使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

本方法的总体目标是利用在xip pos lavis中的表达，对完整上皮组织中荧光标记配体的分泌与扩散过程进行可视化观察。该方法有助于解答关于形态发生梯度建立的关键问题，而这些梯度在早期胚胎发育过程中对细胞谱系的特化至关重要。该技术的主要优势在于，它是一种在完整上皮组织中可视化配体分布的简便方法。

该方案的一个关键步骤是生成具有生物活性的配体，这些配体应能被正常加工和分泌，并且即使带有荧光标记，仍可在靶细胞中引发响应。共聚焦显微镜是研究荧光标记蛋白在三维组织中定位的理想方法，其独立的激光器和检测器可实现对这类复杂组织的清晰分析，从而获得可靠的数据。在根据书面方案制备好编码荧光标记配体的mRNA并获取XUS lavis胚胎后，可根据需要在16至32细胞期将该mRNA与谱系示踪剂（如膜定位RFP）共同注射至单个细胞中；此外，也可将一种调节剂与荧光配体及谱系标记物共注射，以分析其作用效果。

有时，向邻近细胞注射也是有益的。在此过程中，将第二个细胞注射到先前已注射细胞的相邻位置。其中一个细胞被注射编码GFP标记配体和谱系示踪剂（如膜定位RFP）的mRNA，而另一个细胞则被注射编码调控因子和另一种谱系示踪剂（如膜定位青色荧光蛋白Cerulean）的mRNA。随后将胚胎转移至12.5°C的培养箱中培养至新的养殖环境。在Faber阶段第八期的次日，当胚胎发育至第八阶段时，将胚胎转移至预先用1%琼脂糖包被并加入NAM2的培养皿中，使用截断的玻璃移液管并配合钨针进行操作。

从注射过和对照组的胚胎动物极分离环形外胚层，注意不要包含任何中胚层。将动物外胚层转移至直径55毫米的培养皿中，培养皿预先用1%琼脂糖包被，并将胚胎培养四小时，以使荧光蛋白充分成熟，从而产生荧光信号。制备载玻片：在显微镜载玻片上贴附两层聚氯乙烯绝缘胶带，并完全压平。

用胶带裁剪出一个 14 × 10 毫米的矩形，用于固定动物帽。接着，将两滴 NM 二号溶液分别移液至凹面载玻片中。然后使用截短的 P20 枪头，将最多 15 个动物外植体转移至每张载片，并用镊子调整 X 外植体的方向，使其顶端朝上。

使用金刚石笔在玻璃盖玻片上划痕，将其折断以制备较小的盖玻片。用弯曲的19号针头轻轻将玻璃盖玻片置于浮雕载玻片上，使其贴合，从而压紧动物极帽细胞的顶端层。

使用指甲油在避光条件下将玻片封固20分钟，并在4至6小时内进行成像。为确保动物帽状态良好，必须将动物帽正确放置于定制玻片及盖玻片中。将样品轻柔地加载至玻片上。

封片时切勿使用过多指甲油，否则会导致胶带起皱，进而使玻片密封失效。熟练掌握后，每种实验条件下需要注射约25个胚胎，以获得20个质量良好的动物极帽。次日可利用共聚焦显微镜对这些样本进行分析。

进行成像时，先使用低倍物镜找到 X explan，然后切换至 63 x 1.4 油镜以进行更高分辨率的成像。开启所需的激光器，包括用于 MIAN 的 405 激光、用于 GFP 的 488 激光以及 561 激光。

对于MRFP，优化激光功率，以便检测所有荧光信号。使用32通道检测器阵列，同时尽量减少所需的电压和增益，然后启用Lambda模式，并选择405 nm、488 nm和561 nm激光器。为获得更宽的视野，将图像放大倍数调至0.6倍。

接下来，将帧尺寸设置为所需图像大小。这为分析时进行四到八次的图像平均提供了足够的分辨率，以提高信噪比，并针对该数据集优化针孔大小。根据所用561纳米激光，采用405、488和561进行成像。

Diic 镜面收集从膜结合型 Saru、GFP 和膜结合型 RFP 发出的光。本实验中，从 415 至 720 纳米范围内每隔约 10 纳米收集一次光信号。根据此处所示文本方案进行图像分析：在对照条件下，GFP 标记的 sonic hedgehog 在动物极帽 X 外植体中的分布显示，sonic hedgehog GFP 被分泌并扩散到注射 mRNA 表达区域之外。

然而，在存在调节因子 SULF1 的情况下，Sonic Hedgehog GFP 的分布范围更受限制。在此样本中，仅在产生该蛋白的细胞克隆附近较短距离内可见少数几个 Sonic Hedgehog GFP 的信号焦点。该图显示了两种荧光标记的 Wit 配体（如图所示）被注射入细胞后的表征结果：Wnt8A 和 Wnt11B-HA-EGFP 均能在动物帽细胞膜上积累，其中 Wnt8A-HA-EGFP 的膜积累效率高于 Wnt11B-HA-EGFP。该图显示了在一群标记有膜锚定型青色荧光蛋白（cerulean）的细胞克隆中表达的 Wnt8A-HA-EGFP 的分布情况。

可见荧光标记的配体从源细胞扩散至上皮组织周围的细胞中。此处所示，通过图像分析软件提取多个实验样本中荧光标记的wind配体分布数据。通过测量从表达mem Saru的克隆区域到GFP荧光强度的距离，以确定wind扩散的范围及浓度梯度的形态。

在测量配体分布后，还可将本方案与另一种检测方法结合，以评估信号通路的输出，监测接受信号细胞的响应。通过这种方式，可尝试确定形态发生素的作用阈值范围。