的MEA为商业产品，其电极阵列布局经过定制（图1 A&amp;#38;B）。68个电极呈矩形网格排列，中间由一条宽300 µm、无电极、无导线和绝缘层的沟槽分为两个区域。每个电极尺寸为40 x 40 µm，电极中心间距为200 µm。记录区域周围设有四个较大的接地电极。此类MEA与其它商用标准MEA的不同之处在于其尺寸（21 mm x 21 mm），且无固定的记录腔室。
<ol>
	<li>消毒时，将微电极阵列（MEA）分别在100%乙醇（2次）、70%乙醇（1次）和蒸馏水（2次）中各冲洗至少30秒&#160;。晾干后，将10–12个MEA放入一个洁净的玻璃培养皿（150 mm × 25 mm）中，并盖上皿盖。</li>
	<li>在120 °C条件下对MEA进行20分钟高压灭菌处理，随后于室温（RT）保存。</li>
	<li>配制MEA的包被溶液（参见材料列表），并将分装样品储存在-20 °C。</li>
	<li>将每个MEA单独放入无菌培养皿（35 mm × 10 mm）中。</li>
	<li>使用预冷的移液器将150 µl预冷的包被溶液加至电极表面，并盖上培养皿盖。约10分钟后，检查电极表面是否有气泡，必要时用包有橡胶头的刮刀轻轻去除。在室温（RT）下静置1小时&#160;。</li>
	<li>吸除残留的包被溶液，先用适用于产前及胚胎神经元的优化培养基清洗1次，再用无菌蒸馏水清洗2次。若MEA次日才使用，则将其置于37 °C培养箱中，浸泡于无菌蒸馏水中过夜（O/N）；否则，直接在室温下晾干。</li>
</ol>
2. 制备和培养类器官培养物所需的成分
<ol>
	<li>准备无钙清洗液（参见材料列表）。</li>
	<li>用清洗液重悬鸡血浆（1:1，轻轻振荡，避免产生气泡），在 3,000 × g 下离心约 20 分钟，将上清液倒入无菌试管中。分装至冻存管，每管 200 µl，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>按相应方法重悬牛血浆来源的凝血酶（200 U/ml），并经无菌滤器（0.2 µm 孔径）过滤。分装至冻存管，每管 200 µl，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>为 30 个培养物准备 100 ml 营养培养基（参见材料列表）。</li>
</ol>
3. 脊髓组织解剖
注意：根据胚胎数量的不同，该操作可制备约 25 - 35 个共培养所需的脊髓切片，所有步骤均在超净工作台内无菌条件下进行。
<ol>
	<li>通过肌肉注射向母体动物施用致死剂量的戊巴比妥钠（0.4 ml）。通过检查足底回缩反射确认深度麻醉。通过剖宫产取出E14大鼠胚胎，并通过断头法处死。</li>
	<li>将胚胎的躯体转移至一个盛有无菌、预冷的洗涤液的培养皿中。</li>
	<li>使用解剖刀在后肢上方进行一次完整的横向切割，在前肢上方进行另一次横向切割，并将四肢从躯体上移除。接着，在额状面进行切割，将含有脊髓的背部组织块与内脏分离。</li>
	<li>进行切片时，将含有脊髓的背部组织块逐个转移至固定盘上，使用组织切片机切成225–250 µm厚度的切片。在切好的组织上滴加一滴洗涤液，用刮匙将切片转移至盛有无菌、预冷洗涤液的35 mm × 10 mm培养皿中。</li>
	<li>对每一片切片单独操作，将脊髓从残留组织中解剖分离，保留背根神经节附着。</li>
	<li>让切片在4 °C下静置1小时。</li>
</ol>
4. 在MEA上固定脊髓组织切片
<ol>
	<li>在培养箱中预热无菌营养培养基（37 °C，瓶盖轻轻拧松以供氧）。</li>
	<li>使用带有橡胶尖端的无菌镊子，在体视显微镜下将MEA置于培养皿中，室温操作，确保电极阵列处于焦点位置。在洁净、无尘且无菌的电极阵列中央滴加6 µl鸡血浆。用小刮勺小心地将两段脊髓组织腹侧相对地滑入血浆液滴中。操作时避免刮勺接触电极。</li>
	<li>在鸡血浆液滴周围加入 8 µl 凝血酶。使用凝血酶移液枪头，轻轻混合并均匀铺开鸡血浆与凝血酶的混合物，覆盖两片组织切片。注意切勿直接触碰脆弱的电极阵列。在凝血发生前，吸除多余的鸡血浆/凝血酶混合物。</li>
	<li>将培养皿盖好以保持高湿度，将MEA/培养物组装体置于37 °C培养箱内的湿化 chamber 中静置约1小时。</li>
	<li>向培养室中小心加入10 µl营养培养基，盖上培养皿盖，放回培养箱中孵育约30分钟。</li>
	<li>将每个MEA/培养组件用无菌橡胶包被的尖端放入滚瓶中，加入3 ml营养培养基并 tightly 封闭瓶盖。将滚瓶置于培养箱内的滚筒中，以1 - 2 rpm转速旋转。2含37 °C的气体环境。</li>
	<li>7天后更换一半的培养基 体外 （体外培养天数）及之后 1 - 2 次&#160;每周</li>
</ol>
5. 机械性损伤
<ol>
	<li>用无菌的橡胶包头镊子将MEA/培养组件从滚管中取出，放入不含营养培养基的培养皿中，在体视显微镜下对准组织位置，目视确认两个组织切片已融合。</li>
	<li>用橡胶包头镊子夹住MEA，以固定MEA/培养组件。</li>
	<li>将手术刀片置于MEA的沟槽内，靠近组织切片处，持刀方向应较水平。</li>
	<li>抬起手术刀柄，同时保持刀片位于MEA的沟槽内，使刀片从刀根向刀尖方向“滚动”，从而切断覆盖沟槽的组织。</li>
	<li>如有必要，可用25 G针尖切断任何残留的组织连接。操作仅限于沟槽区域内，避免触碰脆弱的边缘。</li>
	<li>将MEA/培养组件放回滚管中，向培养物中加入3 ml新鲜营养培养基，并将其放回培养箱内的滚筒中。</li>
</ol>
6. 自发活动的电生理记录
<ol>
	<li>为研究选定 DIV 天数后两个脊髓切片之间的功能再生情况，将 MEA/培养组件安装在显微镜下的记录室中，并加入约 500 µl 细胞外溶液（见材料列表）。</li>
	<li>首次记录前等待 10 分钟，使系统达到稳定状态。</li>
	<li>在室温下，从 MEA 的每个可检测活动的电极分别记录约 10 分钟的基础自发活动，重复 2 次。</li>
	<li>为确保细胞外环境稳定，每次记录结束后更换细胞外溶液。</li>
	<li>为解除网络抑制，加入含士的宁（1 μM）和 gabazine（10 μM）的细胞外溶液。&#160; 给药后至少等待 2 分钟再开始记录。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：对于细胞外记录的动作电位检测，应为每个电极使用基于标准差的检测器及后续的判别器。该步骤的详细说明见 Tscherter et al. 3。
<ol>
	<li>根据标准操作流程，以点阵图（raster plot）显示每个电极检测到的神经元活动 3（图 1F）。</li>
	<li>通过在 10 毫秒滑动窗口（以 1 毫秒步长移动）内对相应通道的事件数量求和，确定并显示每一片段的总体网络活动（图 1G，参见 Tscherter 等 3）。</li>
	<li>在每一片段中检测独立的簇发事件（即在多个电极上出现的活动簇）。为此，设定相应总体网络活动中的最小峰值活动阈值，并定义每次簇发的开始与结束。例如，合适的阈值可设为平均簇发幅度的 25%，簇发起始可定义为至少持续 5 毫秒时间窗内的首个事件，簇发结束可定义为至少持续 25 毫秒时间窗内的末个事件（参见 Heidemann 等 10）。</li>
	<li>为量化功能再生，计算两个片段之间同步簇发所占的百分比。为此，计算一个片段中某次簇发与另一片段中随后发生的下一次簇发之间的潜伏期。 
	注意：当潜伏期小于平均簇发持续时间时，该对簇发称为“同步的”。尤其在活动频繁的共培养体系中，两侧可能在所选潜伏期窗口内偶然同时启动簇发，这一因素在计算同步簇发百分比时必须予以考虑。有关计算方法的详细说明，参见 Heidemann 等10。</li>
</ol>
8. 培养物的固定与免疫组织化学染色
<ol>
	<li>所有涉及洗涤或孵育的步骤，均需将培养物置于倾斜摇床上，以确保溶液在组织中充分扩散。</li>
	<li>记录结束后，立即将MEA/培养组件从装置中取出，放入培养皿（35 mm × 10 mm）中，并加入约2 ml细胞外溶液。</li>
	<li>将切片与培养期间形成的周围细胞层分离 体外 使用10 µl移液器吸头围绕切片划圈，注意不要损伤培养物。此步骤可以省略，但执行后有助于后续包埋操作。</li>
	<li>使用一根细的非金属注射器针头（见材料列表），配合装有细胞外液的1 ml注射器，轻轻吹打以将培养物从MEA上脱离。</li>
	<li>移除巴斯德移液管的尖端，并将橡胶吸头套在削细的一端。使用其后端将培养物转移至固定液（4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS, 0.1 M））中。切勿使用巴斯德移液管的标准尖端进行转移，因其孔径过小，会导致培养物折叠并可能受损。在4 °C下固定1–2小时。用蒸馏水冲洗MEA，并用指尖去除组织残留物，但切勿用指甲刮擦。将MEA储存于4 °C的蒸馏水中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 3 次，每次至少 10 分钟。可在 4 °C 的 PBS 中保存，或直接开始染色步骤。</li>
	<li>在封闭液（5% 山羊血清、1% 牛血清白蛋白、0.3% 去垢剂溶于 PBS）中孵育样品，孵育时间至少 90 分钟。</li>
	<li>将一抗用封闭液稀释后加入，于 4 °C 孵育 3 个夜晚。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次至少 30 分钟。</li>
	<li>在室温下用 PBS 稀释的二抗孵育 2 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次至少 30 分钟。</li>
	<li>用剪去尖端的巴斯德吸管将切片转移至载玻片上。除去多余的PBS，用封片剂封片。</li>
</ol>

<ol><li>Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuits+formation%3A+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li>
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<li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li>
<li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Iran.+Biomed+J%22%5BJournal%5D)">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li>
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<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non%E2%80%93phosphorylated+neurofilaments%3A+Cross%E2%80%93+species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45–58), (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案中的多个环节对于获得准确且可重复的实验结果至关重要。MEA、溶液的制备以及脑片培养物的制备全过程均须在超净工作台内的无菌条件下进行。营养培养基中不添加抗生素，因为抗生素可能影响自发性电活动14。在MEA包被过程中，最关键的是确保细胞外基质凝胶溶液始终处于低温状态。应先在冰箱中解冻，并在整个操作过程中置于冰上，以保证温度接近0 °C。在脑片制备过程中，快速分离与切片，并使用冰冻的解剖缓冲液维持低温环境，有助于提高健康培养物的比例。此外，血浆/凝血酶凝固步骤是其中最关键的环节之一。首先，需确保血浆与凝血酶充分混合；其次，应特别注意尽可能彻底清除残留液体，以保证脑片能够牢固地附着于MEA表面。该步骤对时间极为敏感：若操作时间过短，会导致血浆/凝血酶混合物残留过多；若时间过长，则可能发生过度凝固，增加脑片随残留血浆/凝血酶一同被移除的风险。
如果计划进行机械损伤实验，则必须使用设计精确的多电极阵列（MEA）。损伤区域必须避开电极、导线和绝缘层，否则 MEA 的电路将被损坏，从而无法再进行任何记录。
另一个关键步骤涉及损伤的大小。先前的研究表明，损伤后将两个年轻的脑片重新连接大约需要两天时间10。在所有实验中，均采用经验法则：损伤后两个脑片之间的间隙不应大于MEA沟槽的宽度（300 µm）。若损伤范围过大，可能导致重新连接所需时间更长，甚至完全无法实现重新连接。需要说明的是，此前的实验结果显示，若初始放置时两个脑片之间的距离超过1 mm，连接率会显著降低。
在开始记录之前，建议至少给予10分钟的适应时间，使细胞从培养箱中的37 °C环境转为室温（RT），并从营养培养基转为细胞外溶液。在最初几分钟内密切观察细胞的活动模式，可确保记录开始后所测得的数据能够恰当地反映细胞群的簇状放电模式。
为检测活性、数据采集及后续处理，使用自制硬件（记录室、与放大器的连接及放大器）以及 LabVIEW、C++ 和 IgorPro 编写的程序。商用多电极阵列（MEA）系统及其他软件包也适用于这些操作。此处，电极接收到的信号被放大 1001 倍，然后以 6 kHz 的速率进行数字化。
所介绍的模型可作为研究脊髓内中间神经元连接的有用工具，因为 体内，若不受到上行和下行纤维束的干扰，这些结构很难进行研究。通过两个脊髓切片的共培养，可巧妙地规避这一问题。该培养体系提供了一个可严密控制且易于操作的微环境。然而，这种模型自然缺乏脑源性及感觉传入。此外，培养制备过程本身即构成一种中枢神经系统损伤情境。众所周知，星形胶质细胞和小胶质细胞等胶质细胞在损伤后会因增殖增强而发生反应，因此组织在一定程度上发生了重构。就本模型而言，实施机械性损伤后并未观察到胶质瘢痕的形成。一种可能的解释是，在制备过程中星形胶质细胞的适应性机制已被提前激活，因而培养物的损伤未引发进一步反应。此外，目前尚无证据表明髓鞘相关抑制因子参与其中。 例如，Nogo-A，在高龄损伤的培养物中再生能力较低。然而，研究表明，在23天体外培养（DIV）时进行损伤后立即使用磷酸二酯酶4抑制剂Rolipram处理，可增强切片间的功能性再生 10这些结果表明，在较老的培养物中，功能恢复能力可以得到增强。值得注意的是，在统计跨越损伤部位的轴突数量时，发现年轻时期损伤的培养物与年老时期损伤的培养物之间并无差异。这些发现提示，轴突再生能力的缺乏并非导致晚期损伤后恢复功能丧失的主要原因，因此强调需要建立一种能够对再生过程进行功能分析的模型。突触形成和突触可塑性可能在恢复过程中发挥重要作用。 10这些机制在近年来受到广泛关注，目前普遍认为它们对脊髓损伤后的功能恢复结果具有重要影响。因此，建立一个能够提供稳定条件以独立且深入研究这些过程的模型，无疑有助于深入了解脊髓功能再生的机制。

中枢神经系统（CNS）的器官型脑片培养已被广泛用于研究多种生理和病理现象，范围从神经元发育到神经退行性变。与离体细胞培养相比，器官型脑片具有更高的复杂性优势，能够保持完整的细胞结构和局部突触环路。同时，该组织可在脱离整体in vivo复杂环境的情况下进行独立分析。此外，可便捷且重复地接触目标细胞，细胞外环境可被精确控制，且通常in vitro模型的成本低于相应的in vivo模型。近年来，多项研究显示长期培养的发育特征与相应活体动物之间存在显著相似性1,2。已有研究表明，中枢神经系统不同区域的神经环路在发育过程中会表现出自发性网络活动，而器官型脑片可部分维持这一现象3–7。其中，离体脊髓制备物尤其被用于研究节律产生6和神经环路的形成1。
记录脑片自发活动的一种方法是将其培养在多电极阵列（MEAs）上。这些设备包含多个电极，可同时监测来自大量细胞动作电位所产生的细胞外电位（多单元记录）。MEA记录具有高时间分辨率，可用于重建特定神经环路内的精确活动动态。此外，与膜片钳技术相比，该技术具有非侵入性，允许进行长期测量，并确保神经元的行为不受干扰。
本研究采用脊髓器官型共培养与多位点记录相结合的方法，探究脊髓内的功能再生。由于成年高等脊椎动物脊髓损伤后的修复能力有限，已有多种策略被用于促进脊髓损伤后的再生。迄今为止，皮质脊髓束通常是此类研究的首选模型系统。然而，这类实验通常耗时较长、成本较高，且由于组内变异较大，需要使用大量动物样本。此外，有证据表明，脊髓固有神经连接（即完全局限于脊髓内的神经元）在脊髓损伤后的恢复过程中可能发挥关键作用。 8这些纤维难以研究 体内 不受上行和下行纤维束的干扰。Bonnici 和 Kapfhammer 9 采用新生小鼠脊髓纵向切片培养作为替代方法。在实施机械性损伤后，他们对脊髓节段间轴突形态学再生进行了半定量分析。他们观察到，在成熟阶段进行切割的培养样本中，穿过损伤部位的轴突较少，但并非完全没有。相比之下，在较年轻阶段造成损伤的培养样本中，损伤后5至7天表现出大量轴突再生。然而，该研究未提供功能连接的证据。
因此，代表性模型的开发 体外 一种允许研究功能性再生的脊髓固有神经纤维模型可成为拓展我们对脊髓再生过程认知的有力工具。

<table><tbody><tr><td>平面多电极阵列</td><td>Qwane Biosciences</td><td></td><td>根据本实验室设计定制</td></tr><tr><td>营养培养基</td><td></td><td></td><td>每100 ml</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>80 ml</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>蒸馏无菌水</td><td></td><td></td><td>10 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>神经生长因子-7S [5 ng/ml]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0513</td><td>200 &amp;micro;l</td></tr><tr><td colspan="4">用含1% BSA的洗涤液重悬</td></tr><tr><td>包被溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞外基质凝胶</td><td>BD Biosciences</td><td>356230</td><td>必须始终保持低温；用适用于胎前及胚胎神经元的优化培养基按1:50稀释</td></tr><tr><td>适用于胎前及胚胎神经元的优化培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>洗涤液</td><td></td><td></td><td>[mg/L]</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>60</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>8,000</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 无水</td><td></td><td></td><td>48</td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td></td><td></td><td>1,000</td></tr><tr><td colspan="4">根据 http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html 上的方案配制</td></tr><tr><td>细胞外溶液（pH 7.4）</td><td></td><td></td><td>[mM]</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>4</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>封闭液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去垢剂：Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.3%，吞咽有害</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>1%</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>5%</td></tr><tr><td>鸡血浆</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2366</td><td>冻干粉，用洗涤液重悬</td></tr><tr><td>加巴津</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SR-95531</td><td></td></tr><tr><td>美卡拉明盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>2843</td><td>吞咽有毒</td></tr><tr><td>微量移液管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td>有害，4%</td></tr><tr><td>SMI-31</td><td>Covance</td><td>SMI-31P</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32</td><td>Covance</td><td>SMI-32R-500</td><td></td></tr><tr><td>士的宁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>有毒</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Merck Millipore</td><td>1123740001</td><td>刺激性，致敏性，用洗涤液重悬</td></tr><tr><td>组织培养平管10（即滚管）</td><td>Techno Plastic Products AG</td><td>91243</td><td></td></tr></tbody></table>

在多电极阵列上培养的脊髓组织共培养物中研究功能再生

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

成年高等脊椎动物从脊髓损伤中恢复的能力有限。最近的研究表明，固有脊髓连接是促进功能再生干预的有前景靶点。迄今为止，尚无 体外 目前尚无模型能够用于研究固有脊髓纤维的功能恢复。因此，研究人员开发了一种代表性模型，该模型基于大鼠胚胎脊髓的两个器官型切片，将其并排培养在多电极阵列（MEAs）上。这些切片在培养数天后生长并相互连接 体外，沿相对的侧面融合。所使用的MEA设计允许通过手术刀片在融合部位进行切割，而不会损坏MEA。脑片表现出自发性活动，通常表现为网络活动簇状放电，可表征其空间和时间活动参数，如簇状放电的起始位置、传播速度与方向以及放电之间的潜伏期。利用这些特征，还可通过计算两侧之间同步放电簇的数量来评估脑片的功能性连接。此外，在记录完成后，可通过免疫组织化学染色对脑片进行形态学分析。 
该模型结合了所用技术的多项优势：切片在很大程度上保留了原始组织结构及完整的局部突触环路，组织可反复便捷地获取，且可在高时间分辨率下同时、无创地在多个位点检测神经元活动。这些特性使得对脊髓内连接功能再生的独立研究成为可能 体外 以一种复杂且高效的方式。

为了研究源自E14大鼠胚胎脊髓的共培养组织在功能上恢复的潜力，在8至28天体外培养（DIV）的时间窗口内制造了损伤。2至3周后，使用微电极阵列（MEA）记录神经元的自发活动（图1 C&amp;D）。对每个单独电极记录到的细胞外动作电位进行离线识别（图1E）。基于这些数据生成点阵图（图1F），随后生成网络活动图，以分别显示每侧的总体活动情况（图1G）。在每一片组织中，自发活动通常以簇状放电的形式组织。如果两片组织在功能上相互连接，这些簇状放电可从一片传播到另一片。因此，通过计算两片组织之间同步簇状放电的数量，来定量评估功能再生的程度。有关如何生成各类图表以及计算同步活动百分比公式的详细推导过程，请参见Heidemann et al. 10。
在所有实验中，首先在标准条件下记录活动。第二步，在细胞外灌流液中加入士的宁（1 µM）和加巴嗪（10 µM）以阻断突触抑制。这种去抑制通常会导致活动模式更加规律，簇状放电持续时间及簇间间隔延长，从而有利于定义簇状放电，进而确定切片之间的簇同步性。
年轻时期（7 - 9 DIV）造成损伤的培养物在损伤后2-3周表现出大量同步化活动，而晚期阶段（&gt;19 天体外培养）表现出再生能力显著下降（图2 A - F）。这些结果表明，脊髓切片培养中功能性连接的再生能力从代表胚胎状态的高水平逐渐下降 体内，至较低水平，代表更进一步的发育状态 体内，培养三周内。
两个脊髓切片之间的爆发同步涉及哪些类型的连接？除了固有脊髓连接外，纤维还可能来源于运动神经元或背根神经节神经元。先前的研究已表明，背根神经节神经元与脊髓切片之间的功能性连接无关10。然而，运动神经元是否参与仍是一个可能。由于已知运动神经元通过烟碱型受体与脊髓神经元形成胆碱能连接13，因此在8天体外培养（DIV）时记录了脊髓共培养体系的活动，此时培养物表现出高度同步的活动10，并将烟碱型受体拮抗剂美卡拉明（MEC，100 µM）加入细胞外灌流液中。如果运动神经元参与了两个切片之间的连接，则同步活动的比例应会降低。但实验结果并非如此（MEC组：91.0 ± 4.5%，n = 7；对照组：93.6 ± 4.6%，n = 7，p &gt;0.05，Wilcoxon配对样本检验）。这些结果表明，胆碱能突触并不参与切片之间的功能性连接。然而，由于已有研究显示运动神经元在中枢神经系统内的突触处也可释放谷氨酸11, 15，因此这些实验并不能完全排除其参与的可能性。
使用 SMI-32 对非磷酸化神经丝重链进行免疫组织化学染色以鉴定运动神经元。结果显示多个被标记的大型细胞体，符合运动神经元的典型特征，分布于切片中。图 3A）。SMI-32 抗体已被报道可标记运动神经元的胞体 12 这一发现对于所使用的培养物也同样成立 13此外，通常对神经元胞体进行染色， 例如， 针对β-III微管蛋白或NeuN以及胶质细胞胞体 例如，使用GFAP抗体标记的星形胶质细胞与其他报道一致，并符合这些细胞类型的形态学描述（图3 B - D）。然而，使用 SMI-32 抗体对轴突进行标记存在一定的问题（图3E）。出乎意料的是，使用该抗体后呈现出一个巨大的纤维网络，其形态与标记磷酸化神经丝蛋白H的SMI-31染色相似图 3F）。这一结果的一种解释可能是，在所使用的培养体系中，神经丝蛋白磷酸化/去磷酸化的发育调控不如在体内那样严格 体内 这种情况可能是由于同一轴突内同时存在磷酸化和非磷酸化的神经丝所致。另一种可能是，SMI-32标记的轴突来源于投射神经元。Tsang 及其同事 16 已表明 例如， 除了运动神经元外，克拉柱（Clark柱）和中间内侧细胞柱神经元也由SMI-32染色。这些神经元显著的神经突增殖也可能解释SMI-32阳性纤维的丰富存在。
<img alt="使用微电极阵列的神经培养研究，时间线图，数据图；脑活动分析。" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 自发性活动的显示与分析。（A）微电极阵列（MEA）示意图。铂涂层电极以黑色表示，透明导线为红色，MEA 中央的沟槽为黄色。（B）位于 MEA 中心的电极阵列局部放大图。示意图由 M. Heuschkel 博士惠赠提供。（C）培养 8 天（8 DIV）后的明场图像。组织切片已沿相对的侧面生长并融合。黄色条带代表 MEA 上无电极和绝缘层的沟槽。比例尺 = 400 µm。（D）实验时间线。将 E14 大鼠胚胎的两个脊髓切片并排置于 MEA 上。数天内，切片沿相对侧面生长并融合。在培养 8 至 28 天（DIV）期间，通过融合部位进行完全性损伤。两到三周后记录自发性活动，并对培养物进行固定以进行免疫组织化学染色。（E）培养 23 天（23 DIV）后每个独立电极记录的自发性活动轨迹。为便于观察，仅显示每隔一条的轨迹。橙色轨迹代表右侧切片记录的活动，蓝色轨迹代表左侧切片的活动。大多数爆发活动在两侧同步发生。箭头指示左侧切片中发生的一次仅部分传播至右侧切片的爆发活动。然而，右侧切片的活动未达到设定阈值（即同侧平均最大峰值活动的至少 25%），因此未被识别为一次爆发。右侧的放大图显示最后一次同步爆发对。（F）（E）中所示活动的点阵图。（G）（E）中所示活动的网络活动图，其中定义的爆发事件以基线下方的条形表示。改编自 Heidemann 等。10 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元活动示意图；损伤时间，同步活动图；体外神经研究结果。" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 同步活动与非同步活动的比较。（A, B）在较早年龄阶段（7–9 天体外培养，DIV）造成损伤的神经元培养物的序列点阵图，显示在标准条件下（A）和去抑制条件下（B）的同步活动。（C, D）在较晚年龄阶段（>19 天体外培养，DIV）造成损伤的神经元培养物的序列点阵图，显示在标准条件下（C）和去抑制条件下（D）的非同步活动。（E, F）在标准条件（E）和去抑制条件（F）下，按每次损伤后单独记录日计算的同步活动平均百分比。记录时间在损伤后 2–3 周。改编自 Heidemann et al. 10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经标志物 SMI-32、β-III、GFAP、NeuN 的荧光显微镜图像；细胞结构研究。" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 免疫组织化学表征。（A）SMI-32 对运动神经元胞体的染色。（B）β-III 微管蛋白对成熟神经元胞体及其突起的标记。（C）GFAP 对星形胶质细胞的鉴定。（D）NeuN 对成熟神经元胞体的标记。（E）SMI-32 对非磷酸化神经丝重链（neurofilament H）的染色。（F）SMI-31 鉴定磷酸化的神经丝重链。改编自 Heidemann 等。10 注意，使用 SMI-31 和 SMI-32 均可观察到培养物中存在大量纤维网络。标尺 A-D = 20 µm，H&amp;F = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于脊髓切片在多电极阵列上培养的方案，用于研究脊髓固有连接的功能性再生 体外.

成年高等脊椎动物从脊髓损伤中恢复的能力有限。最近有证据表明，固有脊髓连接是……

以下实验的总体目标是利用多电极阵列（即MEA）在脊髓组织器官型共培养系统中研究脊髓内连接的功能性再生。该目标通过将两个横向脊髓切片并列培养于MEA上，以模拟不同脊髓节段之间的脊髓内连接来实现。在体外培养中，这些切片会生长，并在培养数天内沿相对的侧面融合在一起。第二步，在培养的不同时间点进行损伤处理，从而实现脑片的完全分离。随后，将培养物置于培养箱中至少两周。为了使脊髓网络有足够时间再生，两个切片之间的活动爆发表明，在较早年龄阶段造成损伤的培养物显示出较高的功能再生潜力，而在较晚年龄阶段造成损伤的培养物中，这种能力明显降低。与现有的其他方法（如膜上培养的切片、离体解离培养或BSA中的培养）相比，该技术的主要优势在于，将Ergon典型培养与多电极阵列相结合，使我们能够在脊髓微环境中直接通过实验手段评估再生的功能特性。首先，制备或购买如图所示的预制多电极阵列，通过以下步骤对其进行灭菌：用100%乙醇冲洗两次，每次30秒，再用70%乙醇冲洗一次，最后用蒸馏水冲洗两次。待其干燥后，将10至12个阵列放入玻璃培养皿中，并在120摄氏度下高压灭菌20分钟，随后盖上皿盖。将每个微电极阵列放入单独的无菌35毫米培养皿中。从冷冻箱中取出一支预冷的移液器，用其在电极表面加入150微升冰冷的细胞外基质包被溶液。盖上培养皿盖子，在室温下孵育阵列1小时。约10分钟后，检查电极表面是否存在气泡，并用包有橡胶的刮刀轻轻去除。如有必要，确认所有气泡均已消失。接下来，吸去包被溶液。用适用于产前和胚胎神经元的培养基洗涤，然后用无菌蒸馏水冲洗两次。冲洗后，于室温下静置至干燥。从母体取出后立即把断头的 E 14 大鼠胚胎转移至一个装有无菌冷洗液的培养皿中。用解剖刀在后肢上方和四肢上方分别做一次完整的横向切割，并将四肢从躯干上移除。接着，在额状面进行切割，以分离内脏与含有脊髓的背部组织。接下来，将含有脊髓的背部组织逐个转移至载片盘上。使用组织切片机将脊髓切成厚度为225至250微米的切片。然后在切好的组织上滴加一滴洗涤液，并将切片转移至盛有无菌冷洗涤液的35毫米×10毫米培养皿中。将每片组织上的残留组织分离，取出脊髓，注意保留背根神经节附着。将组织片转移至盛有无菌冷洗涤液的 35 毫米 × 10 毫米培养皿中。然后将切片在 4°C 下静置一小时。将含有包被的微电极阵列的培养皿置于体视显微镜下。调节焦距使阵列清晰，并将其置于视野中央。在电极阵列上滴加6 µL鸡血浆。用小刮铲小心地将两片脊髓切片腹侧相对放入血浆液滴中。随后在鸡血浆液滴周围加入8 µL凝血酶。然后用移液枪枪头小心混合并铺展鸡血浆、血浆和凝血酶的混合物。在鸡血浆与凝血酶混合物变得过于纤维状并开始凝固之前，吸除多余液体，盖上培养皿盖，将其放入湿化 chamber 中。将 chamber 置于 37°C 的培养箱中孵育约 1 小时。孵育后，小心向样品中加入 10 µL 营养培养基。盖上培养皿盖，将其放回培养箱中继续孵育45分钟。接着，将每个多电极阵列培养组件放入滚管中，并加入3 mL营养培养基。拧紧管盖，将滚管放入滚筒培养箱中。使用无菌橡胶头镊子，在37摄氏度的培养箱中以每分钟1至2转的速度旋转滚筒。从滚筒中取出多电极阵列培养组件，并将其置于体视显微镜下的培养皿中。调节组织至清晰对焦，确认两个切片已融合。接下来，固定装置，将手术刀刀片放入多电极阵列的凹槽中，靠近组织切片。保持手术刀接近水平方向，然后抬起手术刀手柄。但应使手术刀刀片保持在阵列的凹槽内，让刀片从刀柄向刀尖方向滚动，切割组织并覆盖整个凹槽。如有必要，可用25号针头切断残留的组织连接，操作时仅限于凹槽区域内，切勿触碰娇嫩的边缘。将多电极阵列培养组件放回滚轴培养管中，并向培养物中加入3 mL新鲜营养培养基。然后将滚管放回37摄氏度培养箱中的滚筒上。将多电极阵列培养装置安装到记录室中，并向阵列上加入约500 µL细胞外溶液。然后将装置安装到显微镜上。等待10分钟使系统稳定，然后从每个活动检测电极记录10分钟的基础自发活动。重复记录共两次，以确保细胞外条件稳定。每次记录结束后可根据需要更换细胞外溶液。通过灌注含有1 µM严格九（strict nine）和10 µM gazin的细胞外溶液解除网络抑制，并在记录电活动前至少等待两分钟，以评估源自E14大鼠胚胎脊髓的共培养体系功能恢复的潜力。损伤在体外培养8至28天的时间窗内进行。损伤后两周至三周，记录神经元的自发性电活动。利用多电极阵列，原始数据随后被转化为点阵图，再生成网络活动图，以分别可视化每个脑片两侧的总体活动。自发性活动通常以簇状放电形式组织，此处显示在去抑制条件下，幼龄时期分离的脑片表现为功能连接状态，而较晚时期分离的脑片则表现为不同步活动。利用这些信息，可以确定并可视化不同年龄段切片之间同步爆发活动的数量，如本方案所示。此外，还可进行其他方法，如免疫组织化学染色，以回答进一步的问题，例如哪些细胞类型参与了两个脊髓四分体切片之间的功能连接。

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