双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

该显微技术的总体目标是在单分子和纳米尺度上可视化蛋白质及其相互作用。因此，该方法有助于我们回答生物学领域中的一些关键问题，例如致癌信号传导过程中的分子相互作用。该技术的主要优势在于其高灵敏度、高特异性，并能够提供单分子和纳米级的分辨率。

进行该实验操作演示的是我实验室的高级研究员Tahan博士。在根据文本方案将RAs和RAF R-B-D-P-A-M Cherry一片段克隆并包装成病毒颗粒，转导感染U2 OS细胞后，为准备用于成像的样品，每孔八孔玻璃底培养板中加入约5.5×10⁴个稳定表达细胞，以及350 µL不含酚红的DMEM培养基。使用新鲜配制的含戊二醛的多聚甲醛固定细胞，随后将固定液替换为PBS或成像缓冲液，涡旋混匀100 nm金颗粒，并每孔加入35 µL，用于追踪成像过程中的阶段漂移。

接近显微镜并开启405纳米和561纳米激光器，此时保持快门关闭；确保561纳米二向色镜和陷波滤光片已正确安装。打开图像采集软件。开启E-M-C-C-D相机并使其冷却，将曝光时间设为100毫秒，E-M-C-C-D增益调整至适当值。

向物镜添加镜油，并将样本固定在显微镜载物台上。接着使用明场或561纳米激光，调整样本焦距以成像RAs及其他膜蛋白。采用60倍高数值孔径（NA 1.49）的APO色差校正物镜，并将显微镜设置为油浸配置。

调整激发激光的位置，使其照射到物镜后焦面时偏离中心，从而导致激光在到达盖玻片-缓冲液界面时发生偏折。持续调节激光入射位置，直至达到临界角，激光发生全反射。寻找一个视野中包含多个金纳米颗粒的细胞进行成像。

然后设置一个感兴趣区域，该区域应包含细胞或其部分区域以及金颗粒，以防因表达水平较高而已经发生足够的激活。开始采集时，关闭405纳米激光，打开561纳米激光。否则，将405纳米激光以最低的出厂功率设置开启，并逐步增加功率，直至每帧图像中出现数十个分子，且单个分子之间能够清晰分辨。

在持续采集数据的过程中，逐渐增加 405 纳米激光功率，以保持光斑密度大致恒定。继续图像采集，直至高 4 0 5。功率不再引发任何反应为止。

激活事件结束以处理图像。下载图像处理软件。打开 MATLAB 并加载 WFI 读取软件。

查看原始图像序列并确定感兴趣区域（ROI），通过在目标区域周围按住鼠标左键并拖拽框选来选择待处理的图像栈区域。如果在采集过程中未缩小感兴趣区域，可选择一个较小的区域以减少计算时间；若要取消选择并处理整个图像帧，可在图像任意位置点击鼠标右键。接下来，定义一组基准标记物，例如吸附在盖玻片上的金纳米颗粒，这些颗粒应分布孤立、形态均一，并在整个图像栈中均可见。首先通过鼠标左点击选一个候选的金颗粒，并在其周围拖拽出一个小框进行框选。

在粒子追踪下，点击追踪按钮。此时将出现一个图表，显示所选金粒子在整组图像堆栈中的位置，以反映漂移的程度。重复此过程，尽可能多地追踪金粒子，并确定哪些粒子是共同移动的。理想情况下。

总体漂移最大约为每次0.1像素。在粒子追踪下选择共同追踪的金颗粒，然后点击添加标记按钮。

将出现一个绿色十字，表示该颗粒已被添加为标记物，并将用于校正漂移。根据需要通过轻微调整数值来设置sigma范围、平滑范围和阈值。点击“查找颗粒”按钮以测试参数设置，并目视检查处理结果：相对圆润且明亮的颗粒（如PAM cherry单分子）将被框选，而不符合特征的颗粒则不会被选中。

开始处理图像时，单击“生成坐标文件”按钮，并将文件以所需名称保存，以便对图像进行后处理并重建掌纹图像。在 MATLAB 中启动掌纹处理程序包，加载刚刚创建的点阵核心文件。在控制按钮旁边的图像框中将显示一幅粗略重建的图像。

使用以下典型值对单个坐标进行排序。对于 PAM Cherry 一，合并帧数等于八，合并距离（纳米）等于 100，最小 RMS 等于四。

最小拟合优度等于 0.25，最大偏心率等于 1.4。点击排序按钮，生成一组新的经筛选坐标，用于渲染高分辨率图像。输入用于正确渲染最终图像的参数值，例如原始像素尺寸（此前已确定）、渲染图像中目标特征尺寸（通常设定为略高于平均定位精度和像素尺寸的值，如 10 纳米）。

对于渲染后的图像，单击渲染按钮以生成手掌图像。然后使用图形窗口工具栏中的加号和减号放大图标来放大和缩小，以在活细胞中追踪单个分子。按照本视频前面所述的方法处理组织培养表面并接种细胞。

在对细胞进行切割并完成实验所需的任何处理和孵育后，将培养皿放置于载物台孵育器上。确保盖玻片的厚度适用于显微镜系统。让培养皿在载物台上静置数分钟，直至温度和 CO2 浓度稳定。在此步骤中阻断激光。

若无法控制 CO2，成像前应更换为不含 CO2 的培养基（如 Leibovitz's L-15），以降低背景荧光，最终按照前述方法获取图像，并设置合适的曝光时间，以确保良好的信噪比，同时不牺牲时间分辨率。本图中的 BFC 信号来自 KRAS G12D 突变体与 CRAF 的 Ras 结合域（RBD）之间的相互作用。此处展示的四种组合均通过慢病毒感染导入 U2 OS 细胞；其中两种构型的细胞表现出强烈的阳性 BFC 信号，表现为 405 纳米激光开启时荧光急剧增强，这是由于 BFC 重构的 PAM-Cherry1 被光激活所致，本实验采用与原始 PAM-Cherry1 相同的实验条件进行验证。

感染RN R和RAF RBD RC后产生了强烈的BFC信号。此处，RN和RC分别表示PAM Cherry one的N端和C端片段；当放大至单个分子时，可清晰观察到这些分子及其纳米级空间分布。本实验通过单分子示踪PALM技术获取了单个RA分子的扩散轨迹，并在561纳米和405纳米激光持续照射下观察RAF RBD复合物。单个PA m Cherry one分子状态。

开启后，在进入暗态前会持续几个帧，此时分子表现为静止或移动状态。该多分子记录图谱清晰地展示了这两种轨迹类型。从连续帧间分子位移的直方图中也可推断出类似的扩散状态异质性分布，质量已得到精确控制。

该技术可在一到三周内完成，具体时间取决于所使用的构建体是瞬时转染、转染后表达，还是稳定抑制，前提是操作正确。在进行此操作时，重要的是要记得设置对照，例如缺乏相互作用的突变型Putins。此外，还可采用其他方法，如聚类分析，以回答更多问题，例如：蛋白质相互作用在细胞内的空间组织方式是怎样的？

在实验室细胞追踪中，作为评估基础，可进行单粒子追踪以确定其发育后的扩散状态及状态转换概率。本技术目前正被应用于我们实验室的癌症生物学研究中，以探索视黄酸（RA）驱动的相互作用以及人肿瘤细胞中Her家族受体的同源与异源二聚化。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计并实施活体成像实验，以研究目标蛋白间的相互作用。

请注意，操作抗病毒药物和肿瘤细胞可能具有极高危险性，进行该实验时必须采取标准的生物安全防护措施。