用于代谢分析的线粒体富集组分的制备 黑腹果蝇

以下实验的总体目标是获得富含线粒体的组分，以获取足量的线粒体代谢物，用于黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的代谢组学研究。首先需培养足够数量的果蝇，以获得可用于制备线粒体富集组分的足量代谢物。第二步是将果蝇在玻璃-聚四氟乙烯匀浆器中进行匀浆处理，该过程可破坏细胞膜，同时不损伤线粒体的完整性。

接下来，将匀浆进行差速离心，以获得富集的线粒体样品。结果表明，利用本方案可检测到显著的线粒体代谢变化，而这些变化在基于全虫提取物和线粒体富集组分的全代谢组学分析中均未被发现。与全果蝇代谢组学分析相比，该方法的主要优势在于：在代谢组学分析前先分离线粒体，可提高检测灵敏度，并更有效地检测线粒体代谢物的变化。

实验开始时，将果蝇培养基成分置于加热板上，加热至90摄氏度。持续搅拌混合物，直至其均匀且略呈稠状。将培养基从热源移开，当温度降至80摄氏度时，间歇性搅拌；随后加入0.2% TE脱甲基对羟基苯甲酸酯，溶于95%乙醇中。接下来，将培养基均分为两等份。

确保食物温度降至 50 摄氏度后，将 1.1 毫升溶于乙醇的 50 毫摩尔雷帕霉素加入第一份食物中，同时将 1.1 毫升未经处理的乙醇加入第二份食物中。收集成虫时，使用单级调节器将高压气罐中的纯二氧化碳输出。以每秒 5 PS 的恒定流速，通过塑料管将二氧化碳导入一个 500 毫升的抽滤瓶，该抽滤瓶连接有导管，使二氧化碳通过水进行鼓泡，从而避免静电产生。

为此，使用带有单孔的橡胶塞密封烧瓶。将烧瓶侧孔通过塑料管连接至二氧化碳垫，以控制幼虫发育过程中的密度。将25对亲本放入培养瓶中，使其产卵48小时。

然后移除亲代以调控卵的密度，并使用新出现的F1代后代重复这些步骤，以实现两代的密度控制。在密度受控条件下经过两代后，按性别分离果蝇，将果蝇放置在垫上不超过10至15分钟。在将果蝇置于实验条件之前，使其从麻醉状态恢复24小时。

每个样本指定 300 只果蝇，以产生足量的代谢物用于线粒体富集组分的制备。将 150 只果蝇转移至一个自制的一升笼中，再将剩余的 150 只果蝇转移至另一个一升笼中，每个笼中果蝇数量不得超过 150 只。

每个实验条件使用六个重复样本，将笼子置于25摄氏度、12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，以完成黑腹果蝇的培养。在含有五毫升食物的试管中，每两到三天为果蝇提供一次新鲜食物，以维持食物质量，持续共10天。开始分离时，将一个笼子中的果蝇倒入装有一毫升预冷分离缓冲液的玻璃聚四氟乙烯下部匀浆器中。

接下来，将一些研钵置于冰上以保持线粒体的完整性，并用15次研磨匀浆果蝇。注意不要旋转研杵，将匀浆液转移至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以300 × g离心5分钟。将上清液转移至另一新管中，在4°C条件下以6,000 × g离心10分钟，以富集线粒体。

离心后，弃去含有胞质组分的上清液。用移液器反复吹打，将沉淀重悬于300 µL洗涤缓冲液中。轻柔地重复上述步骤，用于第二个笼式陀螺。

然后将两个笼子中重悬的沉淀合并至一个低温离心管中，于4°C下以6,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并用液氮速冻沉淀。最后将线粒体富集组分储存在-80°C下。

该蛋白免疫印迹结果显示线粒体膜转运蛋白 poin 的富集，表明线粒体组分中线粒体实现了有效分离。在细胞质组分中无法检测到 poin 蛋白，而细胞质微管蛋白 tubulin 在线粒体组分中未被检测到，说明细胞质蛋白的污染极少。主成分分析（PCA）是基于质谱分析所得数据生成的，这些数据已根据 Bradford 法测定的蛋白浓度进行归一化处理，经对数转换，并截除各化合物的最低检测值后完成。

使用完整的代谢物数据生成了主成分分析（PCA）图。通过标准的整只果蝇提取物获得的原代和破坏型果蝇菌株的代谢物谱，可与线粒体富集提取物中的代谢物进行比较。在基于线粒体富集提取物代谢物的PCA图中，整只果蝇的代谢物谱在第二主成分（PC2）轴上明显分离，反映了雷帕霉素处理的主要效应。不同M-T-D-N-A基因型之间的差异则较为细微。

相比之下，线粒体富集提取物的代谢物谱显示，正常食物条件下的天然 M mt DNA 基因型与其他三个样本之间存在明显分离：即雷帕霉素处理下的天然 MTD NA，以及正常或雷帕霉素食物条件下的替代型 MTD NA。这表明，替代型 MTD NA 对代谢物谱的影响方式类似于雷帕霉素处理的效果。在执行本方案时，为降低重复样本间的变异性，建议将所有处理步骤均在同一天内完成。

我建议提前制定好计划，对试管进行标记，并记录好各重复样本之间的等待时间，以提高样本制备的质量。