Name: 细菌人工染色体:对于正链RNA病毒研究的功能基因组学工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学习利用细菌人工染色体构建日本脑炎病毒全长cDNA克隆，通过体外转录和电穿孔技术拯救感染性病毒颗粒。该方法为研究正链RNA病毒复制机制、致病机理及开发基因工程疫苗提供了重要的功能基因组学工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢犹他州科学、技术与研究基金对YML的支持，以及韩国国家研究基金会资助（项目编号：2009-0069679和2010-0010154）对SIY的支持。本研究由犹他农业实验站、犹他州立大学资助，并已批准为犹他农业实验站期刊论文第UAES #8753号。此外，作者感谢Deborah McClellan博士在编辑方面提供的帮助。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案已成功用于生成两种不同毒株（CNU/LP227 和 SA14-14-228）的日本脑炎病毒（JEV）全长感染性cDNA克隆。JEV属于黄病毒科，其功能性cDNA因宿主细胞毒性及克隆cDNA的遗传不稳定性而难以构建和扩增8,74-76。本方案包含三个主要部分：首先，使用高保真逆转录酶/DNA聚合酶最大限度地合成或扩增出与病毒RNA序列一致的cDNA；其次，在从初始cDNA亚克隆到最终全长cDNA组装的整个过程中，将含有毒性序列的病毒prM-E编码区（未发表数据）74,77,78克隆至拷贝数极低的BAC载体中；第三，采用可容纳平均大小为120–350 kb外源DNA的BAC克隆载体19-21，该载体对较大DNA插入片段的耐受性明显优于其他克隆载体。此克隆策略可广泛适用于许多其他正链RNA病毒，尤其是基因组大小约为10至32 kb的正链RNA病毒。构建感染性cDNA克隆是建立RNA病毒反向遗传学系统的关键步骤，对正链RNA病毒尤为重要，因为其基因组本身即可作为病毒mRNA，由宿主细胞核糖体翻译产生病毒蛋白。因此，将由cDNA衍生的全长RNA分子导入易感宿主细胞即可启动病毒复制。结合重组DNA技术，获得感染性JEV cDNA克隆显著加深了我们在分子水平上对病毒生命周期多个方面的理解，例如基因表达73,79和基因组复制63,64。此外，全长JEV cDNA克隆已被证实是开发抗病毒疫苗28和基因递送载体80,81的重要工具。
与所有正义链RNA病毒一样，构建可用于合成高感染性RNA的可靠功能性JEV全长cDNA涉及多个关键步骤 体外理想情况下，由全长cDNA克隆转录而来的合成RNA序列应与病毒基因组RNA序列完全相同，特别是病毒RNA复制起始所必需的5'-和3'-末端序列。60-62 在本实验方案中，通过将SP6启动子序列置于病毒基因组第一个腺嘌呤核苷酸的上游，并在下游设置一个独特的人工序列，确保了5'-和3'-端的真实性和准确性。 Xba I 限制性位点，分别位于病毒基因组最后一个胸腺嘧啶核苷酸的下游。通过从线性化质粒进行加帽的体外转录，产生具有真实5'和3'末端的合成RNA Xba 使用SP6 RNA聚合酶，以m为引物，对I-线性化并经MBN处理的cDNA模板进行反应7G(5')ppp(5')A 帽类似物。本方案可通过多种方式进行修改。 体外 转录，另一种噬菌体RNA聚合酶（例如，T3 或 T7）可与其明确定义的启动子序列联合使用。27 作为截短位点，如果某个不同的限制性酶切位点在病毒基因组中不存在，并且由线性化cDNA产生的合成RNA以其真实的3'端结尾，则可使用该位点。当合成RNA的3'端含有三个或四个与病毒无关的核苷酸时，其RNA感染性会下降约10倍，这已证明3'端核苷酸序列的重要性。27 在 体外 转录反应，包括m7G(5')ppp(5')A 和 m7G(5')ppp(5')G 帽类似物同样可以有效使用，尽管后者会在病毒5'端上游引入一个无关的额外G核苷酸，但这一添加并不影响合成RNA的感染性或复制能力。27 此外，进行RNA感染性检测时，无需通过DNase I消化去除cDNA模板，因为cDNA模板本身不具有感染性。27
目前，BAC 技术已应用于构建少数几种正义链 RNA 病毒的感染性 cDNA 克隆，包括两种乙型脑炎病毒（JEV），CNU/LP227 和 SA14-14-228（基因组大小约为 11 kb）；两种登革病毒，BR/9026 和 NGC29（约 11 kb）；牛病毒性腹泻病毒 SD1（约 12 kb）25；两种经典猪瘟病毒，C 株和 Paderborn（约 12 kb）24；边界病病毒 Gifhorn（约 12 kb）24；猪繁殖与呼吸综合征病毒 PL97-1/LP1（约 15 kb）30；可传播性胃肠炎病毒 PUR46-MAD（约 29 kb）16；猫传染性腹膜炎病毒 DF-2（约 29 kb）32；严重急性呼吸综合征冠状病毒 Urbani（约 30 kb）9；中东呼吸综合征冠状病毒 EMC/2012（约 30 kb）17；以及人冠状病毒 OC43（约 31 kb）31。使用 BAC 构建 cDNA 的主要优势在于其大尺寸、单拷贝或双拷贝 BAC 质粒具有高度的遗传稳定性；然而，其极低拷贝数的固有特性也是一大劣势，因为这会导致 BAC DNA 产量极低，并进而降低 BAC DNA 相对于宿主染色体 DNA 的纯度。在本实验方案中，通过在营养丰富的 2xYT 培养基中培养转化了感染性 BAC pBAC/SA14-14-2 的 E. coli DH10B 菌株，以最大化 BAC DNA 的产量。尽管如此，从 500 ml 的 2xYT 肉汤培养物中平均仅能获得约 15 µg 的 BAC DNA。此外，为获得最佳纯度，应采用 CsCl-EtBr 密度梯度离心法纯化 BAC DNA，而非常用的基于柱的质粒提取方法。然而，必须注意的是，转化了 BAC 的 E. coli 不应过度生长，因为这可能危及克隆 cDNA 的遗传稳定性，且更高的菌体生长量并不一定带来更高的 DNA 产量或更纯的 BAC DNA。
本文所述方案是一种优化的、高效且简化的构建与扩增基因稳定型全长感染性cDNA克隆的方法，该克隆以细菌人工染色体（BAC）形式存在，适用于日本脑炎病毒（JEV），而这一操作曾被认为在实际操作中几乎不可能实现。相同的克隆策略也可应用于许多其他正链RNA病毒。通常情况下，感染性cDNA克隆使我们能够在病毒RNA基因组中引入多种突变（例如，缺失、插入和点突变），以研究这些突变在病毒复制和致病过程中的生物学功能。基于cDNA的反向遗传学系统使得开发和测试针对特定正链RNA病毒毒力因子的疫苗和治疗候选物成为可能。此外，该感染性cDNA技术还可作为病毒载体，用于表达一个或多个感兴趣的外源基因，从而广泛应用于生物医学研究的多个领域。

对于RNA病毒学家而言，20世纪70年代末重组DNA技术的出现使得将病毒RNA基因组转化为cDNA克隆成为可能，这些克隆随后可在细菌中以质粒形式扩增，从而实现对RNA病毒的遗传操作。1 首个被分子克隆的RNA病毒是噬菌体Qβ，一种感染细菌的正链RNA病毒 大肠杆菌含有Qβ基因组RNA完整cDNA拷贝的质粒在导入后可产生具有感染性的Qβ噬菌体 E. coli.2 此后不久，该技术被应用于脊髓灰质炎病毒——一种感染人类和动物的正义链RNA病毒。含有脊髓灰质炎病毒基因组RNA全长cDNA的质粒在转染哺乳动物细胞后具有感染性，并能产生具有感染性的病毒颗粒。3 在此 &#34;DNA启动的&#34; 方法中，克隆的cDNA应在细胞内转录以启动病毒RNA复制；然而，转录如何起始以及转录产物如何加工成正确的病毒序列尚不清楚。这一问题促使了另一种替代方法的开发 &#34;RNA启动的&#34; 方法，即将病毒RNA基因组的完整cDNA拷贝克隆至可被某种聚合酶识别的启动子下游 E. coli 或噬菌体RNA聚合酶用于合成RNA的制备 体外 具有明确的5'和3'末端，在导入宿主细胞后可完成完整的病毒复制周期。4,5 该方法首次成功应用于雀麦花叶病毒，6,7 一种植物正链RNA病毒。此后，RNA启动法已被开发用于多种正链RNA病毒，包括杯状病毒、甲病毒、黄病毒、动脉炎病毒和冠状病毒。1,4,5,8
在基于DNA和基于RNA的反向遗传学系统中，全长cDNA克隆的构建是产生正链RNA病毒的感染性DNA或RNA的关键，但随着病毒基因组长度的增加，这一过程会面临显著的技术挑战。9-17 特别是，长度约为10-32 kb的大RNA基因组给全长功能性cDNA的克隆带来了三个主要障碍。18 第一个难点是合成忠实地cDNA拷贝，因为逆转录PCR的保真度与病毒RNA的长度成反比。第二个障碍是可能存在潜在毒性序列，因为较长的RNA分子更可能含有意外序列，导致cDNA片段在质粒中不稳定 E. coli第三个也是最关键的问题是合适载体的可获得性，因为很难找到能够容纳病毒cDNA插入片段的克隆载体 &#62;10 kb。在过去的三十年中，这些障碍已通过酶学、方法学和载体学的多项进展得以克服。1,4,5,8 在这些技术中，最具前景和创新性的进展是将大型正链RNA病毒克隆为具有感染性的细菌人工染色体（BAC）。BAC载体是一种基于F质粒的低拷贝克隆质粒（每细胞1-2个拷贝）， E. coli 生育力因子，平均DNA插入片段大小约为~120-350 kb。19-21 DNA片段以类似于克隆至通用克隆载体的方式插入BAC载体中；所获得的BAC克隆在多代培养中保持稳定 E. coli22,23 迄今为止，BAC 技术已被用于构建感染性 cDNA 克隆 &#62;三个正义链RNA病毒科的10个成员 即, 黄病毒科,24-29动脉炎病毒科,30 和 冠状病毒科.9,16,17,31,32
以日本脑炎病毒（JEV）为例，本文报道了可用于构建多种正链RNA病毒的遗传稳定全长感染性细菌人工染色体（BAC）的详细操作步骤。JEV是一种人畜共患的黄病毒33，在自然界中通过蚊媒在鸟类、猪及其他脊椎动物宿主之间传播34,35。在人类中，JEV感染可引起严重的、常致死的神经系统疾病——日本脑炎（JE）36，该疾病流行于亚洲及西太平洋部分地区37,38，每年估计发生约50,000至175,000例临床病例39,40。JEV基因组为长约11 kb的单股正链RNA分子，包含一个由5'和3'端两个非编码区（NCRs）包围的单一开放阅读框（ORF）41,42。该ORF编码一种多聚蛋白，由宿主和病毒蛋白酶切割后生成10个独立蛋白，按N端至C端方向依次命名为C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS534,43,44。此外，NS1的一种延长形式（NS1'）通过NS2A基因第8至第9密码子处的-1核糖体移码表达产生45,46。在这11种蛋白中，三种结构蛋白（C、prM和E）对感染性病毒颗粒的形成至关重要47,48，其余八种非结构蛋白（NS1至NS5及NS1'）在病毒RNA复制49-51、病毒粒子组装52-56以及逃逸先天免疫57-59过程中发挥关键作用。5'和3'端NCR均含有保守的一级序列，并可形成RNA二级/三级结构60-62，对调控病毒RNA复制具有重要意义63,64。
本方案描述了构建全长感染性乙型脑炎病毒SA14-14-2 BAC的工具、方法和策略28。该功能性BAC克隆包含乙型脑炎病毒基因组RNA的完整cDNA拷贝65，其5'端上游包含SP6 RNA聚合酶启动子，3'端下游含一个独特的Xba I限制性酶切位点，可用于体外加尾转录。in vitro run-off转录。该BAC技术适用于构建多种正义链RNA病毒的完全功能性cDNA分子克隆。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 分子克隆&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>放射性</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 瓶</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（低熔点）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>丁醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>致癌性</td></tr><tr><td>DE-81 滤纸</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合液</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>有毒且高度致突变</td></tr><tr><td>滤柱（质粒大提试剂盒）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>糖原&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>易燃</td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>易燃</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>绿豆核酸酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>针头（18G，20G）</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>生物危害（锐器废弃物）</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制寡核苷酸合成</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>苯酚（缓冲液饱和）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>有毒且高度腐蚀性</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>有毒且高度腐蚀性</td></tr><tr><td>苯酚:硫氰酸胍</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>有毒、腐蚀性且刺激性</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钾</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 混合液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>可密封聚丙烯管（16 &amp;times; 76 mm）&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>离心柱（质粒小提试剂盒）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA（酵母）</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>α-最低必需培养基</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（50 mL）</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（150 mm）&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>比色杯（2 mm 间隙）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>有毒且致癌</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>六孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>维生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳系统</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>长波紫外灯（手持式）</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

细菌人工染色体：正链rna病毒功能基因组学研究的工具

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

反向遗传学是一种完全从克隆的cDNA拯救感染性病毒的技术，该技术已彻底改变了正链RNA病毒领域的研究，因为这类病毒的基因组与细胞mRNA具有相同的极性。基于cDNA的反向遗传系统是一种开创性方法，可直接操控病毒基因组RNA，从而生成重组病毒，用于研究病毒RNA元件及其基因产物在病毒复制和致病过程中的分子与遗传特性。该系统还提供了一个宝贵的平台，可用于开发基因定义明确的疫苗以及用于递送外源基因的病毒载体。然而，对于许多正链RNA病毒（如日本脑炎病毒（JEV））而言，克隆的cDNA往往不稳定，这为功能性cDNA的构建与扩增带来了主要障碍。本文报告介绍了构建和扩增遗传稳定的全长感染性JEV cDNA并将其作为细菌人工染色体（BAC）进行操作时所需的战略考量，所采用的通用实验流程包括：病毒RNA提取、cDNA合成、cDNA亚克隆与修饰、全长cDNA的组装、cDNA线性化、体外 RNA合成以及病毒恢复。本方案提供了一种通用的方法，适用于将多种正链RNA病毒（特别是基因组长度&gt;10 kb者）的全长cDNA克隆至BAC载体中，从而可通过噬菌体RNA聚合酶在体外转录产生具有感染性的RNA。

对于所有正义链RNA病毒而言，反向遗传系统的可靠性和效率取决于克隆的全长cDNA的遗传稳定性，该cDNA序列与病毒基因组RNA的共识序列相对应。27 图1 展示了一种五步策略，用于构建全长感染性cDNA作为乙脑病毒SA株的BAC14-14-228第1步：从感染JEV的BHK-21细胞的细胞培养上清液中纯化病毒RNA图1A）；第二步，合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA扩增子（F1至F4）（图1B）；步骤3，将四个连续的cDNA片段分别亚克隆至BAC载体，构建pBAC/F1至pBAC/F4（图1C）；步骤 4，对克隆的 cDNA 进行修饰以 体外 SP6 RNA聚合酶体外转录 即，在病毒5'端上游紧邻处插入SP6启动子序列（pBAC/F1）SP6），消除已有的内部 Xba 在核苷酸9131位点引入一个同义点突变A以创建I位点9134→T (pBAC/F3基因敲除），并插入一种新型人工 Xba 紧接病毒3'-端下游的跑出位点（pBAC/F4）RO) (图1D）；以及第5步，全长SA的组装14-14-2 cDNA BAC，pBAC/SA14-14-2 (图1E). 表1 列出了本克隆实验中所使用的寡核苷酸序列。28
为了构建具有功能性的JEV全长cDNA，首要步骤是以纯化的病毒RNA为模板，通过RT-PCR合成四个相互重叠的cDNA片段。图2展示了将四个RT-PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后的典型结果。该凝胶图像清晰表明，JEV全长cDNA已被扩增为四个相互重叠的cDNA片段。在某些情况下，由于引物在cDNA合成或扩增过程中发生非特异性结合，RT-PCR反应可能会产生一种或多种额外的病毒特异性或非特异性产物，这些产物通常小于预期目标产物。另一方面，若在病毒RNA提取过程中意外引入RNase污染，或RT-PCR操作不当，则可能导致几乎无法扩增出预期的RT-PCR产物。
下一步关键步骤是将部分或全长JEV cDNA克隆并修饰到BAC中，该过程相对简单，采用标准的重组DNA技术即可完成。69 图3 展示了含有JEV SA全长cDNA的BAC克隆纯化的代表性结果14-14-2 通过 CsCl-EtBr 梯度离心分带获得。在本实验中，经过 401,700 × g 离心 16 小时后，出现两条明显条带， 即，该 E. coli 染色体DNA位于上方，超螺旋BAC质粒DNA位于下方，两者在长波紫外光下可见于试管中央。最小体积（约400 µl用注射器在管壁侧面穿孔，小心收集下方的BAC DNA条带。随后通过丁醇抽提去除BAC DNA中的溴化乙锭（EtBr），再通过乙醇沉淀浓缩不含溴化乙锭的BAC DNA。
最后一步是测定体外转录合成RNA的特异性感染性 体外 来自全长的SA14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2）在RNA转染入易感细胞后（图4）。此步骤包括三个连续步骤：步骤1，全长SA的线性化；14病毒基因组3'端的-14-2 cDNA（图4A）；第二步，通过加尾转录从线性化cDNA合成RNA（run-off transcription）图4B）；以及第3步，在转染了合成RNA的BHK-21细胞中拯救重组病毒（图4C）。实验中，使用了两种独立的pBAC/SA克隆14-14-2 用...进行线性化处理 Xba I型消化并用MBN处理以去除由 Xba I 消化。线性化的 BAC 通过酚-氯仿抽提纯化，随后进行乙醇沉淀。两种纯化后 BAC 的线性化结果通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳验证。图 5A）。苯酚-氯仿抽提必须小心操作，以确保线性化的BAC不含RNase。两种线性化的BAC分别作为cDNA模板，在SP6 RNA聚合酶作用下进行加帽的体外转录，同时加入m7G(5')ppp(5')A 帽类似物。通过将两个体外转录反应混合物的等分试样与参照的1 kb DNA ladder一同在0.6%琼脂糖凝胶上电泳，验证合成RNA的完整性。图 5B). 在此简易检测中，主要的显著RNA条带始终迁移至3 kb参考DNA条带略下方，且呈现清晰锐利的形态。然而，降解的RNA在同一凝胶上则会呈现弥散模糊的外观。
感染灶检测法是测定合成RNA特异性感染活性的金标准。该检测通过将RNA样本电穿孔转染至BHK-21细胞，随后将等量的10倍系列稀释的电穿孔细胞接种于含 naive BHK-21细胞的6孔板中（3 × 105 细胞/孔），并将琼脂糖覆盖于细胞单层上。孵育4天后，用甲醛固定存活的细胞，并用结晶紫溶液染色，以定量感染中心（空斑）的数量，该数量对应于递送至细胞内的感染性RNA分子数（图 6A）。由于用于的cDNA模板 体外 转录已被证实不具有感染性，27 将转录反应混合物的一部分直接用于电穿孔。电穿孔是RNA转染的首选方法； alternatively，RNA也可通过DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体等其他方法进行转染。RNA电穿孔效率很高，但如果电穿孔反应中存在盐类或电穿孔比色皿被重复使用，则偶尔会发生电脉冲“电弧”现象。通过免疫荧光检测，使用抗NS1兔抗血清检测RNA转染细胞中病毒蛋白的表达图6B). 通过噬斑实验分析了RNA转染细胞上清液中积累的病毒颗粒的产生情况（图6C实验结果明确表明，cDNA衍生的合成RNA在允许性BHK-21细胞中具有感染性，能够产生高滴度的重组病毒。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>寡核苷酸</td>
			<td>序列a（5' 至 3'）</td>
			<td>位置b</td>
			<td>极性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1RT</td>
			<td>TAGGGATCTGGGCGTTTCTG 
			GCAAAT</td>
			<td>2578–2603</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1F</td>
			<td>aatcccgggAGAAGTTTATC 
			TGTGTGAACTT</td>
			<td>1–22</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1R</td>
			<td>attgcggccgcCCACGTCGT 
			TGTGCACGAAGAT</td>
			<td>2532–2553</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2RT</td>
			<td>TTCTGCCTACTCTGCCCCTC 
			CGTTGA</td>
			<td>5975–6000</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2F</td>
			<td>aatcccgggTCAAGCTCAGT 
			GATGTTAACAT</td>
			<td>1800–1821</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2R</td>
			<td>attgcggccgcGATGGGTTT 
			CCGAGGATGACTC</td>
			<td>5929–5950</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3RT</td>
			<td>ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC 
			AGGTCT</td>
			<td>9426–9451</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3F</td>
			<td>aatcccgggGAGGATACATT 
			GCTACCAAGGT</td>
			<td>5500–5521</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3R</td>
			<td>attgcggccgcGTAAGTCAG 
			TTCAATTATGGCT</td>
			<td>9380–9401</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4RT</td>
			<td>AGATCCTGTGTTCTTCCTCA 
			CCACCA</td>
			<td>10952–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4F</td>
			<td>aatcccgggAGTGGAAGGCT 
			CAGGCGTCCAA</td>
			<td>9200–9221</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4R</td>
			<td>attgcggccgcAGATCCTGT 
			GTTCTTCCTCACC</td>
			<td>10956–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6F</td>
			<td>cataccccgcgtattcccac 
			ta</td>
			<td></td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6R</td>
			<td>ACAGATAAACTTCTctatag 
			tgtcccctaaa</td>
			<td>1–14</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1F</td>
			<td>aggggacactatagAGAAGT 
			TTATCTGTGTG</td>
			<td>1–17</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1R</td>
			<td>TGGATCATTGCCCATGGTAA 
			GCTTA</td>
			<td>638–662</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1F</td>
			<td>CGAATGGATCGCACAGTGTG 
			GAGAG</td>
			<td>8403–8427</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X1R</td>
			<td>AAAGCTTCAAACTCAAGATA 
			CCGTGCTCC</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2F</td>
			<td>GGAGCACGGTATCTTGAGTT 
			TGAAGCTTT</td>
			<td>9120–9148</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2R</td>
			<td>cacgtggacgagggcatgcc 
			tgcag</td>
			<td></td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROF</td>
			<td>CCAGGAGGACTGGGTTACCA 
			AAGCC</td>
			<td>10670–10694</td>
			<td>有义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROR</td>
			<td>agggcggccgctctagAGAT 
			CCTGTGTTCTTCCTCACCAC</td>
			<td>10954–10977</td>
			<td>反义链</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">aJEV 序列以大写字母表示，BAC 序列以小写字母表示。 
			b核苷酸位置参考日本脑炎病毒 SA14-14-2 完整基因组序列（GenBank 登录号 JN604986）。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于cDNA合成、PCR扩增和BAC诱变的寡核苷酸。
<img alt="Viral RNA isolation and full-length cDNA assembly diagram, including cDNA synthesis, subcloning, and modification processes." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 日本脑炎病毒SA株全长cDNA构建策略14-14-2 作为 BAC。 (A) 从JEV颗粒中分离病毒RNA。图示为JEV SA基因组RNA的示意图14-14-2. (B) 合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA片段（F1至F4）。C将四个重叠的cDNA片段亚克隆至BAC载体中，构建pBAC/F1至pBAC/F4。D) 克隆 cDNA 的修饰以进行加尾转录 体外pBAC/F1SP6 是 pBAC/F1 的一个衍生物，其在病毒 5' 端上游含有 SP6 启动子序列。pBAC/F3敲除 是 pBAC/F3 的一个衍生物，包含一个同义点突变（A9134→T，星号）。pBAC/F4RO 是 pBAC/F4 的一种衍生物，含有一个人工合成的 Xba 病毒3'端下游的游离片段。E) SA全长的组装14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；按千碱基大小分离的DNA；显示分子量标记物。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 覆盖JEV SA14-14-2全长基因组RNA的四个重叠cDNA片段（F1至F4）的合成。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳对四个RT-PCR产物进行分析。M，1 kb DNA ladder。四个cDNA片段的预期大小已在凝胶图像底部标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氯化铯密度梯度离心分离染色体DNA、BAC DNA和RNA；示意图。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 含有JEV SA14-14-2全长cDNA的BAC的纯化。 采用SDS-碱裂解法从E. coli DH10B中提取BAC质粒，再通过CsCl-EtBr密度梯度离心进行条带收集以进一步纯化。图中展示的是使用16 × 76 mm可密封聚丙烯管进行CsCl-EtBr梯度离心的示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="cDNA linearization and RNA synthesis diagram; virus recovery via RNA transfection; genetic process." src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 从全长JEV SA中恢复感染性病毒的概述14-14-2 cDNA 在 BAC 中组装 (A) cDNA 模板的线性化。全长 JEV BAC 用限制性内切酶切割 Xba 我并用 MBN 处理。 (B) RNA转录物的合成。在m存在的情况下，线性化的cDNA由SP6 RNA聚合酶进行转录7G(5')ppp(5')A 帽类似物。C合成JEV的回收。 体外 将转录的RNA通过电穿孔转染至BHK-21细胞，以产生高滴度的合成病毒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="cDNA 模板和 RNA 转录本的凝胶电泳图；按碱基对大小分离 DNA。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 利用全长 JEV BAC 作为 cDNA 模板，通过体外转录合成 RNA。（A）线性化全长 JEV BAC pBAC/SA14-14-2 的制备。两个独立的 pBAC/SA14-14-2 克隆（Cl.1 和 Cl.2）经 Xba I 酶切并随后用 MBN 处理，实现线性化。通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测线性化的 BAC。(B) 通过截断式转录生成合成 RNA。以上述两种线性化 BAC 分别作为模板，进行 SP6 RNA 聚合酶介导的截断式转录。取两组转录反应的等分试样在 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳分析。M，1 kb DNA 标准分子量标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA感染性与病毒产量分析；病毒研究中的图表、蚀斑及荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 来源于全长JEV BAC的合成RNA的特异性感染性及合成病毒的回收。 对BHK-21细胞进行模拟电穿孔（Mock）或使用来自两个独立全长JEV BAC克隆（Cl.1 和 Cl.2）的RNA转录本进行电穿孔。（A）RNA感染性。转染后4天，细胞覆盖琼脂糖并用结晶紫染色。通过感染中心测定法确定RNA的感染性，以估算电穿孔进入细胞的感染性RNA量（左图）。同时展示感染中心的代表性图像（右图）。（B）蛋白表达。细胞培养于4孔培养板中。在转染后20小时（hpt），通过免疫荧光检测分析RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达，使用一抗为抗NS1兔抗血清，二抗为Cy3标记的 goat anti-rabbit IgG（红色）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染（蓝色）。免疫荧光图像与其对应的微分干涉差图像叠加显示。（C）病毒产量。细胞培养于150 mm培养皿中。通过蚀斑测定法检测RNA电穿孔细胞在转染后22小时和40小时时培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

反向遗传学是一种完全从克隆的cDNA中拯救出具有感染性病毒的技术，该技术已彻底改变了正义链RNA病毒领域的研究，其……

本实验的总体目标是从克隆的互补DNA（cDNA）中拯救出具有感染性的病毒颗粒，这些病毒属于基因组极性与细胞mRNA相同的正链RNA病毒，例如日本脑炎病毒。基于cDNA的反向遗传学技术是一种开创性方法，可直接对病毒基因组RNA进行操作，从而生成重组病毒，用于病毒复制和致病机制的分子与遗传学研究。该技术还提供了一个有价值的平台，可用于开发基因明确的痘苗病毒载体，以递送外源基因。这些方法适用于克隆全长 cDNA，可用于负链或正链 RNA 病毒，尤其是基因组长度超过 10 kb 的病毒。演示该实验流程的人员包括本实验室的数位成员：研究助理尹相一（Sang-Im Yun）、博士后研究员成炳赫（Byung-Hak Song）和金珍京（Jin-Kyoung Kim），以及本科生乔丹·弗兰克（Jordan Frank）。本出版物的视频部分涵盖了包含目的序列的细菌人工染色体的制备、从反向质粒转录合成RNA、RNA感染性的测定以及病毒产量的检测方法。在生成BAC质粒之前的所有操作步骤均在文字版实验方案中进行了详细说明。进行本实验时，首先将含有BAC质粒的E. coli DH10B单菌落接种于3毫升含氯霉素的2X YT液体培养基中。在35摄氏度、225至250 RPM振荡条件下培养10小时。培养10小时后，扩大培养规模。随后将500微升的菌液接种到500毫升培养基中，并在剧烈振荡条件下培养6小时。6小时后，将细菌培养物分装至两个250毫升的瓶子中，在4摄氏度、3,100 ×g条件下离心15分钟。然后将每个沉淀重悬于30毫升GTE溶液中。加入500 µL溶菌酶，将悬浮液在冰上孵育10分钟。在此期间，为下一步准备新鲜的裂解液。10分钟后，加入60 mL裂解液，轻轻旋转混匀，直至溶液变得澄清。将反应液在室温下放置10分钟。接着，向每个瓶子中加入45毫升中和溶液，并反复倒置瓶子直至充分混匀。然后将瓶子置于冰上孵育10分钟。通过高速冷冻离心收集中和后的裂解液，然后将上清液转移至两个新的250毫升瓶中。向每个瓶中加入0.6倍体积的100%异丙醇，并置于冰上静置20分钟。接下来，离心沉淀，弃去上清液，并将沉淀物溶于5毫升TE缓冲液中。将两个样品合并至一个50毫升离心管中，加入等体积的5摩尔氯化锂以沉淀RNA，并将混合物置于冰上孵育10分钟。通过20分钟的低温离心收集RNA沉淀。然后将上清液转移至一个新的250毫升离心管中，加入两倍体积的100%异丙醇，并将离心管置于冰上，以使DNA沉淀析出。20分钟后，离心沉淀，吸除上清液，将DNA沉淀物重悬于9.5毫升TE缓冲液中，并将DNA溶液转移至50毫升离心管中。继续制备过程，使用溴化乙锭建立氯化铯梯度。用带有18号针头的注射器将混合物装入可密封的聚丙烯管中，并密封管子。将密封的管子在超速离心机中离心过夜，以形成氯化铯梯度。第二天，从氯化铯梯度中收集BAC质粒的DNA条带。使用18号针头在梯度顶部穿刺以形成通气孔，用20号针头连接注射器从梯度侧面收集BAC DNA，然后将收集物转移至1.7毫升微量离心管中。进行洗涤操作：加入2.5倍体积的水饱和正丁醇，用普通涡旋振荡混合。然后在室温下离心混合物，并将下层水相转移至新的1.7毫升微量离心管中。重复此洗涤步骤共六次，以彻底去除溴化乙锭。现在沉淀BAC DNA。向管中加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠和2.5倍体积的100%乙醇。将混合物在冰上孵育10分钟。然后在室温下离心以沉淀DNA，并用1毫升70%乙醇洗涤DNA沉淀。重复一次离心并再次收集沉淀。最后，将沉淀的DNA在空气中干燥10分钟，并溶于200微升TE缓冲液中。用 XbaI 限制性内切酶对 BAC 质粒进行大规模酶切消化，总体积为 100 微升。在 37 摄氏度下进行酶切反应，持续 12 至 15 小时。随后，在 30 摄氏度下加入额外的 25 单位绿豆芽核酸酶，继续孵育 2 小时。孵育结束后，用蒸馏水将体积补至 300 微升。随后进行苯酚抽提：向稀释后的样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，剧烈涡旋震荡 1 分钟，离心沉淀后，将上层水相转移至新管中。然后用氯仿重复提取。接着通过乙醇沉淀回收线性化的BAC DNA。离心收集DNA沉淀，弃去上清液，并用1毫升70%乙醇洗涤沉淀。重复离心步骤，然后将沉淀空气干燥。干燥10分钟后，将DNA沉淀溶解于30微升蒸馏水中。然后取1微升回收的BAC样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行检测。接下来，对线性化的BAC DNA进行25微升的截断式转录反应，反应中加入氚标记的UTP用于RNA定量。在37摄氏度条件下反应1小时，然后取1至2微升转录产物在0.6%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。将BHK-21细胞以每皿300万个细胞的密度接种于150毫米培养皿中，培养24小时。用预冷的A溶液冲洗细胞单层，然后通过胰蛋白酶消化法使细胞脱落。以270 ×g离心2分钟收集细胞。然后将细胞重悬于50毫升预冷的溶液A中，并再次离心沉淀。此洗涤步骤重复进行三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于溶液A中，浓度为每毫升2000万个细胞。随后，在一个2毫米比色皿中，取400微升细胞悬液与2微克合成RNA混合。立即在最佳条件下对混合物进行电穿孔，并让细胞静置10分钟。然后将细胞转移至含有600 µL完全培养基的微量离心管中。现在用1 mL体积对电穿孔后的细胞进行十倍系列稀释。取每种稀释液100 µL接种于正常BHK21细胞的单层上。孵育4至6小时后，用含FBS的MEM培养基配制的0.5%琼脂糖覆盖细胞，并继续培养4天。将BHK21细胞进行空载电穿孔处理或使用来自两个独立克隆的全长JEV-BAC的RNA转录本进行电穿孔。四天后，用结晶紫对细胞染色以观察细胞内的感染性RNA。通过该染色方法对感染灶进行定量。接着，在转染后20小时，利用抗NS1兔抗血清和Cy3标记的二抗（呈红色）检测RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达。细胞核用DAPI复染，呈蓝色。随后在转染后22小时和40小时，通过蚀斑实验检测RNA电穿孔细胞培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产生情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何从克隆的正链RNA病毒（如日本脑炎病毒）的cDNA中完全拯救出具有感染性的病毒。请务必注意，操作日本脑炎病毒及其他人类病原体可能具有极高的危险性，因此在进行此类实验操作前，必须接受适当的生物安全培训。

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

细菌人工染色体：对于正链RNA病毒研究的功能基因组学工具

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。...

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

来源：Yun, S. et al. 细菌人工染色体：正链RNA病毒研究的功能基因组学工具。J. Vis. Exp.

从转染细菌人工染色体衍生合成RNA的细胞中拯救感染性病毒颗粒

本文介绍了一种鉴定具有双链DNA基因组植物病毒的新方法。我们采用标准方法从感染的叶片中提取DNA和RNA，并进行高通量测序。生物信息学工具将测序结果组装成重叠群，识别代表病毒基因组的重叠群，并将这些基因组归类到相应的分类群中。...

结合粗提病毒颗粒中的DNA分析与感病叶片中的RNA分析以发现新病毒基因组

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。...

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。...

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

寨卡病毒最近的流行凸显了建立反向遗传学方法以开发疫苗和/或治疗策略的重要性。本文中，我们描述了从一个全长cDNA克隆中拯救出具有感染性的重组寨卡病毒的实验方案，该克隆构建于细菌人工染色体中，并由人巨细胞病毒即刻早期启动子驱动。...

从细菌人工染色体cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒

为深入分析呼吸道合胞病毒（RSV）RNA合成的分子机制，我们报告了一种利用分子伴侣磷酸化蛋白（P）共表达无RNA的核蛋白（N）的实验方案0用于后续 体外...

呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10...

利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

本文介绍了一种通过在插入片段的3'端引入合适的限制性酶切位点，获得pVAX1-PRRSV表达载体的实验方案。我们可将载体线性化，并通过同源重组技术将DNA片段逐个连接至该载体。...

一种无缝克隆方法用于构建猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体

我们描述了一种从环境病毒群落中有效分离单链DNA、双链DNA和RNA分子的方法。该方法利用含磷酸盐缓冲液浓度递增的羟基磷灰石色谱对核酸进行分级分离。此方法可实现从环境样品中分离出所有类型的病毒核酸。...

利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

学习利用细菌人工染色体构建日本脑炎病毒全长cDNA克隆，通过体外转录和电穿孔技术拯救感染性病毒颗粒。该方法为研究正链RNA病毒复制机制、致病机理及开发基因工程疫苗提供了重要的功能基因组学工具。

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

探索更多视频