细菌人工染色体:对于正链RNA病毒研究的功能基因组学工具
2015年12月29日
这里提出了一种用于创建感染性细菌人工染色体的方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组 RNA 的全长 cDNA。该方案可用于构建其他正链 RNA 病毒的功能性 cDNA，使其成为研究病毒生物学的强大基因组工具。
该程序的总体目标是挽救完全由阳性链克隆 CDNA 制成的传染性病毒颗粒，这些病毒的基因组与细胞 Mr.NA 极性相同，例如日本脑炎病毒。这种基于 CNA 的再基因遗传学是一种能够直接作病毒基因组 RNA 的半遗传方法，从而产生用于病毒复制和发病机制的分子和遗传研究的重组病毒。该技术还提供了一个有价值的平台，允许开发用于递送外源基因的基因定义的疫苗和病毒载体。
这些容器适用于克隆长度或阳性菌株的全长 CDNA、RNA 病毒，尤其是基因组大于 10 kb 的病毒。演示该程序的是我的实验室研究助理 San Nun 教授、博士后研究员 UNG 和 Xing y Kim 以及本科生 Jordan Frank。本出版物的视频部分涵盖了包含目标序列的细菌人工染色体的制备、从背质粒转录的 RNA 的合成，以及如何测量 RNA 的感染性和病毒产量。
文本方案中详细提供了生成背质粒之前使用的所有程序。对于此程序，首先培养一个大肠杆菌 DH 10 B 的单个菌落，在 3 毫升含氯霉素的两个 XYT 肉汤中携带背质粒。将培养物在 35 摄氏度下孵育 10 小时，并以 225 至 250 RPM 的速度振荡。
10 小时后，扩大培养物规模，然后将 500 微升生长物接种到 500 毫升培养基中，并在 6 小时后剧烈摇动培养接种物 6 小时。将细菌培养物放入 2 250 毫升瓶中，在 4 摄氏度下以 3， 100 G 离心 15 分钟。然后将每个沉淀重悬于 30 毫升 GTE 溶液中。
加入 500 μL 溶菌酶，将悬浮液在冰上孵育 10 分钟。同时，为下一步准备新鲜的裂解溶液。10 分钟后，加入 60 mL 裂解液，涡旋混合，直到溶液呈澄清状态。
让反应在室温下放置 10 分钟。接下来，向每个瓶子中加入 45 毫升中和溶液，并将瓶子倒置直至完全混合。然后将它们放在冰上 10 分钟。
用高 G 制冷离心收集中和的裂解物。然后将上清液收集到两个新的 250 毫升瓶子中。向每个样品中加入 0.6 体积的 100% 异丙醇，然后将它们放在冰上 20 分钟。
接下来，旋转沉淀物，然后弃去上清液，将沉淀溶解在 5 毫升 TE 缓冲液中。将两种体积混合在一个 50 mL 试管中，加入等体积的 5 摩尔氯化锂，并在冰上孵育混合物 10 分钟，沉淀 RNA。使用 20 分钟的冷离心收集 RNA 沉淀物。
然后将上清液转移到新的 250 mL 试管中。加入两倍体积的 100% 异丙醇，将试管置于冰上，以便形成 DNA 沉淀。20 分钟后，离心沉淀物，吸出上清液，将 DNA 沉淀重悬于 9.5 mL TE 缓冲液中，然后将 DNA 溶液转移至 50 mL 试管中。
通过用 th 溴化物设置氯化铯梯度来继续制备。使用带有 18 号针头的注射器将混合物装入可密封的聚丙烯管中，然后密封管。将密封管在超速离心机中旋转过夜，以形成氯化铯梯度。
第二天，从氯化铯梯度中收集背质粒的 DNA 条带。使用 18 号针头在梯度顶部形成一个通风口，使用带注射器的 20 号针头从梯度侧面收集背面的 DNA，然后将收集物转移到 1.7 mL 微量离心管中。进行洗涤，加入 2.5 体积的水饱和丁醇，并与正常涡旋混合。
然后在室温下离心混合物，并将下层水相转移到新的 1.7 ml 微量离心管中。重复此洗涤总共六次以去除所有溴化乙锭。现在沉淀 back DNA。
向试管中加入 1/10 体积的 3 摩尔乙酸钠和 2.5 体积的 100% 乙醇。将混合物在冰上孵育 10 分钟。然后在室温下离心沉淀物，并用 1 毫升 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。
重复旋转并再次收集颗粒。最后，将沉淀的 DNA 风干 10 分钟，然后放入 200 μL TE 缓冲液中。首先用 xbo 对背质粒进行大规模限制性内切酶消化。
100 微升总体积中 1 个。在 37 摄氏度下进行 12 至 15 小时的消化。接下来，将消化物与另外 25 个单位的绿豆核酸酶在 30 摄氏度下进一步孵育 2 小时。
孵育后，用蒸馏水将体积调至 300 μL。现在通过向稀释的样品中加入等体积的苯酚氯仿、异戊醇来进行苯酚提取。剧烈涡旋一分钟，沿试管旋转并将上层水相转移到新试管中。
然后用氯仿重复提取。接下来，通过乙醇沉淀回收线性化的 DNA 背 DNA。离心收集 DNA 沉淀，弃去上清液，用 1 毫升 70% 乙醇洗涤沉淀。
重复离心步骤并风干沉淀。干燥 10 分钟后，将 DNA 沉淀溶解在 30 μL 蒸馏水中。然后在 0.8%AROS 凝胶上检查一微升回收的回传。
接下来，设置线性化背 DNA 的 25 μL 径流转录，包括用于 RNA 定量的氚化 UTP。在 37 摄氏度下进行反应 1 小时。然后在 0.6% AROS 凝胶上检查一两微升的径流转录反应。
首先，将BHK 21 细胞在 150 毫米培养皿中生长 24 小时，每个培养皿放置 300 万个细胞。用冷溶液 A 冲洗细胞单层，然后用胰蛋白酶分离它们。化。通过在 270 GS 下离心 2 分钟来收集细胞。
然后将细胞重悬于 50 mL 冷溶液 A 中，并再次离心。最后一次洗涤后重复此洗涤 3 次。在溶液 A 中以每毫升 2000 万个的浓度重悬细胞，然后将 400 微升等分试样的细胞悬液与 2 微克合成 RNA 混合在一个 2 毫米的 vet 中。
在最佳条件下立即电纯化混合物，让细胞静置 10 分钟。然后将细胞转移到含有 600 μL 完全培养基的微量离心管中。现在在 1 毫升体积的板中制备电穿孔细胞的 10 倍连续稀释液，孵育 4 至 6 小时后，将每种稀释液的 100 微升等分试样放在正常 bhk 21 细胞的单层上，用 0.5%aros 的 MEM 和 FBS 覆盖细胞，并再培养 4 天。
对 Bhk 21 细胞进行模拟电穿孔或电穿孔，用来自两个全长 JEV 独立克隆的 RNA 转录本进行电穿孔 4 天后，用结晶紫对细胞进行染色，以查看细胞中的感染性 RNA。使用这种染色剂，对感染中心进行量化。接下来，在转染后 20 小时使用抗 NS、一种兔抗血清和一种红色的 SI 三偶联二抗检测 RNA 电穿孔细胞中的病毒蛋白表达。
细胞核用蓝色 DAPI 复染。转染后 22 小时和 40 小时，传染性变异的产生在培养物中积累。通过噬菌斑测定检查 RNA 电穿孔细胞的上清液。
看完这个视频后，你应该对如何完全从阳性菌株 RNA 的克隆 CNA 中拯救传染性病毒有一个很好的了解，比如日本脑炎病毒。因此，不要忘记，与日本脑炎病毒和其他人类病原体打交道可能非常危险。在执行此程序之前，必须进行适当的生物安全培训。
概述
本文介绍了一种创建含有日本脑炎病毒（JEV）全长cDNA的感染性细菌人工染色体（BAC）的协议。该方法可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，作为研究病毒生物学的有价值的基因组工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 分子生物学
- 基因工程
背景
- 正链RNA病毒的基因组与细胞mRNA相似。
- 克隆全长cDNA对于研究病毒复制和发病机制至关重要。
- 可以为各种研究应用生成重组病毒。
- 该协议可以适用于其他大基因组的RNA病毒。
研究目的
- 开发从克隆cDNA中恢复感染性病毒粒子的方法。
- 提供创建基因定义疫苗的平台。
- 促进病毒遗传学和分子机制的研究。
使用的方法
- 含有病毒序列的细菌人工染色体的制备。
- 从BAC质粒转录RNA。
- 测量RNA的感染性和病毒产量。
- 细菌培养、裂解和RNA提取的详细协议。
主要结果
- 成功从克隆cDNA中生成感染性病毒粒子。
- 通过实验室实验证明该协议的有效性。
- 在疫苗开发和基因递送方面的潜在应用。
- 详细的方法使其他实验室能够重复。
结论
- 该协议为研究正链RNA病毒提供了一个强大的工具。
- 它为病毒发病机制和疫苗开发研究开辟了途径。
- 未来的研究可以利用这种方法研究各种RNA病毒。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cloning full-length cDNA of positive-strand RNA viruses into bacterial artificial chromosomes (BACs) addresses genome instability, enabling stable propagation of large viral genomes (>10 kb) for recombinant virus rescue. This approach provides a genetically defined platform for studying viral replication, pathogenesis, and vaccine development, reducing mechanistic uncertainty in early-stage antiviral and vaccine discovery programs. The method supports target validation and lead identification by generating infectious virus from defined genetic constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct manipulation of viral genomic RNA to interrogate therapeutic hypotheses and clarify pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Provides a stable genetic system for functional target validation, reducing false positives from plasmid instability.
- Predictive Value: Supports predictive confidence in target de-risking by generating recombinant viruses with defined genotypes for phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized infectious virus stocks for quantitative assay development and compound screening.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility of viral stocks, critical for reliable dose-response measurements in antiviral screening.
- Scalability: Facilitates preparation of large-scale virus stocks from BAC DNA for high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains genetic fidelity from discovery through preclinical evaluation, supporting biomarker alignment and mechanism-of-action studies.
- De-risking: Reduces biological variability in efficacy and safety assessments by using isogenic virus stocks derived from BACs.
- Continuity: Enables seamless transition from mechanistic studies to vaccine candidate evaluation using the same genetic backbone.
Pipeline & Workflow Integration
The BAC-based reverse genetics workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical candidate evaluation, providing a reproducible source of infectious virus for downstream applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise genetic modifications to viral genomes.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable virus stocks for antiviral compound screening and resistance profiling.
- Analytics: Generates measurable outputs such as virus yield, plaque formation, and protein expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to phenotypic outcomes in preclinical models through consistent virus production.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying multiple positive-strand RNA viruses, maximizing ROI on genetic engineering investments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by eliminating confounding effects from unstable viral clones.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of virus production across teams and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by reducing late-stage failures due to uncharacterized viral heterogeneity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on mechanism-defined viral models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial culture, and RNA virology.
- Depends on access to ultracentrifugation, electrophoresis, and electroporation equipment.
- Necessitates standardization of BAC preparation and virus recovery protocols across laboratories.
- Involves biosafety containment (BSL-3 for JEV) and specialized training for handling positive-strand RNA viruses.
- Limited by the efficiency of in vitro RNA transcription and electroporation for virus recovery, which may vary by virus strain.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Summary of Procedures in Video Format
1:51
High-purity Maxi-prep of Full-length SA14-14-2 BAC: Part 1
4:54
High-purity Maxi-prep of Full-length SA14-14-2 BAC: Part 2
6:48
Transcribe Synthetic RNAs In Vitro from a Linearized Full-length JEV BAC DNA
8:55
Determine RNA Infectivity and Virus Yield
10:36
Results: Specific Infectivity of the Synthetic RNAs Transcribed from a Full-length JEV BAC and the Recovery of Synthetic Virus
11:40
Conclusion
