快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征

本实验的总体目标是对经多聚甲醛固定的脑组织进行快速的原位杂交。该过程首先对脑组织切片进行脱水处理，并依次使用预处理试剂一、二和三进行处理。第二步是将切片与初级寡核苷酸探针杂交，随后依次与第二、第三和第四探针杂交。

接下来，加入快红底物以检测目标 RNA。最后一步是使用 Image J 软件对 mRNA 信号水平进行定量。最终，通过比较实验组和对照组，可获得 RNA 基因表达的变化情况。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于操作相对简单、成本低廉、可重复性好，且完成时间少于两天。本研究由我本人以及来自罗斯大学兽医学院的 John Jay Lenan，和来自佛罗里达大西洋大学医学院的 Jean Soza 与 RU Tao 共同完成。在本实验步骤中，从存放在负80摄氏度冰箱中的显微镜载玻片盒内取出四张载玻片进行后续脱水处理。

将切片分配至P-P-I-B-D-A-P-B和HT双A基因检测，并用圆珠笔进行标记。接着，将载玻片浸入室温的100%酒精中处理5分钟。然后在通风橱中干燥5分钟，进行预处理：每张切片上用移液器加入20 µL预处理试剂一，将载玻片置于湿盒内的支架轨道上。

将湿盒在水平摇床上以低速轻轻振荡10分钟。然后用双蒸水洗涤载玻片两次，每次两分钟。将载玻片浸入含有450毫升预处理试剂二的1000毫升烧杯中。

接着，将载玻片在100摄氏度下煮沸总共5分钟，以恢复RNA结构。随后，用双蒸水洗涤载玻片两次，每次2分钟。将载玻片置于100%酒精中5分钟。

然后将载玻片干燥五分钟。在通风橱中，使用疏水性笔在组织切片的选定区域周围画一个圆圈。随后，用移液器向每个选定区域加入10 µL的预处理试剂三，以增强探针的渗透性，并用盖子盖住保湿盒。

接下来，将托盘放入配备水平摇床的杂交炉中。将炉温设置为40摄氏度，轻轻振荡托盘30分钟。随后，用双蒸水洗涤载玻片两次，每次两分钟。在此步骤中，用移液器在选定区域各加入10微升P-P-I-B-D-A-P-B或HTR two A探针。

然后用盖子盖住保湿盘，以防止试剂蒸发。将玻片置于水平摇床中，于40摄氏度的烘箱内孵育2小时，同时以低速轻轻振荡。接着，用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟，再用移液器在每个选定区域加入10 µL的扩增试剂一。

将玻片在40摄氏度下振荡孵育30分钟。随后用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次两分钟。在每个选定区域加入10 µL扩增试剂二，于40摄氏度下振荡孵育15分钟。

随后，用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。每次洗涤后，在每个选定区域滴加10 µL的扩增试剂三。振荡并置于40 °C孵育30分钟。

然后用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。在每个选定区域加入10 µL的扩增试剂4。轻轻振荡，并在40 °C下孵育载玻片15分钟。

接着，用洗涤缓冲液将载玻片洗涤两次，每次两分钟。在每个选定区域加入10微升扩增试剂5，轻轻振荡后于室温孵育30分钟。

随后，用洗涤缓冲液将切片洗涤两次，每次两分钟。在每个选定区域加入10微升的扩增试剂六。轻轻振荡，并于室温下孵育切片15分钟。

然后用洗涤缓冲液再次清洗载玻片，每次两分钟，共洗两次。现在向每个选定区域加入10 µL红色试剂，将载玻片放入水平摇床上的湿盒中，在室温下低速轻轻振荡10分钟。随后用双蒸水清洗载玻片两次，每次10分钟。

每次在烘箱中以 60 摄氏度干燥载玻片 15 分钟。随后，将载玻片置于通风橱内的二甲苯中 5 分钟。接下来，用移液器吸取 20 微升基于二甲苯的封片介质滴加至每个选定区域，并加盖盖玻片。

在此步骤中，将图像文件拖放到主图像 J 窗口中。转到菜单栏并选择图像。然后从下拉菜单中选择类型，并选择八位。

接下来，选择“调整”，然后选择“阈值”以打开对话框。在对话框中调节下限滑块的数值，以去除不需要的背景。转到菜单栏，选择“分析”，然后选择“分析颗粒”以打开第二个对话框。

将粒子大小设置为10。接着，选择显示轮廓，并勾选显示结果和汇总框。最后，单击确定，在对话框中查看粒子数据。

进行电子表格计算时，将数据输入 Excel 工作表，并计算生理盐水组颗粒数的平均值作为基线。然后计算每个区段的百分比水平，并据此绘制图表。以下是红色点状标记所示杂交信号的光学显微镜图像。

使用生理盐水和 MDMA 预处理的深度麻醉大鼠，以多聚甲醛对组织进行预固定。所用的寡核苷酸探针为 D-A-P-B-P-P-I-B 和 HT2A。该图显示了 MDMA 预处理后对大鼠下丘脑 HT2A 基因表达的影响，观察到 HT2A 表达减少了 20%。该技术通过在多聚甲醛预固定的脑组织上进行原位杂交，使神经科学领域的研究人员能够更便捷地检测信使 RNA 的基因表达。