早期的病毒进入测定的鉴定和抗病毒化合物的评价
October 29th, 2015
在这里，我们提出了一个方案，该方案检查了病毒进入的具体步骤，以识别和评估新型抗病毒药物。
该程序的总体目标是确定测试化合物对早期病毒进入的特定步骤的抗病毒作用。这是通过首先接种用于病毒感染的宿主细胞来实现的。第二步是在不同时间和温度下进行病毒感染和测试化合物处理。
接下来，洗去药物处理的接种物，用基础培养基覆盖细胞。最后一步是孵育细胞。最终，分析病毒感染性以确定测试化合物对病毒感染早期病毒进入步骤的影响。
例如，光度计用于评估报告病毒感染后细胞 snat 中的荧光素酶活性。该技术的主要优点是它可以允许使用更多基于机制的方法来识别抗病毒药物，尤其是那些针对病毒进入的药物。首先，在 DMSO 中制备测试化合物、三联体酸或 CHLA 和 PUNIC 胶原蛋白或 PUG 的储备溶液，在无菌双蒸水中溶解肝素作为阳性对照，以制备用于测定培养的宿主细胞。
人肝癌，HUH 7.5 细胞在补充有 FBS 和抗生素的新鲜 DMAM 中过夜。请记住在整个实验过程中遵循生物安全二级程序，以测试测试化合物的细胞毒性。用在基础培养基中稀释的 CHLA 或 PUG 浓度递增至 500 微摩尔或 1% DMSO 作为阴性对照处理细胞，然后在 37 摄氏度下在细胞培养箱中孵育细胞 72 小时。
去除培养基，用 200 μL PBS 洗涤细胞两次。接下来，加入 100 μL XT T 检测试剂，并在 37 摄氏度下孵育 3 小时。然后使用酶标仪测定 492 纳米处的吸光度，参考波长为 690 纳米。
使用给定公式从这些值中计算活力百分比。确定每种化合物的 50% 细胞毒性浓度。开始病毒灭活测定。
第一板，每孔 1 乘以 10 至第四个细胞。在 96 孔板中，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜，以便附着感染。按照文本方案中引用的准备 Gaia 荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒或 HCV 颗粒。
在无菌管中，将 100 微升 100 微摩尔的 CHLA 或 PUG 与 100 微升的 10 至四分之一混合。用于阳性对照混合物的 HCV 的焦点形成单位或 FFU。肝素终浓度为 1000 μg/mL 的 HCV。
在 37 摄氏度下孵育 3 小时。3 小时后，在室温下用 9.8 毫升基础培养基将病毒化合物混合物稀释 50 倍。然后制备新的病毒化合物混合物，并立即在基础培养基中稀释该混合物，用于零小时孵育样品。
从细胞中去除孵育培养基后，每孔加入 100 μL 稀释的病毒药物溶液，一式三份。该溶液现在每孔含有 10 个到第二个 FFU，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 小时，以允许病毒感染细胞。孵育后，从孔中取出病毒悬液，并用 200 微升 PBS 轻轻洗涤细胞。两次。
将细胞在 100 μL 基础培养基中孵育 72 小时，以进行病毒复制并将荧光素酶报告基因释放到上清液中。然后从培养物和微量试管中收集上自然子，并在 4 摄氏度下以 17， 000 倍 G 离心 5 分钟。为了去除细胞碎片，将 20 微升每种超级物质与 50 微升高斯荧光素酶测定试剂混合，并在发光计中测量荧光素酶报告基因活性的发光。
根据制造商对病毒附着测定板的说明，每孔 1 乘以 10 至第四个细胞。在 96 孔板中，孵育过夜，第二天早上进行细胞贴壁。首先冷却，将含有细胞单层的 96 孔板在 4 摄氏度下冷却 1 小时。
在冰上准备测试化合物和病毒混合物。例如，H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSO 或阳性对照 HCV 肝素溶液，含有 10 至第二种 FFU 病毒。对于每次处理，轻轻地从细胞培养孔中吸出培养基。
然后立即在一式三份孔中加入 100 微升病毒检测化合物混合物，注意不要升高温度。将板在 4 摄氏度的冰箱中孵育 3 小时。病毒颗粒会在 4 摄氏度时附着在细胞服务上，但不会被内化。
接下来，吸出上清液。用 200 微升冰冷溶液轻轻洗涤细胞两次。PBS 向每个孔中加入 100 微升基础培养基，然后在 37 摄氏度下孵育 72 小时。
最后，用于定量从感染细胞中释放的荧光素酶报告基因。从每个样品孔中收集上自然，并进行高斯荧光素酶测定，以测定病毒融合和进入。将细胞培养板在 4 °C 下预冷 1 小时。
细胞贴壁孵育过夜后，从孔中取出现有培养基，并在冰上用 10 到第二个 F-F-U-H-C-V 感染细胞。将板在 4 摄氏度下孵育 3 小时。用 200 μL 冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除未粘附的病毒。
然后在冰上，用溶解在基础培养基或基础培养基中的测试化合物处理细胞，以 1% DMSO 作为对照，并在 37 摄氏度下孵育板 3 小时。这允许评估病毒进入时的测试化合物，病毒进入发生在 37 摄氏度。吸出培养基，并用 200 μL 柠檬酸盐缓冲液或 PBS 洗涤未内化的病毒两次。
每孔添加 100 μL 基础培养基，并在 37 摄氏度下再孵育 72 小时。收集 supernat 并如前所述进行高斯荧光素酶测定，以检测释放的荧光素酶报告基因，如下所示 以下是测试化合物对 HCV 的影响。在激活时，病毒在感染前与测试化合物孵育 0 或 3 小时。
绘制每种治疗的病毒感染抑制百分比。阴性对照 DMSO 显示无抑制。CHLA 在接触时、零小时孵育后以及较长的孵育 3 小时后表现出高抑制性。
其他检查的其他结果。这里显示了化合物 PUG，适应这种一般实验设计，CHLA 和 PUG 被证明额外抑制胚胎肺成纤维细胞中人巨细胞病毒或 HCMV 的感染性。CHLA 和 PUG 对 HCV 附着的影响如下所示。
回想一下，在存在或不存在测试化合物的情况下，将细胞与 4 摄氏度的病毒一起孵育，然后去除未结合的病毒细胞在 37 摄氏度下孵育以防病毒感染。阴影条显示 C-H-L-A-P-U-G 或肝素对 HCV 进入细胞的影响。请注意，在这种情况下，病毒附着首先在 4 摄氏度下进行。
然后在去除未结合的病毒后，将细胞与测试化合物在 37 摄氏度下孵育以进入病毒。同样，在 HCMV 的情况下，用 CHLA 或 PUG 处理胚胎肺成纤维细胞感染显示出对病毒附着和病毒进入的强烈抑制。在尝试此过程时，请务必记住在指定温度下执行步骤，这会影响结果的准确性。
概述
该协议检查病毒进入的具体步骤，以评估新型抗病毒药物。它侧重于确定测试化合物对病毒感染早期阶段的抗病毒效果。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 抗病毒研究
- 细胞培养技术
背景
- 了解病毒进入对开发抗病毒疗法至关重要。
- 识别抑制病毒进入的化合物可以导致有效的治疗方法。
- 本研究利用基于机制的方法来评估抗病毒药物。
- 荧光素酶分析被用来测量病毒感染性。
研究目的
- 评估特定化合物对病毒进入的抗病毒效果。
- 建立体外测试抗病毒药物的协议。
- 增强对病毒进入抑制机制的理解。
使用的方法
- 为病毒感染接种宿主细胞。
- 在各种条件下进行病毒感染和化合物处理。
- 使用荧光素酶分析来分析病毒感染性。
- 评估测试化合物对宿主细胞的细胞毒性。
主要结果
- 测试化合物显示出不同程度的抗病毒活性。
- 荧光素酶活性与抗病毒药物的有效性相关。
- 确定了病毒进入抑制的最佳条件。
- 阐明了化合物的作用机制。
结论
- 该协议提供了一种评估抗病毒药物的可靠方法。
- 研究结果有助于理解病毒进入机制。
- 未来的研究可以在此框架上建立以发现新的抗病毒疗法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Dissecting early viral entry using cell-based assays enables mechanistic de-risking and target validation for antiviral discovery. Quantitative evaluation of compound effects on viral inactivation, attachment, and entry/fusion supports predictive confidence at the hit-to-lead inflection point. These assays expand the portfolio of candidate antivirals by clarifying mechanism of action and supporting translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Mechanistic dissection of viral entry steps enables functional target validation for antiviral compounds.
- Quantitative luciferase readouts clarify compound effects on discrete viral entry mechanisms.
- Assays support predictive confidence for triaging early-stage antiviral candidates.
- Workflow enables biological de-risking by isolating compound action at inactivation, attachment, or entry/fusion.
Screening & Assay Development
- Validated cell-based systems provide reproducible platforms for high-throughput antiviral screening.
- Standardized luciferase assays yield quantitative, scalable outputs for compound evaluation.
- Assay modularity allows adaptation to multiple viral models and compound classes.
- Screening readiness is enhanced by robust cytotoxicity and infectivity controls.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic insights into viral entry inhibition inform translational biomarker strategies.
- Assays bridge discovery and preclinical validation by supporting cross-virus applicability.
- Quantitative outputs facilitate risk-adjusted advancement of antiviral leads.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position early in the antiviral discovery continuum, supporting progression from target validation through lead identification and preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on compound mechanism at discrete viral entry steps.
- Screening: Provides reproducible, quantitative infectivity and cytotoxicity measurements for compound triage.
- Analytics: Delivers statistical outputs for comparing compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Supports continuity by adapting assays to additional viral models and informing biomarker development.
- Enterprise Reuse: Modular assay design allows reuse across antiviral discovery programs targeting diverse viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antiviral candidate selection.
- Operational Value: Standardizes early-stage antiviral evaluation with scalable, reproducible assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program assay harmonization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and quantitative assay development.
- Needs access to BSL-2 facilities, luminometers, and microplate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay conditions and controls.
- Assay protocols must be adapted for different viral models and compound classes.
- Temperature and timing precision are critical for accurate mechanistic dissection.
