Name: 早期的病毒进入测定的鉴定和抗病毒化合物的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解早期病毒进入测定方法以评估抗病毒化合物效果。该方案利用荧光素酶报告基因检测病毒传染性，在HUH 7.5细胞中测试化合物对病毒进入阶段的抑制作用，为开发新型抗病毒疗法提供可靠机制研究方法。

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本研究由台北医学大学医院（102TMU-TMUH-19）和中国台湾科技部（MOST103-2320-B-038-031-MY3）资助。

注意：所有涉及细胞培养和病毒感染的操作均须在经过认证的生物安全柜中进行，且生物安全柜的防护等级应与所处理样本的生物安全等级相匹配。为便于描述实验方案，本研究以分泌型高斯荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）作为模型病毒32。在代表性实验结果中，使用柯里酸（chebulagic acid, CHLA）和石榴皮鞣素（punicalagin, PUG）作为候选抗病毒化合物，它们可靶向抑制病毒糖蛋白与细胞表面糖胺聚糖在病毒早期入侵过程中的相互作用31。肝素（heparin）已知可干扰多种病毒的入侵过程30,31,33,34，因此在本实验中作为阳性对照处理。有关病毒学技术的基础知识、病毒扩增、病毒滴定度测定以及感染剂量以空斑形成单位（plaque forming units, PFU）、焦点形成单位（focus forming units, FFU）或感染复数（multiplicity of infection, MOI）表示的方法，读者可参考文献35。有关代表性结果中所涉及病毒的先前研究实例及优化实验条件，读者可参考文献30-32,36-39，以及 表1、图1A 和 图2A 中列出的详细信息。
1. 细胞培养、化合物配制及化合物细胞毒性
<ol>
	<li>培养待分析病毒侵染系统所对应的细胞系（表1对于HCV，将Huh-7.5细胞培养于添加10%胎牛血清（FBS）、200 U/ml青霉素G、200 µg/ml链霉素和0.5 µg/ml两性霉素B的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
	<li>使用相应的溶剂配制待测化合物和对照品：例如，将CHLA和PUG溶于二甲基亚砜（DMSO）中；用无菌双蒸水配制肝素溶液。后续所有稀释步骤均使用培养基进行。 
	注意：在实验中，测试化合物处理组中DMSO的最终浓度低于1%；作为阴性对照，检测中包含1% DMSO处理组用于比较。</li>
	<li>测定受试化合物的细胞毒性（例如，CHLA 和 PUG）处理细胞，随后使用细胞活力检测试剂（如 XTT（2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-苯胺基-羰基]-2H-四氮唑氢氧化物））测定病毒感染后的细胞活力：
	<ol>
		<li>对于HCV，在96孔板中接种Huh-7.5细胞（1 × 104 每孔细胞数）并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 孵育过夜以获得单层细胞。</li>
		<li>向培养孔中分别加入DMSO对照（1%）或梯度浓度的待测化合物CHLA和PUG（例如0、10、50、100和500 μM），每组设三个重复孔。</li>
		<li>37 °C 培养 72 小时，然后弃去培养板中的培养基，用 200 μl 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入100 µl基于XTT的检测溶液 体外 向每孔加入毒性测定试剂盒中的试剂，37 °C 下继续孵育 3 小时，以生成 XTT 甲臜。</li>
		<li>使用微孔板读板仪在检测波长492 nm、参比波长690 nm的条件下测定吸光度。</li>
		<li>使用以下公式计算存活细胞百分比：细胞活力（%）= At / As × 100%，其中“At”和“As”分别代表测试化合物处理组和溶剂对照组（例如1% DMSO）的吸光度。确定50%细胞毒性浓度（CC50根据制造商方案，使用 GraphPad Prism 等分析软件确定受试化合物的 ) 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 病毒感染的检测
注意：病毒侵染的检测结果取决于所使用的病毒系统，可能涉及噬斑测定法或检测报告基因标记病毒的报告信号等方法。以下描述基于荧光素酶报告基因活性检测报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）侵染的方法。
<ol>
	<li>收集感染孔中的上清液，在4 °C条件下，以17,000 × g离心5分钟，进行澄清。</li>
	<li>取20 μl待测上清液与Gaussia荧光素酶检测试剂盒中的50 μl荧光素酶底物混合，按照生产商说明书直接使用发光仪进行检测。</li>
	<li>以相对发光单位（RLU）的log10值表示HCV感染活性，用于确定病毒抑制率（%），并根据生产商方案，采用GraphPad Prism软件中的算法计算受试化合物对HCV感染的50%有效浓度（EC50）。</li>
</ol>
3. 病毒灭活实验
注意：不同病毒的孵育期和病毒剂量示例如 图1A 所示。通过提高MOI/PFU，也可测试更高浓度的病毒。
<ol>
	<li>将 Huh-7.5 细胞接种于 96 孔板中（每孔 1 × 104 个细胞），在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养，以形成单层细胞。</li>
	<li>将待测化合物或对照物（终浓度分别为：CHLA = 50 μM；PUG = 50 μM；肝素 = 1,000 μg/ml；DMSO = 1%）与 HCV 病毒颗粒按 1:1 比例混合，在 37 °C 下孵育（图 1A，“长期”处理）。例如，向含有 1 × 104 FFU 的 100 μl 病毒接种液中加入 100 μl 浓度为 100 μM 的 CHLA 工作液，最终 CHLA 浓度为 50 μM。</li>
	<li>将病毒-药物混合物稀释至待测化合物的“亚治疗”（无效）浓度。例如，CHLA 和 PUG 对 HCV 的无效浓度为 1 μM31；因此需将病毒-药物混合物稀释 50 倍，可通过加入 9.8 ml 基础培养基（含 2% FBS 的细胞培养基）实现。 
	注意：稀释至亚治疗浓度可避免待测化合物与宿主细胞表面发生显著相互作用，从而便于观察药物对无细胞病毒颗粒的作用效果。需注意，该稀释倍数取决于待测化合物对特定病毒感染的抗病毒剂量反应关系，应在进行本实验前预先确定31。</li>
	<li>作为对照，将病毒与待测化合物混合后立即稀释（无孵育过程）至亚治疗浓度，再用于感染（图 1A，“短期”处理）。</li>
	<li>取 100 μl 稀释后的 HCV-药物混合液加入 Huh-7.5 细胞单层中（此时病毒量为 1 × 102 FFU；终 MOI = 0.01），在 37 °C 孵育 3 小时，以允许病毒吸附。</li>
	<li>感染后，移除稀释的接种液，并用 200 μl PBS 轻柔洗涤孔板两次。 
	注意：洗涤操作应轻柔，避免细胞脱落。</li>
	<li>每孔加入 100 μl 基础培养基，在 37 °C 继续培养 72 小时。</li>
	<li>通过检测上清液中的荧光素酶活性来分析病毒感染情况，具体方法见“2. 病毒感染的检测读出”。</li>
</ol>
4. 病毒吸附实验
注意：不同病毒的孵育时间与病毒剂量示例如 图2A“吸附”所示。通过提高MOI/PFU，也可测试更高浓度的病毒。
<ol>
	<li>将 Huh-7.5 细胞接种于 96 孔板中（每孔 1 × 104 个细胞），在含 5% CO2 的培养箱中 37 °C 过夜培养，以形成单层细胞。</li>
	<li>将细胞单层板置于 4 °C 预冷 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，用 HCV 接种物（MOI = 0.01）与待测化合物或对照物（终浓度分别为：CHLA = 50 μM；PUG = 50 μM；肝素 = 1,000 μg/ml；DMSO = 1%）共同处理细胞，持续 3 小时。例如，向含有 1 × 102 FFU 的 90 μl 病毒接种液中加入 10 μl 500 μM CHLA 工作稀释液，最终实现 CHLA 处理浓度为 50 μM，并使细胞单层感染 HCV 的 MOI 达到 0.01。 
	注意：实验需在 4 °C 下进行，因为此温度允许病毒结合但阻止其进入细胞，而病毒进入在 37 °C 时效率最高。请在冰上加入病毒和待测化合物，并将后续孵育置于 4 °C 冰箱中，以确保温度维持在 4 °C。</li>
	<li>吸除上清液，用 200 μl 冰冷 PBS 轻柔洗涤细胞单层两次。 
	注意：洗涤过程应轻柔操作，避免细胞脱落。</li>
	<li>每孔加入 100 μl 基础培养基，在 37 °C 培养 72 小时。</li>
	<li>通过检测上清液中荧光素酶活性来分析最终的病毒感染情况，具体方法见“2. 病毒感染的检测读数”。</li>
</ol>
5. 病毒进入/融合实验
注意：不同病毒的孵育时间与病毒剂量示例见图2A“进入/融合”。也可通过提高感染复数（MOI/PFU）来测试更高浓度的病毒。
<ol>
	<li>将 Huh-7.5 细胞接种于 96 孔板中（每孔 1 × 104 个细胞），在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养，以形成单层细胞。</li>
	<li>将培养板中的细胞单层置于 4 °C 预冷 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下用 HCV（MOI = 0.01）感染细胞，持续 3 小时。例如，使用含有 1 × 102 FFU 的 100 μl&#160;病毒接种物。 
	注意：病毒接种物的添加应在冰上操作，随后在 4 °C 冰箱中孵育，以维持 4 °C 的温度环境，此条件允许病毒结合但不发生内化。</li>
	<li>吸除上清液，并用 200 μl 冰冷的 PBS 轻柔洗涤细胞单层两次。 
	注意：洗涤操作应轻柔进行，避免细胞脱落。</li>
	<li>向各孔加入待测化合物或对照物（终浓度分别为：CHLA = 50 μM；PUG = 50 μM；肝素 = 1,000 μg/ml；DMSO = 1%），在 37 °C 孵育 3 小时。例如，将 10 μl 的 500 μM CHLA 工作液加入 90 μl 培养基中，混匀后处理各孔；最终 CHLA 的处理浓度为 50 μM。 
	注意：从 4 °C 转移至 37 °C 可促进病毒进入/融合过程，从而可评估待测化合物对这一特定步骤的影响。</li>
	<li>吸除含药物的上清液，并通过使用 200 μl 柠檬酸盐缓冲液（50 mM 柠檬酸钠，4 mM 氯化钾，pH 3.0）或 PBS 洗涤，去除未内化的细胞外病毒。每孔加入 100 μl 基础培养基，随后在 37 °C 培养 72 小时。</li>
	<li>通过检测上清液中的荧光素酶活性来分析最终的感染情况，具体方法见“2. 病毒感染的检测读数”。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性利益。

本报告描述了基于解析病毒早期进入事件的机制性方法，用于鉴定和评估抗病毒化合物。具体而言，这些检测方法使我们能够考察待测化合物对游离病毒颗粒、病毒吸附以及病毒进入/融合的影响。通过关键实验步骤的设计，可分别评估药物对病毒早期进入各特定阶段的作用。例如，在“病毒灭活检测”中，将病毒-药物混合物稀释至亚治疗浓度，可通过对药物进行“滴定稀释”来避免其与宿主细胞表面发生显著相互作用。这确保了后续观察到的对宿主细胞感染的抑制作用，是由于待测化合物与无细胞病毒颗粒之间的直接相互作用所致，而非待测化合物对宿主细胞膜或膜相关分子（包括病毒受体）的影响30。类似地，在“病毒吸附检测”和“病毒进入/融合检测”中，温度在4 °C（允许病毒结合但不发生进入）与37 °C（促进病毒进入/融合）之间的转换，对于确定待测化合物对这些特定事件的影响至关重要。这种实验设计的可行性基于包膜病毒在感染过程中这些步骤对温度的敏感性24-29。因此，必须在指定温度下进行检测，以确保结果的准确性；例如，将实验操作置于冰上以维持4 °C，或将样品直接放入37 °C培养箱中实现温度转换。此外，使用阴性对照（如药物配制所用的DMSO溶剂）和阳性对照（如肝素处理）也有助于进一步验证检测方法的准确性。此类方法的有效性和适用性已在多项抗病毒研究中得到证实26,30,31,40,41。需要注意的是，尽管在代表性结果中肝素被用作三项检测的共同对照，但它通常仅阻断病毒的初始结合步骤，而非后续的融合/进入过程（如图2数据所示）。也可采用其他对照，例如针对病毒的中和抗体（用于病毒灭活检测）、可遮蔽病毒细胞表面受体的抗体（用于病毒吸附检测）以及膜融合抑制剂（用于病毒融合/进入检测）。
本报告所述的检测方法特异性针对病毒感染的早期阶段，在应用上可作为二级检测手段，用于表征初筛中发现的候选药物的作用机制，而初筛通常更广泛地靶向病毒感染过程。或者，如果研究目标是特异性寻找病毒早期进入阶段的抑制剂（包括病毒灭活剂、病毒吸附拮抗剂以及病毒进入/融合抑制剂），这些检测方法也可整合到初筛流程中。在此情况下，使用这些方法可实现更集中、更精确的筛选分析，有助于识别出作用机制特异性的抗病毒候选分子，从而加快后续药物研发进程。
基于细胞的检测方法在筛选抗病毒药物方面相较于生化检测具有若干重要优势，包括能够揭示潜在的脱靶效应（如细胞毒性），并增强受试药物生物活性的生理相关性42这些问题对于判断候选药物是否值得进入后续药物开发阶段具有重要意义。同样，本报告所述的早期病毒进入特异性检测方法可在细胞水平上检测药物对病毒进入阶段的作用，更具体地说，是在真实病毒感染背景下进行检测。 体外因此，此类检测所获得的结果将有助于更准确地预测受试化合物的抗病毒功效，并识别其对宿主细胞可能产生的非靶向副作用。然而，一个潜在的局限性是，一种 体外 基于细胞的检测可能无法完全反映实际情况 体内 在自然病毒感染的背景下，该步骤代表了病毒进入细胞的关键环节。尽管如此，本方案中所介绍的检测方法确实可作为基于作用机制的新型抗病毒药物鉴定与评估的分析平台。
报告病毒或报告细胞系统的开发使得病毒侵染量的定量检测成为可能，从而极大地促进了基于细胞的抗病毒化合物筛选与评估。例如，可采用携带报告基因的重组病毒，或利用由特定病毒启动子驱动报告基因表达的重组人细胞系31,43。在本研究中，通过定量检测荧光素酶标记的丙型肝炎病毒（HCV）所产生的报告信号，可便捷地监测病毒感染情况，从而简化数据分析过程。通过整合这些有效的基于报告系统的工具，本文所述的早期病毒入侵检测方法可基本转化为高通量形式，用于针对小分子文库的机制性筛选。
综上所述，本文描述了一种用于解析病毒早期进入过程的实验方案，旨在识别和评估机制特异性的抗病毒化合物。此类实验方法将有助于发现新的病毒进入拮抗剂/抑制剂，并推动抗病毒药物的研发，拓展其在预防性和/或治疗性药物中的应用范围。

病毒感染对公共卫生构成持续威胁，是全球范围内流行性疾病、发病和死亡的重要原因。针对病毒感染的特定防控手段包括疫苗研发和抗病毒治疗。尽管疫苗研发已在预防多种病毒方面取得成功，但许多病毒病原体仍缺乏有效的保护性疫苗，其中包括登革病毒（DENV）、人巨细胞病毒（HCMV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）和呼吸道合胞病毒（RSV）1-5。另一方面，当缺乏预防性疫苗时，抗病毒药物在控制这些病毒感染方面发挥着重要作用。然而，迄今为止，与威胁公共卫生的病毒病原体数量相比，获批且具有成本效益的抗病毒药物仍十分有限。更重要的是，由于全球旅行日益频繁和快速城市化，新发或再发病毒性感染被引入非本土地区，导致疫情暴发的风险增加，使情况进一步恶化6。严重急性呼吸综合征（SARS）病毒、流感病毒（H1N1、H5N1、H3N2 和 H7N9）、DENV、西尼罗河病毒（WNV）、麻疹病毒（MV）、中东呼吸综合征（MERS）病毒以及埃博拉病毒引发的近期疫情6-12，均反映出在免疫接种和/或治疗手段缺失时，抗病毒药物研发的迫切需求。此外，当前使用的抗病毒药物始终存在诱发耐药性感染的潜在风险。因此，持续研发并扩大抗病毒药物对这些新发或再发病毒性感染的覆盖范围，对于制定更有效的管理策略、保障公共卫生安全十分必要。
大多数抗病毒疗法由直接作用的抗病毒药物（DAAs）组成，这类药物靶向病毒生命周期中关键步骤所依赖的特定病毒蛋白或辅助因子。例如，核苷类似物阿昔洛韦可抑制疱疹病毒的DNA聚合酶，蛋白酶抑制剂博赛普韦和特拉匹韦可拮抗丙型肝炎病毒NS3蛋白，而奥司他韦和扎那米韦是神经氨酸酶抑制剂，能够阻断流感病毒颗粒从感染细胞中的释放13-15。然而，目前获批的病毒进入抑制剂非常有限，包括靶向HIV gp41以阻止膜融合的恩夫韦肽，以及阻断HIV共受体CCR5的马拉维若，二者均可防止病毒进入细胞16。探索新型的病毒进入拮抗剂/抑制剂，有助于开发更多可用于预防或治疗的药物，例如与其他作用机制不同的抗病毒药物联合使用，以更有效地控制病毒感染17-19。
抗病毒药物的发现可能涉及基于结构的药物设计和基于候选药物筛选的策略。评估待测药物抗病毒活性的方法包括酶活性的生化检测以及基于细胞系统的评价20-23。在基于细胞的系统中，病毒生命周期可被划分为感染的不同阶段，例如进入事件（吸附、融合、脱壳）、复制阶段（病毒基因组复制和蛋白质翻译）以及病毒粒子释放（组装、成熟和释放）。由于这些检测方法可通过多种工具和手段针对各个特定阶段进行调整，因此该方法可用于识别或研究具有特定作用机制、靶向特定分析阶段的潜在候选抗病毒药物。例如，若要专门分析药物对宿主细胞结合前游离病毒颗粒的作用，可进行“病毒灭活检测”。在此检测中，先使病毒与待测药物共同孵育，然后稀释以去除药物，再用于感染单层细胞。此外，还可通过在感染过程中调节温度，分别分析病毒吸附及进入/融合等其他步骤。对于许多包膜病毒而言，病毒在宿主细胞膜上的进入/融合在37 °C时显著发生，但在4 °C时通常被抑制，而该低温并不影响病毒的结合24-29。最后，使用报告病毒或报告细胞系统可促进这些研究，并实现高通量分析。
我们先前采用基于细胞的方法，解析了多种包膜病毒的早期进入过程，以检测可能拮抗病毒进入的抗病毒化合物30,31。本文描述了所使用的多种方法，包括病毒灭活、病毒吸附以及病毒进入/融合检测。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>基于XTT的体外毒理学检测试剂盒</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>发光检测仪</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

早期病毒进入检测法用于抗病毒化合物的鉴定与评价

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

基于细胞的系统可用于发现抗病毒药物。解析病毒生命周期，特别是早期进入阶段，能够通过机制性方法识别和评估靶向病毒进入特定步骤的抗病毒药物。本报告以丙型肝炎病毒为模型，描述了用于此类目的的病毒灭活、病毒吸附以及病毒进入/融合检测方法。这些检测方法将有助于发现针对病毒早期进入阶段的新型拮抗剂/抑制剂，并扩大候选抗病毒药物的范围，推动后续药物开发。

在图1中，通过“病毒灭活实验”检测了两种特定天然化合物CHLA和PUG是否能够在无细胞体系中灭活不同的包膜病毒，并阻止后续感染。在开展机制研究之前，已确定了这些化合物的细胞毒性和抗病毒剂量反应关系31。实验中，先将病毒与待测化合物预孵育，随后将病毒-药物混合物稀释至亚治疗浓度，再接种至各病毒系统对应的单层细胞上。如图1所示，CHLA和PUG均似乎与无细胞状态的病毒颗粒发生相互作用，产生不可逆效应，从而保护单层细胞免受后续感染。这两种待测化合物对HCMV、HCV和DENV-2的抑制率接近100%，而对MV和RSV的抑制率为60–80%。这些结果表明，CHLA和PUG可直接作用于这些游离病毒颗粒，使其失活并中和其感染性。
在图2中，通过病毒吸附和进入/融合实验，研究了CHLA和PUG对HCMV、HCV、DENV-2、MV和RSV等病毒早期进入相关事件的抑制作用。如病毒感染抑制结果所示（图2，“吸附”：浅灰色柱状图），CHLA和PUG均能有效阻止所研究病毒与其相应宿主细胞的结合。两种化合物对HCMV（图2B）、HCV（图2C）、DENV-2（图2D）和RSV（图2F）的吸附抑制效果相似，抑制率范围为90–100%。另一方面，PUG对MV结合的抑制作用似乎强于CHLA（图2E），两种化合物的抑制率在50–80%之间。作为对照的肝素已知可阻断多种病毒的进入，其同样抑制了HCMV、DENV-2、RSV和MV的吸附，但对HCV的抑制效果较弱。随后进行的“病毒进入/融合实验”旨在检测CHLA和PUG是否在病毒进入/融合阶段仍保持活性（图2，“进入/融合”：深灰色柱状图）。结果再次显示，CHLA和PUG均能有效干扰所研究病毒的进入/融合过程（图2B–F），对相应细胞单层产生50–90%的保护作用。肝素对DENV-2和RSV感染的进入/融合也表现出较强的抑制作用，但对HCMV、HCV和MV的抑制效果较差（平均抑制率<40%）。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>病毒</td>
			<td>细胞类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCMV</td>
			<td>HEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV</td>
			<td>Huh-7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV-2</td>
			<td>Vero</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MV</td>
			<td>CHO-SLAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSV</td>
			<td>HEp-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：病毒感染的宿主细胞类型。 此表列出了代表性结果中所描述的每种病毒感染系统所使用的细胞类型。有关这些细胞的更多详细信息可参见参考文献31。
<img alt="病毒抑制实验示意图；灭活方法及药物疗效分析图。" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 测试化合物 CHLA 和 PUG 对病毒感染的灭活作用。 不同病毒在 37 °C 条件下，经测试化合物长时间处理（滴定前孵育 1.5–3 小时；浅灰色柱）或短时间处理（立即稀释；深灰色柱），随后稀释至亚治疗浓度，并在相应宿主细胞上分析感染情况。（A） 实验示意图（左侧展示），右侧表格中列出了每种病毒的最终病毒浓度（PFU/孔或 MOI）、长期病毒-药物孵育时间（i）以及后续孵育时间（ii）。（B） HCMV、（C） HCV、（D） DENV-2、（E） MV 和 （F） RSV 的分析结果分别显示在各个子图中。结果以 DMSO 阴性对照处理组为基准绘制，数据为三次独立实验的均值 ± 均值标准误（SEM）。本图改编自参考文献31。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="HCMV、HCV、DENV-2、MV、RSV 的病毒抑制实验结果及实验时间线。" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 测试化合物 CHLA 和 PUG 对病毒吸附及进入/融合阶段抗病毒活性的评估。 （A）示意图及相关表格中展示了每种病毒的实验流程、病毒浓度（PFU/孔 或 MOI）以及测试化合物的添加和处理时间（i, ii, iii）。在病毒吸附分析（浅灰色柱状图）中，将不同类型细胞的单层在 4 °C 预冷 1 小时，随后在 4 °C 条件下与相应病毒和测试化合物共同处理 1.5–3 小时（i），之后洗去接种物和测试化合物，再进行后续孵育（37 °C；ii）并检测病毒感染情况。在病毒进入/融合分析（深灰色柱状图）中，接种的细胞单层在 4 °C 预冷 1 小时后，在 4 °C 条件下接种相应病毒 1.5–3 小时（i）。随后将细胞洗涤，并在升高温度至 37 °C 的条件下加入测试化合物继续孵育（ii），以促进病毒的进入/融合过程。孵育结束后，通过柠檬酸缓冲液（pH 3.0）或 PBS 洗涤去除细胞外病毒，细胞再进一步孵育（iii）以检测病毒感染情况。各附加图中分别显示了（B）HCMV、（C）HCV、（D）DENV-2、（E）MV 和（F）RSV 的实验结果。数据以 DMSO 阴性对照处理组的病毒感染水平为基准进行归一化，结果表示为三次独立实验的均值 ± SEM。本图经参考文献31 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种用于研究病毒进入特定步骤的实验方案，以鉴定和评估新型抗病毒药物。

基于细胞的系统可用于发现抗病毒药物。解析病毒生命周期，特别是早期侵入阶段，有助于从机制上……

本实验的总体目标是确定待测化合物对病毒早期进入特定步骤的抗病毒作用。首先，接种易感宿主细胞以建立病毒感染体系；第二步，在不同时间点和温度条件下进行病毒感染及待测化合物处理。接下来，洗去经药物处理的接种物，用基础培养基覆盖细胞。最后一步是孵育细胞。最终通过分析病毒的感染性，以确定受试化合物对病毒感染早期进入阶段的影响。例如，可使用发光仪检测报告病毒侵染后细胞裂解物中的荧光素酶活性。该技术的主要优势在于能够基于作用机制更有效地筛选抗病毒药物，特别是靶向病毒进入过程的化合物。实验开始时，首先配制待测化合物的储备液：将鞣花酸（trilogy acid）或CHLA，以及石榴皮鞣质（PUNIC collagen）或PUG溶于DMSO中；同时将肝素溶于无菌双蒸水中作为阳性对照；并培养宿主细胞以准备进行检测。将人肝癌HUH 7.5细胞在添加了FBS和抗生素的新鲜DMEM中过夜培养。在整个实验过程中，请遵循生物安全二级标准操作，以检测待测化合物的细胞毒性。用浓度从0至500 µM的CHLA或PUG处理细胞，这些化合物用基础培养基稀释，同时以1% DMSO作为阴性对照，然后将细胞置于37°C的细胞培养箱中孵育72小时。移除培养基，并用 200 µL PBS 洗涤细胞两次。随后加入 100 µL XTT 检测试剂，于 37 °C 孵育 3 小时。然后使用微孔板读板仪在 492 nm 处测定吸光度，参考波长为 690 nm。根据这些数值，使用给定公式计算存活率百分比。确定每种化合物的50%细胞毒性浓度。开始进行病毒灭活实验。第一块培养板，每孔接种一乘以十的四次方个细胞。将细胞接种于96孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，以促进细胞贴壁及后续感染。按照文中所述实验方案制备携带Gaussia荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）颗粒。在无菌管中，将100微升100微摩尔的CHLA或PUG与100微升第四代10个焦点形成单位（FFU）的HCV混合，作为阳性对照；HCV与肝素混合，终浓度为每毫升1000微克。在37摄氏度下孵育三小时。三小时后，用9.8毫升室温基础培养基将病毒复合物混合液稀释50倍。然后制备新的病毒复合物混合液，并立即用基础培养基稀释，用于零小时孵育样本。从细胞中移除孵育液后，每孔加入100微升稀释的病毒药物溶液，设三个复孔。此时溶液含有每孔10²个噬斑形成单位（FFU），在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育三小时，以使病毒感染细胞。孵育结束后，从孔中移除病毒悬液，并用200微升磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞两次。将细胞在 100 微升基础培养基中孵育 72 小时，以进行病毒复制并将荧光素酶报告分子释放到上清液中。随后收集培养物和微量管中的上清液，在 4 摄氏度下以 17,000 × g 离心五分钟。为去除细胞碎片，将每份上清液 20 微升与 50 微升高斯荧光素酶检测试剂混合，然后使用发光仪检测荧光素酶报告活性所产生的发光信号。根据病毒吸附实验板的制造商说明，每孔接种 1 × 10⁴ 个细胞。在 96 孔板中孵育过夜，使细胞于次日早晨贴壁。首先，将含有细胞单层的 96 孔板置于 4 °C 预冷一小时。将测试化合物与病毒混合物置于冰上制备。例如，H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO 或阳性对照 HCV 肝素溶液，其中含有 10² FFU 病毒。每种处理组均需轻柔地从细胞培养孔中吸除培养基。随后立即向三个复孔中分别加入 100 微升病毒测试化合物混合物，注意避免温度升高。将培养板置于维持在 4°C 的冰箱中孵育 3 小时。病毒颗粒将在 4°C 下结合于细胞表面，但不会被内化。接下来，吸除上清液。用 200 µL 冰冷的 PBS 轻柔洗涤细胞两次，每孔加入 100 µL 基础培养基，然后在 37 °C 下孵育 72 小时。最后，为了定量测定感染细胞中释放的荧光素酶报告分子。收集每个样品孔中的上清液，并进行高斯荧光素酶检测，以分析病毒融合与进入。将细胞培养板在 4 °C 预冷一小时。细胞经孵育过夜以促进贴壁后，移除各孔中的原有培养基，并在冰上用 10² PFU HC-V 感染细胞。将培养板置于 4°C 孵育 3 小时。用 200 µL 冰冷的 PBS 轻柔洗涤细胞两次，以去除未吸附的病毒。然后将细胞置于冰上，用溶解于基础培养基中的待测化合物处理细胞，或以含1% DMSO的基础培养基作为对照，于37摄氏度孵育3小时。此步骤可用于评估待测化合物对发生在37摄氏度的病毒进入过程的影响。吸去培养基，并用200微升柠檬酸盐缓冲液或PBS洗涤两次，以去除未内化的病毒。每孔加入 100 µL 基础培养基，37 °C 继续孵育 72 小时。收集上清液，并按照之前所述方法进行高斯荧光素酶检测，以检测释放的荧光素酶报告分子。以下是测试化合物对 HCV 的影响。在激活实验中，病毒在感染前与测试化合物孵育 0 或 3 小时。绘制了每种处理对病毒感染的抑制率。阴性对照DMSO未显示抑制作用。CHLA在接触时即表现出显著抑制作用，零小时孵育后以及三小时较长时间孵育后均具有高效抑制。使用另一种检测方法的附加结果。此处展示了化合物 PUG，采用这一通用实验设计，CHLA 和 PUG 被证明还可抑制人巨细胞病毒（HCMV）在胚胎肺成纤维细胞中的感染性。此处展示了 CHLA 和 PUG 对 HCV 附着的影响。请注意，细胞在四摄氏度条件下与病毒共同孵育，同时存在或不存在测试化合物，随后去除未结合的病毒，再将细胞在三十七摄氏度条件下孵育，以实现病毒感染。阴影柱状图展示了 C-H-L-A-P-U-G 或肝素对 HCV 进入细胞的影响。请注意，本实验中病毒的吸附首先在四摄氏度下进行。随后，在去除未结合的病毒后，将细胞在37摄氏度条件下与待测化合物共同孵育，以检测病毒进入情况。类似地，在HCMV的情况下，用CHLA或PUG处理胚胎肺成纤维细胞的感染过程，显示出对病毒吸附和病毒进入的强烈抑制作用。在进行该操作时，务必注意在指定温度下执行各步骤，这将影响实验结果的准确性。

early-viral-entry-assays-for-identification-evaluation-antiviral

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

早期的病毒进入测定的鉴定和抗病毒化合物的评价

来源：Lucas-Hourani, M. 等.，RNA病毒广谱化学抑制剂的高通量筛选。J. Vis. Exp.

基于荧光素酶的检测法在人胚胎肾细胞中评估抗病毒化合物

本视频展示了病毒灭活实验，演示了抗病毒药物对病毒颗粒作用效果的评估过程。...

通过病毒灭活实验评估抗病毒测试化合物的有效性

本视频演示了一种用于筛选抗病毒化合物的病毒吸附实验。通过使用基因修饰的丙型肝炎病毒和荧光素酶，检测化合物对病毒吸附的抑制作用，表现为共处理孔中的发光强度低于仅用病毒处理的对照孔。...

一种用于抗病毒化合物筛选的病毒吸附实验

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via...

一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。...

检测针对蓝舌病毒新型抗病毒药物的实验方法

体外检测病毒复制的实验方法已因表达荧光素酶或其他可产生生物发光的酶的重组RNA病毒的发展而得到显著改进。本文详细介绍了一种高通量筛选流程，该流程结合了麻疹病毒和基孔肯雅病毒的此类重组毒株，用于从化合物库中筛选广谱抗病毒药物。...

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的结合。我们报告了一种基于定量（q）RT-PCR...

高灵敏度检测方法用于测量沙粒病毒与细胞的结合

本实验方案的目的是展示与病毒进入相关的不同检测方法，这些方法可用于鉴定候选的病毒进入抑制剂。...

利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。...

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

了解早期病毒进入测定方法以评估抗病毒化合物效果。该方案利用荧光素酶报告基因检测病毒传染性，在HUH 7.5细胞中测试化合物对病毒进入阶段的抑制作用，为开发新型抗病毒疗法提供可靠机制研究方法。

早期病毒进入检测法用于抗病毒化合物的鉴定与评价

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