Name: 光敏定位显微镜与双分子荧光互补（附设-PALM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习BiFC-PALM技术用于研究U2OS细胞中Ras-Raf蛋白相互作用的方法。该技术结合双分子荧光互补与光敏定位显微镜，可在单分子和纳米尺度上可视化蛋白相互作用，为癌症生物学中的致癌信号通路研究提供高分辨率成像手段。

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作者感谢 Steven Chu 博士和 Joe W. Gray 博士的有益讨论，感谢 Henry Marr 对 BiFC-PALM 项目的初期工作，以及 Alexis Shoemaker 提供的技术支持。本工作得到了俄勒冈健康与科学大学（OHSU）为 X.N. 提供的启动资金支持。Nan 实验室的研究还获得了美国国立卫生研究院（NIH）5U54CA143836-05 项目、Damon Runyon 癌症研究基金会、M. J. Murdock 慈善信托基金以及 FEI 公司的资助。

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作者无任何利益冲突披露。

BiFC 是一种常用于在细胞内检测和可视化蛋白质相互作用（PPI）的技术，而 PALM 是一种新兴的单分子超分辨率显微技术，能够对完整的生物样品进行纳米尺度成像。将 BiFC 与 PALM 相结合，可在细胞内实现具有纳米级空间分辨率和单分子灵敏度的 PPI 选择性成像。BiFC-PALM 拓展了这两种技术的应用范围，正如本研究所展示的，该方法在揭示蛋白质相互作用在其天然细胞环境中的分子细节方面展现出巨大潜力。特别是，纳米级分辨率使得能够在分子尺度上深入研究特定蛋白质相互作用的空间和时间调控机制，而这在生物医学研究中一直是一项挑战。然而，如前所述，BiFC-PALM 受限于互补反应的不可逆性以及发色团成熟速度较慢的问题。
利用分裂的PAmCherry1展示了BiFC-PALM的原理及其应用价值。PAmCherry1因其优异的光物理特性，已被广泛应用于PALM实验中。将PAmCherry1用作BiFC探针的另一个优势在于，当其与蛋白质相互作用（PPIs）偶联时，在37 °C条件下蛋白重构具有低背景、高特异性和高效率。基于这些原因，分裂PAmCherry1 BiFC探针有望成为适用于多种...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是生物学的基础1，并通过多种时空机制在广泛的时间和空间尺度上受到严密调控。例如，关于细胞膜上细胞信号传导的研究揭示了动态的纳米级空间区室，这些区室可促进特定的PPI及细胞过程2。因此，以足够的空间和时间分辨率、高特异性和高灵敏度探测生物系统中PPI的能力，是实现对生物学机制性理解的关键。
双分子荧光互补（BiFC）是目前少数几种能够在亚细胞分辨率下实现活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）可视化的工具之一3–5。该技术相对简单，其原理是将一个荧光蛋白拆分为两个无荧光的片段；当这两个片段分别与相互作用的蛋白质融合表达并因蛋白相互作用而靠近时，可重新组装形成完整的荧光蛋白，从而产生荧光信号。若设计得当，BiFC探针在不存在蛋白质相互作用的情况下不应发生自发重组。因此，BiFC实验中的荧光信号仅在PPI发生时出现，从而实现对PPI的高度特异性直接可视化。以荧光作为检测信号的其他优势还包括高灵敏度、亚细胞分辨率，以及与高通量和高内涵筛选实验的兼容性等。得益于这些优点，目前已开发出多种基于不同母体荧光蛋白的BiFC探针。然而，与所有基于传统光学显微镜的检测技术一样，BiFC的空间分辨率受限于光的衍射极限，约为250 nm。这使得在纳米尺度上研究PPI的调控变得具有挑战性；而正如前文所述及脂筏6&#160;和Ras纳米簇7所例证的，纳米尺度是理解许多细胞过程（如信号转导）的关键长度尺度。
BiFC 已与光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy, PALM）8,9 相结合，以克服成像蛋白质相互作用（PPIs）时空间分辨率的限制10。PALM 是一种新兴的超分辨率显微技术，通过单个荧光分子的随机激活和亚衍射极限定位，突破了荧光成像中的衍射极限。在每一次激活循环中，一个荧光分子会发射出数百至数千个光子，在探测器上形成一个单分子图像。尽管该图像受衍射限制（宽度约 250 nm），但其质心位置可被更精确地确定，精度通常在 10–50 nm 范围内，具体取决于所检测到的光子数量。通过对样品中每个荧光分子依次进行激活和定位，即可重构出高分辨率图像。在活细胞中进行的单分子示踪（smt-）PALM 技术，还能从单个细胞中获取数千条蛋白质扩散轨迹11。重要的是，PALM 使用特殊的荧光探针，例如光激活荧光蛋白（photoactivatable fluorescent proteins, PA-FPs），以实现随机激活。由于 BiFC 和 PALM 均使用荧光蛋白，因此研究人员通过在氨基酸 159 和 160 之间切割常用于 PALM 的光激活荧光蛋白 PAmCherry1，将其分为两个片段，从而实现了两种技术的结合。
基于分裂型PAmCherry1的BiFC系统在两个片段自发重组时表现出较低的背景信号。当这两个片段（RN = 第1-159位氨基酸；RC = 甲硫氨酸+第160-236位氨基酸）分别与一对相互作用的蛋白质进行基因标记时，即使在37 °C条件下且无需低温孵育，也能高效重组形成完整的PAmCherry1蛋白，而其他BiFC组合（如母体mCherry12）则不具备这一特性13。此外，重组后的PAmCherry1蛋白保留了母体PAmCherry1的光物理特性，例如高对比度、中等光子产率以及快速光激活能力等，这些特性对于精确的单分子定位和高分辨率PALM成像至关重要。
本方案描述了在U2OS细胞中利用分裂PAmCherry1进行BiFC-PALM成像以研究Ras-Raf相互作用的方法（图1A）。第一步是设计表达PAmCherry1片段（即，RN和RC）与目标蛋白融合蛋白的构建体。理论上，对于每一对候选蛋白（A和B），需要测试八种融合蛋白组合：RN-A/RC-B；RN-A/B-RC；RC-A/RN-B；RC-A/B-RN；A-RN/RC-B；A-RN/B-RC；A-RC/RN-B；以及A-RC/B-RN。通过考虑候选蛋白的结构或生化特性，该过程通常可以简化。以Ras蛋白为例，其在翻译后会被修饰于C末端的CAAX盒（C=半胱氨酸；A=脂肪族氨基酸；X=任意氨基酸），随后AAX基序被切除。因此，RN或RC只能与Ras的N末端融合，从而将融合蛋白组合的数量减少至四种（图1B）。对于Raf蛋白，则使用其Ras结合域（RBD；第51-131位残基），该结构域可在任一末端进行标记。由此构建了以下四种融合形式：RN-KRas/RC-Raf RBD；RN-KRas/Raf RBD-RC；RC-KRas/RN-Raf RBD；以及RC-KRas/Raf RBD-RN。
此外，还需考虑片段与目标蛋白之间的连接子。通常使用约十个氨基酸的柔性连接子，因为它能够为互补作用的发生提供足够的自由度。其中一个典型的连接子是(GGGGS)x2，但也有许多其他成功应用的连接子，包括从多克隆位点（MCS）产生的随机序列14。连接子的长度可能需要根据目标蛋白的大小及其相互作用时的方向进行优化。
PAmCherry1 片段包含在一个带有侧翼多克隆位点（MCS）的小型克隆载体骨架中（参见材料列表）。目的基因可通过限制性酶切位点或无需连接的方法插入。克隆并经序列验证后，通过重组酶反应将表达盒转移至表达载体，该克隆过程具有高保真性和高效率。
接下来，将获得的表达载体转染至目标细胞系中；如果需要建立稳定细胞系，则可将其包装到慢病毒中以感染目标细胞系。瞬时转染可用于快速验证BiFC构型，但需注意潜在问题。化学试剂转染常对细胞造成应激，导致自发荧光增强；虽然全内反射荧光（TIRF）显微镜可通过限制照明体积来降低背景信号，但TIRF最适合用于发生在细胞膜上的蛋白质相互作用（PPIs）研究。此外，瞬时转染通常导致蛋白表达水平过高，远超内源性蛋白水平，这可能在检测PPIs时引发假象。因此，建议在通过初步实验确定合适的BiFC构型后，建立稳定细胞系。稳定细胞系还可通过多西环素诱导实现可调控的表达15。
感染后，细胞用抗生素进行筛选，通常使用嘌呤霉素和新霉素，每种构建体各用一种。后续的样品制备、图像采集和数据分析步骤将在实验方案中详细描述。
采用该方法，通常可在Ras-Raf RBD的BiFC-PALM图像中观察到纳米级簇的形成（图2A）。与此一致，Ras-Raf RBD的单分子跟踪-PALM轨迹显示其扩散状态呈异质性分布（图2B-D）。这些结果表明，Ras-Raf复合物在细胞膜上以多种状态存在，可能包括单体和簇状结构，具有潜在的生物学意义。本研究展示了BiFC-PALM在细胞内以纳米级空间分辨率和单分子灵敏度选择性成像蛋白质相互作用（PPI）的强大能力，而这种能力通过传统的BiFC、荧光共定位或荧光共振能量转移（FRET）方法难以实现。
在设计BiFC实验并解读结果时，必须注意大多数情况下BiFC过程是不可逆的，包括使用分裂型PAmCherry1的情况。一旦两个片段结合并形成完整的PAmCherry1蛋白，这两个片段之间的连接以及由此产生的蛋白质相互作用（PPI）将永久固定。这限制了BiFC和BiFC-PALM在监测PPI动态变化中的应用即结合动力学而非蛋白质复合物形成后的扩散动力学，有时甚至可能导致蛋白质相互作用复合物的错误定位。
设计BiFC-PALM实验时需考虑的另一个因素是荧光蛋白固有的发色团成熟延迟。当两个蛋白相互作用并使荧光蛋白片段结合后，其通常在数秒内完成重折叠（EYFP的半衰期为60秒3）。然而，随后的发色团成熟及荧光信号的产生则需要数分钟时间。尽管在分裂型Venus（一种快速折叠的YFP变体）重组后10分钟内即可检测到荧光信号&#160;，但一般情况下其成熟的半衰期通常约为60分钟16。分裂型PAmCherry1也被观察到具有类似的成熟速率。因此，BiFC和BiFC-PALM目前并不适合用于监测蛋白质相互作用（PPI）的实时动力学过程；其他方法，如FRET以及最近开发的二聚化依赖性荧光蛋白17，可能更适合此类研究目的。

<table><tbody><tr><td>显微镜机身</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm激光器</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm激光器</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm二向色镜</td><td>Semrock</td><td>&amp;nbsp;Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nm滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm陷波滤光片</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>温度和CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;控制载物台</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD克隆试剂盒</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase酶</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power慢病毒包装系统</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE转染试剂</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II腔室盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5玻璃底培养皿</td></tr><tr><td>U2OS细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>无酚红DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15（无酚红）</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>低血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒浓缩试剂</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>逆转录病毒浓缩试剂</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素（Puromycin）</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>新霉素（Neomycin）</td></tr><tr><td>强力霉素（Doxycyline）</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm金颗粒</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC100</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>DpnI酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>质粒中提试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0.6 ml微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml离心管</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml聚丙烯圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml聚丙烯圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCR管</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤培养基</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>感受态细胞</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（bifc-palm）

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是生物学中的关键分子事件。然而，由于传统光学显微镜的分辨率受衍射极限限制（约250 nm），在细胞内以足够高的分辨率和灵敏度可视化PPIs仍具挑战性。通过将双分子荧光互补（BiFC）技术与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在单分子灵敏度和纳米级空间分辨率下实现细胞内PPIs的可视化。BiFC是一种常用的以荧光对比可视化PPIs的技术，其原理是将一个荧光蛋白拆分为两个无荧光的片段。PALM是一种新兴的超分辨率显微技术，可用于在纳米尺度和单分子水平上成像生物样本，该技术使用光可转换荧光探针，例如光激活荧光蛋白（PA-FPs）。BiFC-PALM技术通过拆分PAmCherry1实现，该PA-FP具有单体性质、良好的单分子亮度、高对比度以及适用于化学计量比测量等优点。当在第159和160位氨基酸之间拆分时，PAmCherry1可构建成一种高效的BiFC探针，在37 °C下能特异性地重组，并对PPIs具有高度特异性且非特异性重组水平低。以Ras-Raf相互作用为例，展示了BiFC-PALM如何在纳米尺度和单分子分辨率下探测蛋白质相互作用。此外，还可利用单分子追踪（smt-）PALM在活细胞中追踪它们的扩散行为。本实验方案讨论了设计BiFC-PALM融合蛋白时需考虑的因素，详细说明了样品制备、图像采集和数据分析步骤，并展示了一些典型结果。由于具备高空间分辨率、高特异性和高灵敏度，BiFC-PALM是研究完整生物样本中PPIs的有力工具。

所示的BiFC-PALM示例为KRas G12D突变体与CRaf的Ras结合结构域（RBD）之间的相互作用（图1A）。如前所述，RN或RC片段未标记在Ras的C末端，因为这会破坏Ras的膜定位，从而影响其生物学活性。因此，可能的组合从八种减少至四种（图1B）。这四种组合均通过慢病毒感染导入U2OS细胞。细胞按照实验方案进行固定，并使用PALM系统检测BiFC信号。当开启405 nm激光时，出现荧光强度突然增加的细胞即被识别为具有阳性BiFC信号；在整个成像过程中，561 nm激光持续开启。这种荧光的突然变化是由于在405 nm激光照射下，BiFC重构的PAmCherry1发生光激活所致。通过该方法对样品中的多个区域进行检测，并通过计算在405 nm激光高强度脉冲前后像素强度增加的平均值来确定BiFC信号强度。
如图1C所示，在四种可能的构型中，有两种构型（即RN-Ras/RC-Raf RBD和RN-Ras/Raf RBD-RC）显示出强烈的双分子荧光互补（BiFC）信号。另一种构型...

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是生物学中的关键分子事件。然而，以足够的分辨率对PPIs进行可视化仍具挑战性。

该显微技术的总体目标是在单分子和纳米尺度上可视化蛋白质及其相互作用。因此，该方法有助于我们回答生物学领域中的一些关键问题，例如致癌信号传导过程中的分子相互作用。该技术的主要优势在于其高灵敏度、高特异性，并能够提供单分子和纳米级分辨率。进行该实验操作的是我实验室的高级研究员Dr.Tahan。在根据文本方案将RAs和RAF R-B-D-P-A-M Cherry one片段克隆并包装成病毒颗粒，随后感染U2 OS细胞后，为准备用于成像的样品，将约5.5×10⁴个稳定表达细胞接种至8孔玻璃底成像板的每个孔中，每孔加入350 µL不含酚红的DMEM培养基。使用新鲜配制的含戊二醛的多聚甲醛固定细胞，随后用PBS或成像缓冲液替换固定液，涡旋混匀100 nm金颗粒，并向每孔加入35 µL，用于追踪成像过程中的阶段漂移。接近显微镜，打开405纳米和561纳米激光器的电源，此时保持快门关闭；确保561纳米二向色镜和陷波滤光片已正确安装。启动图像采集软件。打开E-M-C-C-D相机，使其冷却，并将曝光时间设置为100毫秒，E-M-C-C-D增益调整至适当值。向物镜添加镜油，并将样本固定在显微镜载物台上。接着使用明场或561纳米激光，将样本调至聚焦状态，以成像RAs及其他膜蛋白。采用60倍APO色差校正物镜（数值孔径1.49），并将显微镜设置为油浸成像模式。调整激发激光的位置，使其照射到物镜后焦面时偏离中心，从而导致激光在到达盖玻片-缓冲液界面时发生偏折。持续调节激光入射位置，直至达到临界角，激光发生反射。寻找一个视野中包含多个金纳米颗粒的细胞进行成像。然后设置一个感兴趣区域，该区域应包含整个细胞或其部分区域以及金颗粒，以防因表达水平较高而已经发生足够的激活。开始采集时，关闭405纳米激光，打开561纳米激光。否则，将405纳米激光以出厂最低功率开启，并逐步增加功率，直至每帧图像中出现数十个分子，或使单个分子之间充分分离。在持续采集数据的过程中，逐渐增加405纳米激光的功率，以保持光斑密度大致恒定。继续图像采集，直至高强度的405纳米激光功率不再引发新的反应为止。激活事件结束以处理图像。下载图像处理软件。打开 MATLAB 并加载 WFI 读取软件。查看原始图像序列，确定感兴趣区域（ROI），通过在目标区域周围按住鼠标左键并拖动框选来选择待处理的图像层区域。如果在图像采集过程中未缩小感兴趣区域，则应选择一个较小的区域以减少计算时间；若要取消选择区域并对整个画面进行处理，可在图像中任意位置右键点击。接下来，定义一组基准标记物，例如吸附在盖玻片上的金纳米颗粒，这些颗粒应分布孤立、大小均一、形状一致，并在整个图像序列的视野中持续可见。首先通过鼠标左键点击目标金颗粒的图像，并在其周围拖动一个小框来选择一个候选颗粒。在粒子追踪模式下，点击追踪按钮。此时将出现一个图表，显示所选金粒子在图像堆栈中的位置变化，从而反映漂移的程度。重复此过程，尽可能多地追踪金粒子，并确定哪些粒子的运动轨迹一致。理想情况下。总体漂移最多为每次0.1像素。在颗粒追踪下选择共同追踪的金颗粒，然后单击添加标记按钮。将出现一个绿色十字，表示该颗粒已被添加为标记物，并将用于校正漂移。根据需要通过轻微调整 sigma 范围、平滑范围和阈值来优化参数。点击“查找颗粒”按钮以测试设置，并目视检查处理结果：相对圆润且明亮的颗粒（例如 PAM-cherry 单分子）将被框选，而不符合特征的颗粒则不会被选中。要开始处理图像，请点击“生成坐标文件”按钮，并将文件另存为所需的名称，以用于图像的后期处理并生成掌纹图像。在 MATLAB 中启动掌纹处理程序包，并加载刚刚创建的点核文件。在控制按钮旁边的图像框中将显示一个粗略渲染的图像。使用以下典型值对单个坐标进行排序。对于 PAM Cherry 一，合并帧数等于八，合并距离（纳米）等于 100，最小 RMS 等于四。最小拟合优度等于 0.25，最大偏心率等于 1.4。点击排序按钮，生成一组经过筛选的坐标，用于渲染高分辨率图像。输入适当的参数值以正确渲染最终图像，例如原始像素尺寸（此前已确定）、渲染图像中目标特征尺寸（通常设定为略高于平均定位精度和像素尺寸的值，如 10 纳米）。对于渲染后的图像，单击渲染按钮以生成手掌图像。然后使用图形窗口工具栏中的加号和减号放大图标来放大和缩小，以在活细胞中追踪单个分子。按照本视频前面所述的方法处理组织培养表面并接种细胞。确保盖玻片在细胞切割及完成实验所需的任何处理和孵育后，其厚度适用于显微镜设置，将培养皿置于载物台孵育器上。让培养皿在载物台上静置数分钟，直至温度和CO2浓度稳定。在此步骤中阻断激光。若无法控制 CO2，成像前应更换为不含 CO2 的培养基（如 Leibovitz's L-15），以降低背景荧光，最终按照前述方法获取图像，并设置合适的曝光时间，以确保良好的信噪比，同时不牺牲时间分辨率。本图中的 BFC 信号来自 KRAS G12D 突变体与 CRAF 的 Ras 结合域（RBD）之间的相互作用。此处展示的四种组合均通过慢病毒感染导入 U2 OS 细胞；其中两种构型的细胞表现出强烈的阳性 BFC 信号，表现为在开启 405 纳米激光时，由于 BFC 重构的 PAM-Cherry1 发生光激活，荧光信号突然增强，实验条件与原始 PAM-Cherry1 相同。感染RN R和RAF RBD RC后产生了强烈的BFC信号。此处，RN和RC分别表示PAM Cherry one的N端和C端片段；当放大至单个分子时，可清晰观察到这些分子及其纳米级空间分布。本实验通过单分子示踪PALM技术获取了单个RA分子的扩散轨迹，并在561纳米和405纳米激光持续照射下观察RAF RBD复合物。单个PA m Cherry one分子状态。开启后，在进入暗态前会持续几个帧，这些分子在暗态中表现为静止或可移动。该多分子记录图像清晰地展示了这两种类型的轨迹。从连续帧间分子位移的直方图中也可推断出类似的扩散状态异质性分布，质量已得到精确控制。该技术可在一至三周内完成，具体时间取决于所使用的构建体是瞬时转染、转染后表达，还是稳定抑制，前提是操作正确。在进行该实验时，重要的是要记得设置对照，例如缺乏相互作用的突变型Putins。此外，还可进行其他方法，如聚类分析，以回答更多问题，例如：蛋白质相互作用在细胞内的空间组织方式是怎样的？在实验室细胞追踪中，作为评估基础，可进行单粒子追踪以确定其发育后的扩散状态及状态转换概率。本技术已被我们实验室应用于癌症生物学领域，以研究视黄酸（RA）驱动的相互作用以及人类肿瘤细胞中Her家族受体的同源和异源二聚化。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计并实施活体成像实验，以研究特定的蛋白质相互作用。请注意，操作抗病毒药物和肿瘤细胞可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须始终采取标准生物安全防护措施。

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科研

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Bioengineering

生物工程

光敏定位显微镜与双分子荧光互补（附设-PALM）

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双分子荧光互补

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双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

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通过干涉光激活定位显微镜（iPALM）对F-actin丝进行三维超分辨率成像

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学习BiFC-PALM技术用于研究U2OS细胞中Ras-Raf蛋白相互作用的方法。该技术结合双分子荧光互补与光敏定位显微镜，可在单分子和纳米尺度上可视化蛋白相互作用，为癌症生物学中的致癌信号通路研究提供高分辨率成像手段。

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

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