Name: 细菌人工染色体:对于正链RNA病毒研究的功能基因组学工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学习利用细菌人工染色体构建日本脑炎病毒全长cDNA克隆，通过体外转录和电穿孔技术拯救感染性病毒颗粒。该方法为研究正链RNA病毒复制机制、致病机理及开发基因工程疫苗提供了重要的功能基因组学工具。

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作者谨此感谢犹他州科学、技术与研究基金对YML的支持，以及韩国国家研究基金会资助（项目编号：2009-0069679和2010-0010154）对SIY的支持。本研究由犹他农业实验站、犹他州立大学资助，并已批准为犹他农业实验站期刊论文第UAES #8753号。此外，作者感谢Deborah McClellan博士在编辑方面提供的帮助。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案已成功用于生成两种不同毒株（CNU/LP227 和 SA14-14-228）的日本脑炎病毒（JEV）全长感染性cDNA克隆。JEV属于黄病毒科，其功能性cDNA因宿主细胞毒性及克隆cDNA的遗传不稳定性而难以构建和扩增8,74-76。本方案包含三个主要部分：首先，使用高保真逆转录酶/DNA聚合酶最大限度地合成或扩增出与病毒RNA序列一致的cDNA；其次，在从初始cDNA亚克隆到最终全长cDNA组装的整个过程中，将含有毒性序列的病毒prM-E编码区（未发表数据）74,77,78克隆至拷贝数极低的BAC载体中；第三，采用可容纳平均大小为120–350 kb外源DNA的BAC克隆载体19-21，该载体对较大DNA插入片段的耐受性明显优于其他克隆载体。此克隆策略可广泛适用于许多其他正链RNA病毒，尤其是基因组大小约为10至32 kb的正链RNA病毒。构建感染性cDNA克隆是建立RNA病毒反向遗传学系统的关键步骤，对正链RNA病毒尤为重要，因为其基因组本身即可作为病毒mRNA，由宿主细胞核糖体翻译产生病毒蛋白。因此，将由cDNA衍生的全长RNA分子导入易感宿主细胞即可启动病毒复制。结合重组DNA技术，获得感染性JEV cDNA克隆显著加深了我们在分子水平上对病毒生命周期多个方面的理解，例如基因表达73,79和基因组复制63,64。此外，全长JEV cDNA克隆已被证实是开发抗病毒疫苗28和基因递送载体80,81的重要工具。
与所有正义链RNA病毒一样，构建可用于合成高感染性RNA的可靠功能性JEV全长cDNA涉及多个关键步骤 体外理想情况下，由全长cDNA克隆转录而来的合成RNA序列应与病毒基因组RNA序列完全相同，特别是病毒RNA复制起始所必需的5'-和3'-末端序列。60-62 在本实验方案中，通过将SP6启动子序列置于病毒基因组第一个腺嘌呤核苷酸的上游，并在下游设置一个独特的人工序列，确保了5'-和3'-端的真实性和准确性。 Xba I 限制性位点，分别位于病毒基因组最后一个胸腺嘧啶核苷酸的下游。通过从线性化质粒进行加帽的体外转录，产生具有真实5'和3'末端的合成RNA Xba 使用SP6 RNA聚合酶，以m为引物，对I-线性化并经MBN处理的cDNA模板进行反应7G(5')ppp(5')A 帽类似物。本方案可通过多种方式进行修改。 体外 转录，另一种噬菌体RNA聚合酶（例如，T3 或 T7）可与其明确定义的启动子序列联合使用。27 作为截短位点，如果某个不同的限制性酶切位点在病毒基因组中不存在，并且由线性化cDNA产生的合成RNA以其真实的3'端结尾，则可使用该位点。当合成RNA的3'端含有三个或四个与病毒无关的核苷酸时，其RNA感染性会下降约10倍，这已证明3'端核苷酸序列的重要性。27 在 体外 转录反应，包括m7G(5')ppp(5')A 和 m7G(5')ppp(5')G 帽类似物同样可以有效使用，尽管后者会在病毒5'端上游引入一个无关的额外G核苷酸，但这一添加并不影响合成RNA的感染性或复制能力。27 此外，进行RNA感染性检测时，无需通过DNase I消化去除cDNA模板，因为cDNA模板本身不具有感染性。27
目前，BAC 技术已应用于构建少数几种正义链 RNA 病毒的感染性 cDNA 克隆，包括两种乙型脑炎病毒（JEV），CNU/LP227 和 SA14-14-228（基因组大小约为 11 kb）；两种登革病毒，BR/9026 和 NGC29（约 11 kb）；牛病毒性腹泻病毒 SD1（约 12 kb）25；两种经典猪瘟病毒，C 株和 Paderborn（约 12 kb）24；边界病病毒 Gifhorn（约 12 kb）24；猪繁殖与呼吸综合征病毒 PL97-1/LP1（约 15 kb）30；可传播性胃肠炎病毒 PUR46-MAD（约 29 kb）16；猫传染性腹膜炎病毒 DF-2（约 29 kb）32；严重急性呼吸综合征冠状病毒 Urbani（约 30 kb）9；中东呼吸综合征冠状病毒 EMC/2012（约 30 kb）17；以及人冠状病毒 OC43（约 31 kb）31。使用 BAC 构建 cDNA 的主要优势在于其大尺寸、单拷贝或双拷贝 BAC 质粒具有高度的遗传稳定性；然而，其极低拷贝数的固有特性也是一大劣势，因为这会导致 BAC DNA 产量极低，并进而降低 BAC DNA 相对于宿主染色体 DNA 的纯度。在本实验方案中，通过在营养丰富的 2xYT 培养基中培养转化了感染性 BAC pBAC/SA14-14-2 的 E. coli DH10B 菌株，以最大化 BAC DNA 的产量。尽管如此，从 500 ml 的 2xYT 肉汤培养物中平均仅能获得约 15 µg 的 BAC DNA。此外，为获得最佳纯度，应采用 CsCl-EtBr 密度梯度离心法纯化 BAC DNA，而非常用的基于柱的质粒提取方法。然而，必须注意的是，转化了 BAC 的 E. coli 不应过度生长，因为这可能危及克隆 cDNA 的遗传稳定性，且更高的菌体生长量并不一定带来更高的 DNA 产量或更纯的 BAC DNA。
本文所述方案是一种优化的、高效且简化的构建与扩增基因稳定型全长感染性cDNA克隆的方法，该克隆以细菌人工染色体（BAC）形式存在，适用于日本脑炎病毒（JEV），而这一操作曾被认为在实际操作中几乎不可能实现。相同的克隆策略也可应用于许多其他正链RNA病毒。通常情况下，感染性cDNA克隆使我们能够在病毒RNA基因组中引入多种突变（例如，缺失、插入和点突变），以研究这些突变在病毒复制和致病过程中的生物学功能。基于cDNA的反向遗传学系统使得开发和测试针对特定正链RNA病毒毒力因子的疫苗和治疗候选物成为可能。此外，该感染性cDNA技术还可作为病毒载体，用于表达一个或多个感兴趣的外源基因，从而广泛应用于生物医学研究的多个领域。

对于RNA病毒学家而言，20世纪70年代末重组DNA技术的出现使得将病毒RNA基因组转化为cDNA克隆成为可能，这些克隆随后可在细菌中以质粒形式扩增，从而实现对RNA病毒的遗传操作。1 首个被分子克隆的RNA病毒是噬菌体Qβ，一种感染细菌的正链RNA病毒 大肠杆菌含有Qβ基因组RNA完整cDNA拷贝的质粒在导入后可产生具有感染性的Qβ噬菌体 E. coli.2 此后不久，该技术被应用于脊髓灰质炎病毒——一种感染人类和动物的正义链RNA病毒。含有脊髓灰质炎病毒基因组RNA全长cDNA的质粒在转染哺乳动物细胞后具有感染性，并能产生具有感染性的病毒颗粒。3 在此 &#34;DNA启动的&#34; 方法中，克隆的cDNA应在细胞内转录以启动病毒RNA复制；然而，转录如何起始以及转录产物如何加工成正确的病毒序列尚不清楚。这一问题促使了另一种替代方法的开发 &#34;RNA启动的&#34; 方法，即将病毒RNA基因组的完整cDNA拷贝克隆至可被某种聚合酶识别的启动子下游 E. coli 或噬菌体RNA聚合酶用于合成RNA的制备 体外 具有明确的5'和3'末端，在导入宿主细胞后可完成完整的病毒复制周期。4,5 该方法首次成功应用于雀麦花叶病毒，6,7 一种植物正链RNA病毒。此后，RNA启动法已被开发用于多种正链RNA病毒，包括杯状病毒、甲病毒、黄病毒、动脉炎病毒和冠状病毒。1,4,5,8
在基于DNA和基于RNA的反向遗传学系统中，全长cDNA克隆的构建是产生正链RNA病毒的感染性DNA或RNA的关键，但随着病毒基因组长度的增加，这一过程会面临显著的技术挑战。9-17 特别是，长度约为10-32 kb的大RNA基因组给全长功能性cDNA的克隆带来了三个主要障碍。18 第一个难点是合成忠实地cDNA拷贝，因为逆转录PCR的保真度与病毒RNA的长度成反比。第二个障碍是可能存在潜在毒性序列，因为较长的RNA分子更可能含有意外序列，导致cDNA片段在质粒中不稳定 E. coli第三个也是最关键的问题是合适载体的可获得性，因为很难找到能够容纳病毒cDNA插入片段的克隆载体 &#62;10 kb。在过去的三十年中，这些障碍已通过酶学、方法学和载体学的多项进展得以克服。1,4,5,8 在这些技术中，最具前景和创新性的进展是将大型正链RNA病毒克隆为具有感染性的细菌人工染色体（BAC）。BAC载体是一种基于F质粒的低拷贝克隆质粒（每细胞1-2个拷贝）， E. coli 生育力因子，平均DNA插入片段大小约为~120-350 kb。19-21 DNA片段以类似于克隆至通用克隆载体的方式插入BAC载体中；所获得的BAC克隆在多代培养中保持稳定 E. coli22,23 迄今为止，BAC 技术已被用于构建感染性 cDNA 克隆 &#62;三个正义链RNA病毒科的10个成员 即, 黄病毒科,24-29动脉炎病毒科,30 和 冠状病毒科.9,16,17,31,32
以日本脑炎病毒（JEV）为例，本文报道了可用于构建多种正链RNA病毒的遗传稳定全长感染性细菌人工染色体（BAC）的详细操作步骤。JEV是一种人畜共患的黄病毒33，在自然界中通过蚊媒在鸟类、猪及其他脊椎动物宿主之间传播34,35。在人类中，JEV感染可引起严重的、常致死的神经系统疾病——日本脑炎（JE）36，该疾病流行于亚洲及西太平洋部分地区37,38，每年估计发生约50,000至175,000例临床病例39,40。JEV基因组为长约11 kb的单股正链RNA分子，包含一个由5'和3'端两个非编码区（NCRs）包围的单一开放阅读框（ORF）41,42。该ORF编码一种多聚蛋白，由宿主和病毒蛋白酶切割后生成10个独立蛋白，按N端至C端方向依次命名为C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS534,43,44。此外，NS1的一种延长形式（NS1'）通过NS2A基因第8至第9密码子处的-1核糖体移码表达产生45,46。在这11种蛋白中，三种结构蛋白（C、prM和E）对感染性病毒颗粒的形成至关重要47,48，其余八种非结构蛋白（NS1至NS5及NS1'）在病毒RNA复制49-51、病毒粒子组装52-56以及逃逸先天免疫57-59过程中发挥关键作用。5'和3'端NCR均含有保守的一级序列，并可形成RNA二级/三级结构60-62，对调控病毒RNA复制具有重要意义63,64。
本方案描述了构建全长感染性乙型脑炎病毒SA14-14-2 BAC的工具、方法和策略28。该功能性BAC克隆包含乙型脑炎病毒基因组RNA的完整cDNA拷贝65，其5'端上游包含SP6 RNA聚合酶启动子，3'端下游含一个独特的Xba I限制性酶切位点，可用于体外加尾转录。in vitro run-off转录。该BAC技术适用于构建多种正义链RNA病毒的完全功能性cDNA分子克隆。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 分子克隆&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>放射性</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（低熔点）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>丁醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>DE-81 滤纸</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>有毒且高度致突变</td></tr><tr><td>滤柱（质粒大提试剂盒）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>糖原&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>易燃</td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>易燃</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>绿豆核酸酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>针头（18G，20G）</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>生物危害（锐器废弃物）</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>苯酚（缓冲液饱和）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>有毒且高度腐蚀性</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>有毒且高度腐蚀性</td></tr><tr><td>苯酚:硫氰酸胍</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>有毒、腐蚀性且刺激性</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钾</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 混合液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>可密封聚丙烯管（16 &amp;times; 76 mm）&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>离心柱（质粒小提试剂盒）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA（酵母）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>α-最低必需培养基</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（50 mL）</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（150 mm）&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>比色杯（2 mm 间隙）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>有毒且致癌</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>六孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>维生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳系统</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>长波紫外灯（手持式）</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

细菌人工染色体：正链rna病毒功能基因组学研究的工具

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

反向遗传学是一种完全从克隆的cDNA拯救感染性病毒的技术，该技术已彻底改变了正链RNA病毒领域的研究，因为这类病毒的基因组与细胞mRNA具有相同的极性。基于cDNA的反向遗传系统是一种开创性方法，可直接操控病毒基因组RNA，从而生成重组病毒，用于研究病毒RNA元件及其基因产物在病毒复制和致病过程中的分子与遗传特性。该系统还提供了一个宝贵的平台，可用于开发基因定义明确的疫苗以及用于递送外源基因的病毒载体。然而，对于许多正链RNA病毒（如日本脑炎病毒（JEV））而言，克隆的cDNA往往不稳定，这为功能性cDNA的构建与扩增带来了主要障碍。本文报告介绍了构建和扩增遗传稳定的全长感染性JEV cDNA并将其作为细菌人工染色体（BAC）进行操作时所需的战略考量，所采用的通用实验流程包括：病毒RNA提取、cDNA合成、cDNA亚克隆与修饰、全长cDNA的组装、cDNA线性化、体外 RNA合成以及病毒恢复。本方案提供了一种通用的方法，适用于将多种正链RNA病毒（特别是基因组长度&gt;10 kb者）的全长cDNA克隆至BAC载体中，从而可通过噬菌体RNA聚合酶在体外转录产生具有感染性的RNA。

对于所有正义链RNA病毒而言，反向遗传系统的可靠性和效率取决于克隆的全长cDNA的遗传稳定性，该cDNA序列与病毒基因组RNA的共识序列相对应。27 图1 展示了一种五步策略，用于构建全长感染性cDNA作为乙脑病毒SA株的BAC14-14-228第1步：从感染JEV的BHK-21细胞的细胞培养上清液中纯化病毒RNA图1A）；第二步，合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA扩增子（F1至F4）（图1B）；步骤3，将四个连续的cDNA片段分别亚克隆至BAC载体，构建pBAC/F1至pBAC/F4（图1C）；步骤 4，对克隆的 cDNA 进行修饰以 体外 SP6 RNA聚合酶体外转录 即，在病毒5'端上游紧邻处插入SP6启动子序列（pBAC/F1）SP6），消除已有的内部 Xba 在核苷酸9131位点引入一个同义点突变A以创建I位点9134→T (pBAC/F3基因敲除），并插入一种新型人工 Xba 紧接病毒3'-端下游的跑出位点（pBAC/F4）RO) (图1D）；以及第5步，全长SA的组装14-14-2 cDNA BAC，pBAC/SA14-14-2 (图1E). 表1 列出了本克隆实验中所使用的寡核苷酸序列。28
为了构建具有功能性的JEV全长cDNA，首要步骤是以纯化的病毒RNA为模板，通过RT-PCR合成四个相互重叠的cDNA片段。图2展示了将四个RT-PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后的典型结果。该凝胶图像清晰表明，JEV全长cDNA已被扩增为四个相互重叠的cDNA片段。在某些情况下，由于引物在cDNA合成或扩增过程中发生非特异性结合，RT-PCR反应可能会产生一种或多种额外的病毒特异性或非特异性产物，这些产物通常小于预期目标产物。另一方面，若在病毒RNA提取过程中意外引入RNase污染，或RT-PCR操作不当，则可能导致几乎无法扩增出预期的RT-PCR产物。
下一步关键步骤是将部分或全长JEV cDNA克隆并修饰到BAC中，该过程相对简单，采用标准的重组DNA技术即可完成。69 图3 展示了含有JEV SA全长cDNA的BAC克隆纯化的代表性结果14-14-2 通过 CsCl-EtBr 梯度离心分带获得。在本实验中，经过 401,700 × g 离心 16 小时后，出现两条明显条带， 即，该 E. coli 染色体DNA位于上方，超螺旋BAC质粒DNA位于下方，两者在长波紫外光下可见于试管中央。最小体积（约400 µl用注射器在管壁侧面穿孔，小心收集下方的BAC DNA条带。随后通过丁醇抽提去除BAC DNA中的溴化乙锭（EtBr），再通过乙醇沉淀浓缩不含溴化乙锭的BAC DNA。
最后一步是测定体外转录合成RNA的特异性感染性 体外 来自全长的SA14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2）在RNA转染入易感细胞后（图4）。此步骤包括三个连续步骤：步骤1，全长SA的线性化；14病毒基因组3'端的-14-2 cDNA（图4A）；第二步，通过加尾转录从线性化cDNA合成RNA（run-off transcription）图4B）；以及第3步，在转染了合成RNA的BHK-21细胞中拯救重组病毒（图4C）。实验中，使用了两种独立的pBAC/SA克隆14-14-2 用...进行线性化处理 Xba I型消化并用MBN处理以去除由 Xba I 消化。线性化的 BAC 通过酚-氯仿抽提纯化，随后进行乙醇沉淀。两种纯化后 BAC 的线性化结果通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳验证。图 5A）。苯酚-氯仿抽提必须小心操作，以确保线性化的BAC不含RNase。两种线性化的BAC分别作为cDNA模板，在SP6 RNA聚合酶作用下进行加帽的体外转录，同时加入m7G(5')ppp(5')A 帽类似物。通过将两个体外转录反应混合物的等分试样与参照的1 kb DNA ladder一同在0.6%琼脂糖凝胶上电泳，验证合成RNA的完整性。图 5B). 在此简易检测中，主要的显著RNA条带始终迁移至3 kb参考DNA条带略下方，且呈现清晰锐利的形态。然而，降解的RNA在同一凝胶上则会呈现弥散模糊的外观。
感染灶检测法是测定合成RNA特异性感染活性的金标准。该检测通过将RNA样本电穿孔转染至BHK-21细胞，随后将等量的10倍系列稀释的电穿孔细胞接种于含 naive BHK-21细胞的6孔板中（3 × 105 细胞/孔），并将琼脂糖覆盖于细胞单层上。孵育4天后，用甲醛固定存活的细胞，并用结晶紫溶液染色，以定量感染中心（空斑）的数量，该数量对应于递送至细胞内的感染性RNA分子数（图 6A）。由于用于的cDNA模板 体外 转录已被证实不具有感染性，27 将转录反应混合物的一部分直接用于电穿孔。电穿孔是RNA转染的首选方法； alternatively，RNA也可通过DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体等其他方法进行转染。RNA电穿孔效率很高，但如果电穿孔反应中存在盐类或电穿孔比色皿被重复使用，则偶尔会发生电脉冲“电弧”现象。通过免疫荧光检测，使用抗NS1兔抗血清检测RNA转染细胞中病毒蛋白的表达图6B). 通过噬斑实验分析了RNA转染细胞上清液中积累的病毒颗粒的产生情况（图6C实验结果明确表明，cDNA衍生的合成RNA在允许性BHK-21细胞中具有感染性，能够产生高滴度的重组病毒。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸</td>
			<td>序列a（5' 至 3'）</td>
			<td>位置b</td>
			<td>极性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1RT</td>
			<td>TAGGGATCTGGGCGTTTCTG 
			GCAAAT</td>
			<td>2578–2603</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1F</td>
			<td>aatcccgggAGAAGTTTATC 
			TGTGTGAACTT</td>
			<td>1–22</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1R</td>
			<td>attgcggccgcCCACGTCGT 
			TGTGCACGAAGAT</td>
			<td>2532–2553</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2RT</td>
			<td>TTCTGCCTACTCTGCCCCTC 
			CGTTGA</td>
			<td>5975–6000</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2F</td>
			<td>aatcccgggTCAAGCTCAGT 
			GATGTTAACAT</td>
			<td>1800–1821</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2R</td>
			<td>attgcggccgcGATGGGTTT 
			CCGAGGATGACTC</td>
			<td>5929–5950</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3RT</td>
			<td>ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC 
			AGGTCT</td>
			<td>9426–9451</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3F</td>
			<td>aatcccgggGAGGATACATT 
			GCTACCAAGGT</td>
			<td>5500–5521</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3R</td>
			<td>attgcggccgcGTAAGTCAG 
			TTCAATTATGGCT</td>
			<td>9380–9401</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4RT</td>
			<td>AGATCCTGTGTTCTTCCTCA 
			CCACCA</td>
			<td>10952–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4F</td>
			<td>aatcccgggAGTGGAAGGCT 
			CAGGCGTCCAA</td>
			<td>9200–9221</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4R</td>
			<td>attgcggccgcAGATCCTGT 
			GTTCTTCCTCACC</td>
			<td>10956–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6F</td>
			<td>cataccccgcgtattcccac 
			ta</td>
			<td></td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6R</td>
			<td>ACAGATAAACTTCTctatag 
			tgtcccctaaa</td>
			<td>1–14</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1F</td>
			<td>aggggacactatagAGAAGT 
			TTATCTGTGTG</td>
			<td>1–17</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1R</td>
			<td>TGGATCATTGCCCATGGTAA 
			GCTTA</td>
			<td>638–662</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1F</td>
			<td>CGAATGGATCGCACAGTGTG 
			GAGAG</td>
			<td>8403–8427</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1R</td>
			<td>AAAGCTTCAAACTCAAGATA 
			CCGTGCTCC</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2F</td>
			<td>GGAGCACGGTATCTTGAGTT 
			TGAAGCTTT</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2R</td>
			<td>cacgtggacgagggcatgcc 
			tgcag</td>
			<td></td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROF</td>
			<td>CCAGGAGGACTGGGTTACCA 
			AAGCC</td>
			<td>10670–10694</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROR</td>
			<td>agggcggccgctctagAGAT 
			CCTGTGTTCTTCCTCACCAC</td>
			<td>10954–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">aJEV 序列以大写字母表示，BAC 序列以小写字母表示。 
			b核苷酸位置参考日本脑炎病毒 SA14-14-2 完整基因组序列（GenBank 登录号 JN604986）。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于cDNA合成、PCR扩增和BAC诱变的寡核苷酸。
<img alt="Viral RNA isolation and full-length cDNA assembly diagram, including cDNA synthesis, subcloning, and modification processes." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 日本脑炎病毒SA株全长cDNA构建策略14-14-2 作为 BAC。 (A) 从JEV颗粒中分离病毒RNA。图示为JEV SA基因组RNA的示意图14-14-2. (B) 合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA片段（F1至F4）。C将四个重叠的cDNA片段亚克隆至BAC载体中，构建pBAC/F1至pBAC/F4。D) 克隆 cDNA 的修饰以进行加尾转录 体外pBAC/F1SP6 是 pBAC/F1 的一个衍生物，其在病毒 5' 端上游含有 SP6 启动子序列。pBAC/F3敲除 是 pBAC/F3 的一个衍生物，包含一个同义点突变（A9134→T，星号）。pBAC/F4RO 是 pBAC/F4 的一种衍生物，含有一个人工合成的 Xba 病毒3'端下游的游离片段。E) SA全长的组装14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；按千碱基大小分离的DNA；显示分子量标记物。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 覆盖JEV SA14-14-2全长基因组RNA的四个重叠cDNA片段（F1至F4）的合成。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳对四个RT-PCR产物进行分析。M，1 kb DNA ladder。四个cDNA片段的预期大小已在凝胶图像底部标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氯化铯密度梯度离心分离染色体DNA、BAC DNA和RNA；示意图。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 含有JEV SA14-14-2全长cDNA的BAC的纯化。 采用SDS-碱裂解法从E. coli DH10B中提取BAC质粒，再通过CsCl-EtBr密度梯度离心进行条带收集以进一步纯化。图中展示的是使用16 × 76 mm可密封聚丙烯管进行CsCl-EtBr梯度离心的示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="cDNA linearization and RNA synthesis diagram; virus recovery via RNA transfection; genetic process." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 从全长JEV SA中恢复感染性病毒的概述14-14-2 cDNA 在 BAC 中组装 (A) cDNA 模板的线性化。全长 JEV BAC 用限制性内切酶切割 Xba 我并用 MBN 处理。 (B) RNA转录物的合成。在m存在的情况下，线性化的cDNA由SP6 RNA聚合酶进行转录7G(5')ppp(5')A 帽类似物。C合成JEV的回收。 体外 将转录的RNA通过电穿孔转染至BHK-21细胞，以产生高滴度的合成病毒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="cDNA 模板和 RNA 转录本的凝胶电泳图；按碱基对大小分离 DNA。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 利用全长 JEV BAC 作为 cDNA 模板，通过体外转录合成 RNA。（A）线性化全长 JEV BAC pBAC/SA14-14-2 的制备。两个独立的 pBAC/SA14-14-2 克隆（Cl.1 和 Cl.2）经 Xba I 酶切并随后用 MBN 处理，实现线性化。通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测线性化的 BAC。(B) 通过截断式转录生成合成 RNA。以上述两种线性化 BAC 分别作为模板，进行 SP6 RNA 聚合酶介导的截断式转录。取两组转录反应的等分试样在 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳分析。M，1 kb DNA 标准分子量标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA感染性与病毒产量分析；病毒研究中的图表、蚀斑及荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 来源于全长JEV BAC的合成RNA的特异性感染性及合成病毒的回收。 对BHK-21细胞进行模拟电穿孔（Mock）或使用来自两个独立全长JEV BAC克隆（Cl.1 和 Cl.2）的RNA转录本进行电穿孔。（A）RNA感染性。转染后4天，细胞覆盖琼脂糖并用结晶紫染色。通过感染中心测定法确定RNA的感染性，以估算电穿孔进入细胞的感染性RNA量（左图）。同时展示感染中心的代表性图像（右图）。（B）蛋白表达。细胞培养于4孔培养板中。在转染后20小时（hpt），通过免疫荧光检测分析RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达，使用一抗为抗NS1兔抗血清，二抗为Cy3标记的 goat anti-rabbit IgG（红色）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染（蓝色）。免疫荧光图像与其对应的微分干涉差图像叠加显示。（C）病毒产量。细胞培养于150 mm培养皿中。通过蚀斑测定法检测RNA电穿孔细胞在转染后22小时和40小时时培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

反向遗传学是一种完全从克隆的cDNA中拯救出具有感染性病毒的技术，该技术已彻底改变了正义链RNA病毒领域的研究，其……

本实验的总体目标是从克隆的互补DNA（cDNA）中拯救出具有感染性的病毒颗粒，这些病毒属于基因组极性与细胞mRNA相同的正链RNA病毒，例如日本脑炎病毒。基于cDNA的反向遗传学技术是一种开创性方法，可直接对病毒基因组RNA进行操作，从而生成重组病毒，用于病毒复制和致病机制的分子与遗传学研究。该技术还提供了一个有价值的平台，可用于开发基因明确的痘苗病毒载体，以递送外源基因。这些方法适用于克隆全长 cDNA，可用于负链或正链 RNA 病毒，尤其是基因组长度超过 10 kb 的病毒。演示该实验流程的人员包括本实验室的数位成员：研究助理尹相一（Sang-Im Yun）、博士后研究员成炳赫（Byung-Hak Song）和金珍京（Jin-Kyoung Kim），以及本科生乔丹·弗兰克（Jordan Frank）。本出版物的视频部分涵盖了包含目的序列的细菌人工染色体的制备、从反向质粒转录合成RNA、RNA感染性的测定以及病毒产量的检测方法。在生成BAC质粒之前的所有操作步骤均在文字版实验方案中进行了详细说明。进行本实验时，首先将含有BAC质粒的E. coli DH10B单菌落接种于3毫升含氯霉素的2X YT液体培养基中。在35摄氏度、225至250 RPM振荡条件下培养10小时。培养10小时后，扩大培养规模。随后将500微升的菌液接种到500毫升培养基中，并在剧烈振荡条件下培养6小时。6小时后，将细菌培养物分装至两个250毫升的瓶子中，在4摄氏度、3,100 ×g条件下离心15分钟。然后将每个沉淀重悬于30毫升GTE溶液中。加入500 µL溶菌酶，将悬浮液在冰上孵育10分钟。在此期间，为下一步准备新鲜的裂解液。10分钟后，加入60 mL裂解液，轻轻旋转混匀，直至溶液变得澄清。将反应液在室温下放置10分钟。接着，向每个瓶子中加入45毫升中和溶液，并反复倒置瓶子直至充分混匀。然后将瓶子置于冰上孵育10分钟。通过高速冷冻离心收集中和后的裂解液，然后将上清液转移至两个新的250毫升瓶中。向每个瓶中加入0.6倍体积的100%异丙醇，并置于冰上静置20分钟。接下来，离心沉淀，弃去上清液，并将沉淀物溶于5毫升TE缓冲液中。将两个样品合并至一个50毫升离心管中，加入等体积的5摩尔氯化锂以沉淀RNA，并将混合物置于冰上孵育10分钟。通过20分钟的低温离心收集RNA沉淀。然后将上清液转移至一个新的250毫升离心管中，加入两倍体积的100%异丙醇，并将离心管置于冰上，以使DNA沉淀析出。20分钟后，离心沉淀，吸除上清液，将DNA沉淀物重悬于9.5毫升TE缓冲液中，并将DNA溶液转移至50毫升离心管中。继续制备过程，使用溴化乙锭建立氯化铯梯度。用带有18号针头的注射器将混合物装入可密封的聚丙烯管中，并密封管子。将密封的管子在超速离心机中离心过夜，以形成氯化铯梯度。第二天，从氯化铯梯度中收集BAC质粒的DNA条带。使用18号针头在梯度顶部穿刺以形成通气孔，用20号针头连接注射器从梯度侧面收集BAC DNA，然后将收集物转移至1.7毫升微量离心管中。进行洗涤操作：加入2.5倍体积的水饱和正丁醇，用普通涡旋振荡混合。然后在室温下离心混合物，并将下层水相转移至新的1.7毫升微量离心管中。重复此洗涤步骤共六次，以彻底去除溴化乙锭。现在沉淀BAC DNA。向管中加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠和2.5倍体积的100%乙醇。将混合物在冰上孵育10分钟。然后在室温下离心以沉淀DNA，并用1毫升70%乙醇洗涤DNA沉淀。重复一次离心并再次收集沉淀。最后，将沉淀的DNA在空气中干燥10分钟，并溶于200微升TE缓冲液中。用 XbaI 限制性内切酶对 BAC 质粒进行大规模酶切消化，总体积为 100 微升。在 37 摄氏度下进行酶切反应，持续 12 至 15 小时。随后，在 30 摄氏度下加入额外的 25 单位绿豆芽核酸酶，继续孵育 2 小时。孵育结束后，用蒸馏水将体积补至 300 微升。随后进行苯酚抽提：向稀释后的样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，剧烈涡旋震荡 1 分钟，离心沉淀后，将上层水相转移至新管中。然后用氯仿重复提取。接着通过乙醇沉淀回收线性化的BAC DNA。离心收集DNA沉淀，弃去上清液，并用1毫升70%乙醇洗涤沉淀。重复离心步骤，然后将沉淀空气干燥。干燥10分钟后，将DNA沉淀溶解于30微升蒸馏水中。然后取1微升回收的BAC样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行检测。接下来，对线性化的BAC DNA进行25微升的截断式转录反应，反应中加入氚标记的UTP用于RNA定量。在37摄氏度条件下反应1小时，然后取1至2微升转录产物在0.6%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。将BHK-21细胞以每皿300万个细胞的密度接种于150毫米培养皿中，培养24小时。用预冷的A溶液冲洗细胞单层，然后通过胰蛋白酶消化法使细胞脱落。以270 ×g离心2分钟收集细胞。然后将细胞重悬于50毫升预冷的溶液A中，并再次离心沉淀。此洗涤步骤重复进行三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于溶液A中，浓度为每毫升2000万个细胞。随后，在一个2毫米比色皿中，取400微升细胞悬液与2微克合成RNA混合。立即在最佳条件下对混合物进行电穿孔，并让细胞静置10分钟。然后将细胞转移至含有600 µL完全培养基的微量离心管中。现在用1 mL体积对电穿孔后的细胞进行十倍系列稀释。取每种稀释液100 µL接种于正常BHK21细胞的单层上。孵育4至6小时后，用含FBS的MEM培养基配制的0.5%琼脂糖覆盖细胞，并继续培养4天。将BHK21细胞进行空载电穿孔处理或使用来自两个独立克隆的全长JEV-BAC的RNA转录本进行电穿孔。四天后，用结晶紫对细胞染色以观察细胞内的感染性RNA。通过该染色方法对感染灶进行定量。接着，在转染后20小时，利用抗NS1兔抗血清和Cy3标记的二抗（呈红色）检测RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达。细胞核用DAPI复染，呈蓝色。随后在转染后22小时和40小时，通过蚀斑实验检测RNA电穿孔细胞培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产生情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何从克隆的正链RNA病毒（如日本脑炎病毒）的cDNA中完全拯救出具有感染性的病毒。请务必注意，操作日本脑炎病毒及其他人类病原体可能具有极高的危险性，因此在进行此类实验操作前，必须接受适当的生物安全培训。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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