Name: 利用共聚焦分析非洲爪蟾调查的Wnt和Shh形态发生素梯度的调节剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 了解利用共聚焦显微镜分析非洲爪蟾上皮组织中荧光标记配体分泌与扩散的方法。该技术可研究Wnt和Shh形态发生素梯度的调控机制，为发育生物学研究提供可靠工具。

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本工作由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）向 MEP 提供的资助（BB/H010297/1）、BBSRC 向 SAR 提供的配额制博士生奖学金以及英国医学研究理事会（MRC）向 SWF 提供的博士生奖学金资助。

<ol><li>Shen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling%3A+developmental+roles+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling: developmental roles and regulation.</a> Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).</li>
<li>Shimmi, O., Newfeld, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+extracellular+and+post-translational+regulation+of+TGF-beta+family+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways.</a> J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Pownall, M. E., Isaacs, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPownall%2C+ME+%22FGF+Signalling+in+Vertebrate+Development%22">FGF Signalling in Vertebrate Development</a>. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127 (3), 469-480 (2006).</li>
<li>Ingham, P. W., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+animal+development%3A+paradigms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles.</a> Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).</li>
<li>Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hundred+years+of+positional+information%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">One hundred years of positional information.</a> Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).</li>
<li>Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics%2C+spatial+range%2C+and+transcriptional+interpretation+of+the+Dorsal+morphogen+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).</li>
<li>Erickson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+morphogen+gradients%3A+an+essential+role+for+the+endomembrane+system+in+Drosophila+melanogaster+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development.</a> Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).</li>
<li>Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+signalling+in+the+developing+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gradients of signalling in the developing limb.</a> Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).</li>
<li>Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+vertebrate+neural+tube%3A+a+sonic+hedgehog+morphogen-regulated+transcriptional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network.</a> Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).</li>
<li>Briscoe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx2.2+and+specification+of+neuronal+identity+by+graded+Sonic+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling.</a> Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).</li>
<li>Ribes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sonic+Hedgehog+signaling+dynamics+specify+floor+plate+and+ventral+neuronal+progenitors+in+the+vertebrate+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube.</a> Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).</li>
<li>Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulation+of+developmental+cell+signaling+by+XtSulf1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1.</a> Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).</li>
<li>Tao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+wnt11+activates+the+canonical+wnt+signaling+pathway+required+for+axis+formation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos.</a> Cell. 120 (6), 857-871 (2005).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+influences+the+Shh+morphogen+gradient+during+the+dorsal+ventral+patterning+of+the+neural+tube+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis.</a> Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).</li>
<li>Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulf1+has+ligand+dependent+effects+on+canonical+and+non-canonical+WNT+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling.</a> Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).</li>
<li>Dytham, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDytham%2C+C+%22Choosing+and+using+statistics+%3A+A+biologist%27s+guide%22">Choosing and using statistics : A biologist's guide</a>. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).</li>
<li>Fay, M. P., Proschan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wilcoxon-Mann-Whitney+or+t-test%3F+On+assumptions+for+hypothesis+tests+and+multiple+interpretations+of+decision+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Surveys%22%5BJournal%5D)">Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules.</a> Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).</li>
<li>Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt-8%2C+a+Xenopus+Wnt-1+%2Fint-1-related+gene+responsive+to+mesoderm-inducing+growth+factors%2C+may+play+a+role+in+ventral+mesodermal+patterning+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis.</a> Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).</li>
<li>Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+classes+and+functional+domains+of+Wnts+through+expression+of+wild-type+and+chimeric+proteins+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).</li>
<li>Tada, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xwnt11+is+a+target+of+Xenopus+Brachyury%3A+regulation+of+gastrulation+movements+via+Dishevelled%2C+but+not+through+the+canonical+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway.</a> Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).</li>
<li>Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+long-range+movement+of+the+morphogen+Xnr2+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo.</a> Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).</li>
<li>McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+has+direct+long-range+signalling+activity+and+can+form+a+concentration+gradient+by+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion.</a> Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos+coincides+with+the+dorsal+enrichment+of+dishevelled+that+is+dependent+on+cortical+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation.</a> Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).</li>
<li>Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+Smad+signaling+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MAPK and Smad signaling during early Xenopus development.</a> Development. 129 (1), 37-52 (2002).</li>
<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
<li>Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Wnt+recognition+by+Frizzled%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Wnt recognition by Frizzled.</a> Science. 337, 59-64 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本方案的一个关键环节是生成具有生物活性的配体，这些配体即使带有荧光基团，仍能被正常加工、分泌，并在靶细胞中引发相应的生物学反应。必须通过适当的检测方法验证荧光标记的基因产物是否具有生物活性。对于Shh-GFP，其激活ptc1表达的能力已被证实16。Wnt8a在单个腹侧卵裂球中表达时具有极强的能力诱导次级体轴形成20-21，而Wnt8a-HA-eGFP也被证明保留了这一生物学活性。Wnt11b可抑制经激活素处理的外胚层组织外植体发生汇聚延伸运动21-22，而Wnt11b-HA-eGFP同样保持了其生物活性17。标记配体能够引发与未标记蛋白相当的生物学反应，表明基于荧光配体实验所得出的结论适用于天然蛋白。在配体与荧光蛋白之间插入HA表位提供了一个间隔区域，使得Wnt融合蛋白既具有活性又具备荧光特性。
此类分析的主要局限在于其无法直接反映内源性形态发生素梯度的情况。例如，Shh 在动物帽细胞群中的扩散方式可能并不等同于内源性 Shh 在胚胎柱状神经上皮中实际的移动方式。然而，本实验方...

在早期胚胎发育过程中，细胞逐步被决定走向特定的分化谱系：这意味着一群全能性（或 pluripotent）细胞逐渐受限，最终形成决定分化为某一特定细胞类型的前体细胞群体。细胞间的信号传递在胚胎发育过程中谱系特化的调控中起核心作用。为了支持新型医学治疗，需要对这些信号进行调控，以引导干细胞向特定命运分化。
在发育过程中，仅有少数信号通路被反复使用，包括响应TGF超家族（如nodal和BMPs）1-2、FGFs3、Wnts4 和 Hedgehogs5 的通路。这些分泌型蛋白与细胞膜上的受体结合，从而激活信号转导，改变基因表达和/或细胞行为。细胞信号的精确调控对于细胞谱系特化和正常发育至关重要。尽管这些通路之间的相互串扰在决定细胞命运中具有重要作用，但单一配体本身在不同浓度下即可引发不同的反应。形态发生素梯度理论早在100多年前就被提出，用以解释不同类型的细胞如何从一群相同的细胞中产生6。由某一细胞群产生的信号分子可扩散至一定范围，其浓度随距离信号源越远而逐渐降低。暴露于该信号的细胞会根据其在细胞群中的位置感知局部浓度，并对信号的不同浓度水平作出差异性响应。形态发生素存在的证据来自对早期果蝇胚胎7 和翅盘8 的研究，以及脊椎动物肢体9 和神经管10 的研究。
需要开发方法来研究形态发生素梯度的建立机制，并鉴定在调控这些梯度过程中起重要作用的其他分子。利用免疫组织化学技术对内源性蛋白质进行可视化观察的精巧实验 体内 在不同遗传背景下已被用于研究形态发生素浓度梯度11-12然而，优质的抗体和特异性突变体并不总是可获得，因此本文介绍一种在非洲爪蟾（Xenopus）中过表达荧光标记配体的实验方案，以提供一种替代性的简便方法，用于解析外源基因产物如何影响配体在细胞群体中的分布。 非洲爪蟾 为开展此类实验提供了极佳的体系，因为其胚胎在体外发育，便于在最早期阶段进行操作。其较大的体积（直径约1-1.5 mm）使显微注射和手术操作更为简便；至囊胚期时，细胞仍相对较大（约20 µm），易于成像观察。在非洲爪蟾中进行过表达研究十分简便：将mRNA注射至早期胚胎后，可靶向特定细胞，并能高效翻译。
使用 pCS2 Wnt8a-HA13、pCS2 Wnt11b-HA14 和 eGFP 构建了荧光标记的 Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP 载体。HA 肽段的引入至关重要，不仅可作为额外的分子标签，还被认为可充当间隔序列，将 Wnt 蛋白与 eGFP 蛋白分离开来，从而使两种基因产物均能正常发挥功能。用于可视化 Shh 的载体此前已被用于构建表达 Shh-eGFP 融合蛋白的转基因小鼠15；该载体由 Andy McMahon 惠赠。重要的是，所有载体中的 GFP 标签均克隆在信号序列的 3’ 端，以确保在蛋白加工后仍被保留。此外，必须确保最终表达的蛋白包含实现翻译后修饰所必需的序列，例如 Shh 和 Wnt 配体所需的脂质修饰。cDNA 被亚克隆至 pCS2+ 表达载体中，该载体专为合成 mRNA 的制备而优化，含有 SP6 启动子和多聚腺苷酸化信号（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）。
本文所述工作提供了一种简单的实验方案，用于比较荧光标记的Wnt和Shh配体的分泌与扩散。通过注射定量合成的mRNA，该方案避免了使用不同启动子载体导致表达水平不一致所带来的问题。这些方法近期已被应用于研究硫酸乙酰肝素内切硫酸酯酶Sulf1对非洲爪蟾（Xenopus）中Shh-eGFP以及Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP分泌与扩散的影响16-17。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Ambion</td><td>来自 Megascript SP6 试剂盒 AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢盐</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钙</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>帽类似物 (m7G(5'))</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>盐酸半胱氨酸一水合物</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J 软件</td><td></td><td></td><td>免费下载 http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，No.1.5&amp;nbsp;</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃拉针毛细管</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素 (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂 (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 及 Zen 软件 (2008-2010)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab 软件</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr><tr><td>分子生物学级水&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>指甲油&amp;nbsp;</td><td>Boots</td><td>条形码 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>苯酚-氯仿</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 软件</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>高保真 DNA 聚合酶及缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&amp;nbsp; 缓冲液 - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>PVC 绝缘胶带</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶缓冲液</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 的 DNase</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>钢背单刃刀片</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>Zen lite 软件</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>免费下载&amp;nbsp; http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

使用非洲爪蟾（xenopus laesvis）的共聚焦分析研究wnt与shh形态发生素梯度的调控因子

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

本方案描述了一种用于可视化配体在细胞群体中分布的方法。由于非洲爪蟾（Xenopus laevis）在早期胚胎中细胞体积较大，且易于表达外源蛋白，因此是可视化GFP标记配体的有用模型。合成的mRNA在注射到早期Xenopus胚胎后可被高效翻译，并且注射可靶向单个细胞。当与细胞膜锚定的RFP等谱系示踪剂联合使用时，可方便地追踪表达过量蛋白的注射细胞及其子代细胞。本方案描述了通过注射mRNA产生荧光标记的Wnt和Shh配体的方法。该方法包括外胚层组织外植体（动物极帽）的显微解剖，以及对多个样本中配体扩散情况的分析。通过共聚焦成像，可以获得关于配体分泌及其在细胞群体中扩散的信息。对共聚焦图像进行统计学分析，可获得配体浓度梯度形态的定量数据。这些方法可能对希望研究可能调控形态发生素梯度形态因素的研究人员具有帮助。

表达荧光标记蛋白的动物帽外植体的共聚焦分析为在不同实验条件下可视化配体分布提供了一个有效的系统。在此示例中，展示了GFP标记的Shh的分布情况（图1）。在2细胞期， 非洲爪蟾 将胚胎的两个细胞分别注射对照mRNA或编码Sulf1的mRNA，Sulf1是一种修饰细胞表面硫酸乙酰肝素并影响Shh形态发生素梯度的酶16将这些胚胎培养至32细胞期，随后向单个细胞共注射编码Shh-GFP和memRFP（作为谱系示踪剂）的mRNA。由此产生表达Shh-GFP的细胞克隆，其细胞膜上标记有RFP。在囊胚期，取动物极帽组织外植体，用于共聚焦显微镜分析。 图1 结果显示，在对照条件下，Shh-GFP 被分泌并扩散到表达注射mRNA区域之外。然而，在Sulf1存在的情况下，Shh-GFP的分布范围受到限制，在本样本中，其信号未在产生它的细胞克隆外被检测到。Sulf1对Shh-GFP分布的影响已得到更深入的分析16.
在 Xenopus 胚胎中表达时，荧光标记...

本文提供了一套简单的方法，用于分析荧光标记配体在非洲爪蟾（Xenopus）中的分泌与扩散。该方法可用于检测其他蛋白质对配体分布的调控能力，并支持开展有助于揭示形态发生素梯度调控机制的实验。

使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

本方案描述了一种用于可视化分布在细胞群体中的配体的方法。外源蛋白表达的简便性，结合……

本方法的总体目标是利用在xip pos lavis中的表达，对完整上皮组织中荧光标记配体的分泌与扩散过程进行可视化观察。该方法有助于解答关于形态发生梯度建立的关键问题，而这些梯度在早期胚胎发育过程中对细胞谱系的特化至关重要。该技术的主要优势在于，它是一种在完整上皮组织中可视化配体分布的简便方法。该方案的一个关键步骤是生成具有生物活性的配体，这些配体应能被正常加工和分泌，并且即使带有荧光标记，仍可在靶细胞中引发响应。共聚焦显微镜是研究荧光标记蛋白在三维组织中定位的理想方法，其独立的激光器和检测器可实现对这类复杂组织的清晰分析，从而获得可靠的数据。在根据书面方案制备好编码荧光标记配体的mRNA并获取XUS lavis胚胎后，可根据需要在16至32细胞期将该mRNA与谱系示踪剂（如膜定位RFP）共同注射至单个细胞中；此外，也可将一种调节剂与荧光配体及谱系标记物共注射，以分析其作用效果。有时，向邻近细胞注射也是有益的。在此过程中，将第二个细胞注射到先前已注射细胞的相邻位置。其中一个细胞被注射编码GFP标记配体和谱系示踪剂（如膜定位RFP）的mRNA，而另一个细胞则被注射编码调控因子和另一种谱系示踪剂（如膜定位青色荧光蛋白Cerulean）的mRNA。随后将胚胎转移至12.5°C的培养箱中培养至新的养殖环境。在Faber阶段第八期的次日，当胚胎发育至第八阶段时，将胚胎转移至预先用1%琼脂糖包被并加入NAM2的培养皿中，使用截断的玻璃移液管并配合钨针进行操作。从注射过和对照组的胚胎动物极分离环形外胚层，注意不要包含任何中胚层。将动物外胚层转移至直径55毫米的培养皿中，培养皿预先用1%琼脂糖包被，并将胚胎培养四小时，以使荧光蛋白充分成熟，从而产生荧光信号。制备载玻片：在显微镜载玻片上贴附两层聚氯乙烯绝缘胶带，并完全压平。用胶带裁剪出一个 14 × 10 毫米的矩形，用于固定动物帽。接着，将两滴 NM 二号溶液分别移液至凹面载玻片中。然后使用截短的 P20 枪头，将最多 15 个动物外植体转移至每张载片，并用镊子调整 X 外植体的方向，使其顶端朝上。使用金刚石笔在玻璃盖玻片上划痕，将其折断以制备较小的盖玻片。用弯曲的19号针头轻轻将玻璃盖玻片置于浮雕载玻片上，使其贴合，从而压紧动物极帽细胞的顶端层。使用指甲油在避光条件下将玻片封固20分钟，并在4至6小时内进行成像。为确保动物帽状态良好，必须将动物帽正确放置于定制玻片及盖玻片中。将样品轻柔地加载至玻片上。封片时切勿使用过多指甲油，否则会导致胶带起皱，进而使玻片密封失效。熟练掌握后，每种实验条件下需要注射约25个胚胎，以获得20个质量良好的动物极帽。次日可利用共聚焦显微镜对这些样本进行分析。进行成像时，先使用低倍物镜找到 X explan，然后切换至 63 x 1.4 油镜以进行更高分辨率的成像。开启所需的激光器，包括用于 MIAN 的 405 激光、用于 GFP 的 488 激光以及 561 激光。对于MRFP，优化激光功率，以便检测所有荧光信号。使用32通道检测器阵列，同时尽量减少所需的电压和增益，然后启用Lambda模式，并选择405 nm、488 nm和561 nm激光器。为获得更宽的视野，将图像放大倍数调至0.6倍。接下来，将帧尺寸设置为所需图像大小。这为分析时进行四到八次的图像平均提供了足够的分辨率，以提高信噪比，并针对该数据集优化针孔大小。根据所用561纳米激光，采用405、488和561进行成像。Diic 镜面收集从膜结合型 Saru、GFP 和膜结合型 RFP 发出的光。本实验中，从 415 至 720 纳米范围内每隔约 10 纳米收集一次光信号。根据此处所示文本方案进行图像分析：在对照条件下，GFP 标记的 sonic hedgehog 在动物极帽 X 外植体中的分布显示，sonic hedgehog GFP 被分泌并扩散到注射 mRNA 表达区域之外。然而，在存在调节因子 SULF1 的情况下，Sonic Hedgehog GFP 的分布范围更受限制。在此样本中，仅在产生该蛋白的细胞克隆附近较短距离内可见少数几个 Sonic Hedgehog GFP 的信号焦点。该图显示了两种荧光标记的 Wit 配体（如图所示）被注射入细胞后的表征结果：Wnt8A 和 Wnt11B-HA-EGFP 均能在动物帽细胞膜上积累，其中 Wnt8A-HA-EGFP 的膜积累效率高于 Wnt11B-HA-EGFP。该图显示了在一群标记有膜锚定型青色荧光蛋白（cerulean）的细胞克隆中表达的 Wnt8A-HA-EGFP 的分布情况。可见荧光标记的配体从源细胞扩散至上皮组织周围的细胞中。此处所示，通过图像分析软件提取多个实验样本中荧光标记的wind配体分布数据。通过测量从表达mem Saru的克隆区域到GFP荧光强度的距离，以确定wind扩散的范围及浓度梯度的形态。在测量配体分布后，还可将本方案与另一种检测方法结合，以评估信号通路的输出，监测接受信号细胞的响应。通过这种方式，可尝试确定形态发生素的作用阈值范围。

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