Name: 在代谢分析准备线粒体富集级的果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解从黑腹果蝇中分离富集线粒体组分的方法，用于代谢组学研究。该技术通过差速离心提高线粒体代谢物检测灵敏度，揭示整体分析无法发现的细微代谢变化。

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本工作得到了阿德尔菲大学教师发展基金以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）授予EVC的R15GM113156基金、NIGMS授予DMR的R01GM067862基金和美国国家老龄化研究所（NIA）授予DMR的R01AG027849基金的支持。

1. 试剂与溶液
<ol>
	<li>果蝇食物与培养基的制备
	<ol>
		<li>将果蝇食物成分（11% 蔗糖、2% 自溶酵母、5.2% 玉米粉、0.79% w/v 琼脂）加入水中，在设定为 90 °C 的加热板上加热。持续搅拌，直至形成均匀且略稠的混合物。最终配制 550 ml 果蝇食物，用于填充 100 个试剂瓶，每瓶含 5 ml 果蝇食物。</li>
		<li>从热源移开，间歇搅拌，待食物冷却至 80 °C 后，加入溶解于 95% 乙醇中的 0.2% 对羟基苯甲酸甲酯（Tegosept）。</li>
		<li>将食物均分为两份。向其中一份加入 1.1 ml 溶于乙醇的 50 mM 雷帕霉素，向另一份加入 1.1 ml 乙醇。将雷帕霉素和乙醇溶液充分搅拌混入食物中。注意：添加药物前，确保温度已降至 50 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离缓冲液
	<ol>
		<li>在水中配制 500 ml 分离缓冲液 [225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、2.5 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)]。</li>
		<li>使用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。初始 pH 呈酸性。</li>
		<li>使用孔径为 0.22 µm 的无菌滤膜过滤瓶对溶液进行灭菌，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤缓冲液
	<ol>
		<li>在水中配制 500 ml 洗涤缓冲液 [225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、10 mM KCl、10 mM Tris HCl、5 mM KH2PO4]。</li>
		<li>使用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。初始 pH 呈酸性。</li>
		<li>使用孔径为 0.22 µm 的无菌滤膜过滤瓶对溶液进行灭菌，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 饲养 果蝇 菌株
<ol>
	<li>为控制幼虫发育期间的密度，将25对亲代果蝇放入一个培养瓶中，让其产卵48小时。</li>
	<li>48小时后移除亲代果蝇，以调控卵的密度。</li>
	<li>使用新羽化的F1子代重复步骤2.1和2.2，以实现连续两代的密度控制。</li>
	<li>收集成虫时，使用二氧化碳（CO2）麻醉果蝇，并按性别分离。
	<ol>
		<li>使用单级调节器将高压气罐中的纯CO2以5 psi的恒定流速输出。为避免静电，使用塑料管将CO2导入装有水的500 ml抽滤瓶中进行催化。</li>
		<li>用带一个孔的橡胶塞密封抽滤瓶，再用塑料管将抽滤瓶的侧口连接至CO2麻醉垫。</li>
		<li>将果蝇置于麻醉垫中不超过10–15分钟。麻醉后需恢复24小时，再将其置于实验条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获得足量代谢物用于线粒体富集组分的提取，每样本使用300只果蝇。此处使用雌性果蝇，但其他实验中性别可能不同。将150只果蝇转移至自制的1 L种群培养笼中，提供装有5 ml果蝇食物的试管供其取食。</li>
	<li>将剩余的150只果蝇转移至另一个1 L培养笼中。每个笼子中果蝇数量不得超过150只，避免过度拥挤。</li>
	<li>每种实验条件设置六个重复样本。由于全动物提取物可获得更多的代谢物，为制备一份全动物提取样本，将50只雌性果蝇转移至一个培养笼中。对于线粒体分离样本，每种实验条件同样需设置六个重复样本。</li>
	<li>将培养笼置于25 °C环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。</li>
	<li>每隔2至3天更换一次新鲜食物，每次在试管中提供5 ml食物，以维持食物质量。</li>
	<li>将果蝇在食物上维持10天。此步骤适用于雷帕霉素处理7，其他处理或条件可能有所不同。</li>
</ol>
3. 线粒体组分的分离
<ol>
	<li>将一个笼子中的果蝇（150只）倒入装有1 ml预冷分离缓冲液的玻璃-聚四氟乙烯Dounce匀浆器中。</li>
	<li>上下移动研杵进行15次匀浆。将研钵置于冰上，以保持线粒体完整。</li>
	<li>将匀浆液转移至1.5 ml离心管中，在4 °C下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>取上清液，在4 °C下以6,000 × g离心10分钟，以富集线粒体。</li>
	<li>由于上清液含有胞质组分，弃去上清液或用于其他实验。将沉淀重悬于300 µl洗涤缓冲液中。</li>
	<li>对第二个笼子重复步骤3.1–3.5。将两个笼子的重悬沉淀合并至一个冷冻微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以6,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀在液氮中速冻。</li>
	<li>将富集的线粒体组分储存于-80 °C或更低温度。
	<ol>
		<li> alternatively，对于全动物样品制备，将成虫放入冷冻微量离心管中。将管子在液氮中速冻，并将成虫储存于-80 °C或更低温度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
<li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+international+journal+of+organic+evolution%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li>
<li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li>
<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中最关键的步骤包括：1）在充足空间内饲养足够数量的果蝇。每个种群培养笼中的果蝇数量不得超过150只，避免过度拥挤至关重要；2）频繁更换培养笼中的食物，以防止食物竞争和营养胁迫；3）所有样品均需在4 °C条件下保存，以确保线粒体组分分离过程中的完整性。建议在使用前将分离缓冲液、洗涤缓冲液以及玻璃-聚四氟乙烯研磨器预冷。为减少细胞质对富集线粒体组分的污染，可使用洗涤缓冲液对步骤3.5中获得的线粒体沉淀进行洗涤。
从富集的线粒体组分中提取代谢物需要大量的重复样本（每个实验条件6个重复）。总共需要使用24个笼子用于图1和图2。我们建议在同一天完成所有样本的提取，以降低实验变异性。尽管该方案可行，但仍需提前仔细规划并准备所需材料。需提前对试管进行标记，并制定计划以确保各样本间等待时间的一致性，从而保持样本质量并减少重复样本之间的差异。
提取线粒体通常使用的缓冲液含有糖类10,11；因此，特定糖代谢物的分析可能受到提取方法的影响。尽管我们在分析...

本实验的目的是制备富含线粒体的组分，以获得足量的线粒体代谢物用于代谢组学研究 黑腹果蝇在我们的经验中，使用全细胞提取方法进行代谢组学分析无法检测到线粒体代谢物的细微变化 果蝇然而，在代谢组学分析之前进行线粒体分级分离可提高检测线粒体代谢物变化的灵敏度。
线粒体是细胞器，负责为细胞正常功能提供所需90%的能量1。近年来人们认识到，线粒体在细胞和有机体功能中的作用远比仅生成三磷酸腺苷（ATP）更为动态，现已被视为调节代谢稳态的核心枢纽2,3。线粒体是内共生过程的产物，大约15亿年前不同的微生物谱系融合而形成4。随着线粒体进化为真正的细胞器，内共生体的基因被整合到逐渐形成的细胞核基因组中。目前在动物中，约有1500种线粒体蛋白由细胞核基因编码，而37个基因仍保留在线粒体DNA（mtDNA）中，其中13个基因编码氧化磷酸化酶复合物的亚基蛋白5。为维持线粒体正常功能，需要线粒体与细胞核之间进行协调。
利用此处所述方法，我们能够检测线粒体代谢的变化 果蝇 线粒体与细胞核基因组之间协调性被操控后所产生的结果。我们使用了一种菌株 果蝇 其姐妹物种的线粒体DNA D. simulans 置于单个 D. melanogaster 细胞核背景6. 将这种“紊乱的”线粒体-核基因型与“天然的”或共同进化的线粒体-核基因型进行比较 D. melanogaster 携带与其原生个体相同的细胞核基因组 D. melanogaster 线粒体DNA。该 D. melanogaster 和 D. simulans mtDNA 在约 100 个氨基酸上存在差异 &#62;影响线粒体-细胞核通讯的500个同义突变7,8我们制备了完整果蝇提取物及线粒体富集提取物，以研究代谢物在药物应激下的变化情况。本文结果显示，在使用线粒体富集组分时，可检测到携带天然共进化基因型的样本中线粒体代谢物发生显著变化 D. melanogaster 线粒体DNA和携带断裂基因型 D. simulans 线粒体DNA。相比之下，使用常规的全果蝇提取物方法检测时，这两种基因型之间的代谢物变化较为细微。因此，该方法为理解线粒体DNA如何介导线粒体对不同药物的响应变化提供了途径。

<table><tbody><tr><td>0.2% 对羟基苯甲酸甲酯</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>用于麻醉果蝇的 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫片</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L 培养笼</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L 培养笼盖</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>玻璃-聚四氟乙烯研磨器&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素&amp;nbsp;</td><td>LC Laboratories&amp;nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>抗孔蛋白抗体</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>抗α-微管蛋白抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫片</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>抽滤瓶</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>橡胶塞</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

用于代谢分析的线粒体富集组分的制备 黑腹果蝇

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

由于线粒体参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及脂肪酸氧化，线粒体功能缺陷常常严重影响患有这些复杂疾病的患者的生命。检测线粒体代谢变化对于理解线粒体疾病以及线粒体对药物干预的反应至关重要。尽管线粒体代谢处于代谢调控的核心地位，但在利用完整生物体或完整组织提取物进行分析时，细胞质代谢物的过度丰度可能会掩盖线粒体代谢的细微变化，从而阻碍对这些变化的检测。
在此，我们描述了一种分离方法，该方法检测到线粒体代谢发生了显著变化 果蝇 在完整果蝇样品与线粒体富集样品之间存在差异。为说明该方法的灵敏度，我们使用了一组 果蝇 携带遗传多样性线粒体DNA（mtDNA）的细胞经雷帕霉素处理后，我们利用该方法发现雷帕霉素以依赖于线粒体基因型的方式调控线粒体代谢。然而，在代谢组学研究中，当代谢物提取自线粒体富集组分时，这些变化表现得更为显著。相比之下，全组织提取物仅能检测到由雷帕霉素介导的代谢改变，且该改变与mtDNA无关。

根据上述方案，我们对线粒体富集组分和全动物提取物进行了代谢组学分析，以检测药物雷帕霉素对不同线粒体DNA的影响7。通过将药物溶解于果蝇食物中，以200 µM的浓度给予雷帕霉素，果蝇暴露于该药物处理持续10天。采用标准溶剂提取方法，结合气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）和液相色谱-串联质谱技术（LC/MS/MS），分别从全果蝇提取物和线粒体提取物中获取代谢物。
图1 显示膜转运蛋白孔蛋白（porin）的富集，作为线粒体组分中线粒体富集的指标。在胞质组分中未检测到孔蛋白。相反，微管蛋白（tubulin）在线粒体组分中未被检出，表明胞质蛋白污染极少。 图2 和 图3 显示来自“天然”样本的完整代谢物谱的主成分分析（PCA） D. melanogaster 菌株（OreR）以及携带...

线粒体在调节代谢和稳态中发挥核心作用。在线粒体代谢中可能影响生物体生理功能的细微变化，在整体生物体代谢组学研究中往往难以被检测到。本文介绍一种分离方法，可增强对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中细微代谢变化的检测能力。

由于线粒体参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂肪酸氧化，线粒体功能缺陷通常……

以下实验的总体目标是获得富含线粒体的组分，以获取足量的线粒体代谢物，用于黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的代谢组学研究。首先需培养足够数量的果蝇，以获得可用于制备线粒体富集组分的足量代谢物。第二步是将果蝇在玻璃-聚四氟乙烯匀浆器中进行匀浆处理，该过程可破坏细胞膜，同时不损伤线粒体的完整性。接下来，将匀浆进行差速离心，以获得富集的线粒体样品。结果表明，利用本方案可检测到显著的线粒体代谢变化，而这些变化在基于全虫提取物和线粒体富集组分的全代谢组学分析中均未被发现。与全果蝇代谢组学分析相比，该方法的主要优势在于：在代谢组学分析前先分离线粒体，可提高检测灵敏度，并更有效地检测线粒体代谢物的变化。实验开始时，将果蝇培养基成分置于加热板上，加热至90摄氏度。持续搅拌混合物，直至其均匀且略呈稠状。将培养基从热源移开，当温度降至80摄氏度时，间歇性搅拌；随后加入0.2% TE脱甲基对羟基苯甲酸酯，溶于95%乙醇中。接下来，将培养基均分为两等份。确保食物温度降至 50 摄氏度后，将 1.1 毫升溶于乙醇的 50 毫摩尔雷帕霉素加入第一份食物中，同时将 1.1 毫升未经处理的乙醇加入第二份食物中。收集成虫时，使用单级调节器将高压气罐中的纯二氧化碳输出。以每秒 5 PS 的恒定流速，通过塑料管将二氧化碳导入一个 500 毫升的抽滤瓶，该抽滤瓶连接有导管，使二氧化碳通过水进行鼓泡，从而避免静电产生。为此，使用带有单孔的橡胶塞密封烧瓶。将烧瓶侧孔通过塑料管连接至二氧化碳垫，以控制幼虫发育过程中的密度。将25对亲本放入培养瓶中，使其产卵48小时。然后移除亲代以调控卵的密度，并使用新出现的F1代后代重复这些步骤，以实现两代的密度控制。在密度受控条件下经过两代后，按性别分离果蝇，将果蝇放置在垫上不超过10至15分钟。在将果蝇置于实验条件之前，使其从麻醉状态恢复24小时。每个样本指定 300 只果蝇，以产生足量的代谢物用于线粒体富集组分的制备。将 150 只果蝇转移至一个自制的一升笼中，再将剩余的 150 只果蝇转移至另一个一升笼中，每个笼中果蝇数量不得超过 150 只。每个实验条件使用六个重复样本，将笼子置于25摄氏度、12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，以完成黑腹果蝇的培养。在含有五毫升食物的试管中，每两到三天为果蝇提供一次新鲜食物，以维持食物质量，持续共10天。开始分离时，将一个笼子中的果蝇倒入装有一毫升预冷分离缓冲液的玻璃聚四氟乙烯下部匀浆器中。接下来，将一些研钵置于冰上以保持线粒体的完整性，并用15次研磨匀浆果蝇。注意不要旋转研杵，将匀浆液转移至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以300 × g离心5分钟。将上清液转移至另一新管中，在4°C条件下以6,000 × g离心10分钟，以富集线粒体。离心后，弃去含有胞质组分的上清液。用移液器反复吹打，将沉淀重悬于300 µL洗涤缓冲液中。轻柔地重复上述步骤，用于第二个笼式陀螺。然后将两个笼子中重悬的沉淀合并至一个低温离心管中，于4°C下以6,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并用液氮速冻沉淀。最后将线粒体富集组分储存在-80°C下。该蛋白免疫印迹结果显示线粒体膜转运蛋白 poin 的富集，表明线粒体组分中线粒体实现了有效分离。在细胞质组分中无法检测到 poin 蛋白，而细胞质微管蛋白 tubulin 在线粒体组分中未被检测到，说明细胞质蛋白的污染极少。主成分分析（PCA）是基于质谱分析所得数据生成的，这些数据已根据 Bradford 法测定的蛋白浓度进行归一化处理，经对数转换，并截除各化合物的最低检测值后完成。使用完整的代谢物数据生成了主成分分析（PCA）图。通过标准的整只果蝇提取物获得的原代和破坏型果蝇菌株的代谢物谱，可与线粒体富集提取物中的代谢物进行比较。在基于线粒体富集提取物代谢物的PCA图中，整只果蝇的代谢物谱在第二主成分（PC2）轴上明显分离，反映了雷帕霉素处理的主要效应。不同M-T-D-N-A基因型之间的差异则较为细微。相比之下，线粒体富集提取物的代谢物谱显示，正常食物条件下的天然 M mt DNA 基因型与其他三个样本之间存在明显分离：即雷帕霉素处理下的天然 MTD NA，以及正常或雷帕霉素食物条件下的替代型 MTD NA。这表明，替代型 MTD NA 对代谢物谱的影响方式类似于雷帕霉素处理的效果。在执行本方案时，为降低重复样本间的变异性，建议将所有处理步骤均在同一天内完成。我建议提前制定好计划，对试管进行标记，并记录好各重复样本之间的等待时间，以提高样本制备的质量。

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在代谢分析准备线粒体富集级的<em&gt;果蝇</em

在本视频中，我们将向您展示如何利用凝胶内活性检测方法分析人类胚胎干细胞线粒体呼吸链复合物。...

检测人类胚胎干细胞中线粒体复合物的活性

我们介绍一种从酵母Saccharomyces...

从酵母细胞中纯化线粒体

本实验步骤介绍了如何从成年小鼠脑组织中分离线粒体相关内质网膜（MAMs），以及从MAMs和线粒体组分中提取糖鞘脂富集的微结构域组分。...

线粒体相关内质网膜（MAMs）和糖鞘脂富集微区（GEMs）：从小鼠脑组织中分离

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。...

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

在本方案中，我们展示了连续切片电子断层扫描技术在阐明果蝇（Drosophila）间接飞行肌线粒体结构中的应用。...

三维线粒体超微结构 果蝇 通过连续切片电子断层扫描揭示的间接飞行肌

本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法测量果蝇透化胸段耗氧量的方法。与传统的线粒体分离技术相比，该技术所需组织量极少，且获得的结果更具生理相关性。...

利用少量组织测量果蝇透化肌纤维的线粒体耗氧量

本方案描述了如何制备用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）进行代谢组学分析的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫。...

用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）代谢组学分析的 Drosophila 幼虫样品制备

我们介绍了一种用于测量黑腹果蝇（Drosophila...

代谢分析 黑腹果蝇 幼虫和成体大脑

尽管近年来取得了进展，许多酵母线粒体蛋白的功能仍然完全未知。本方案提供了一种简单且可靠的方法来确定蛋白质的线粒体亚结构定位，这对于阐明其分子功能至关重要。...

酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中线粒体亚结构蛋白定位的评估

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

本文介绍了一种高分辨率呼吸测定方案，用于分析PINK1B9基因缺失突变果蝇中的生物能量学。该方法采用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定（SUIT）方案。...

使用高分辨率呼吸测定法分析 Drosophila melanogaster PINK1B9 缺失突变体中的线粒体功能

了解从黑腹果蝇中分离富集线粒体组分的方法，用于代谢组学研究。该技术通过差速离心提高线粒体代谢物检测灵敏度，揭示整体分析无法发现的细微代谢变化。

用于代谢分析的线粒体富集组分的制备黑腹果蝇

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用于代谢分析的线粒体富集组分的制备 黑腹果蝇

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