的内肌浆网钙光学标测 2+和的Langendorff灌注兔心脏跨膜电位
2015年9月10日
本文介绍了详细的协议和必要的跨膜电位（V M）双光学测绘和免费内部肌浆网（SR）设备钙在的Langendorff灌注兔心脏。此方法允许直接观察和第V 米量化和SR 的 Ca 2+动力学在完整心脏。
该程序的总体目标是同时光学映射完整离体 LOR 灌注兔心脏中的游离肌浆内网、钙和跨膜电位。这是通过首先切除兔子心脏并插管主动脉以进行逆行肌突灌注来实现的。第二步是通过在 perfu 8 上添加激发收缩解耦来消除收缩。
接下来，将灌注切换到小体积再循环环，并在室温下加入低亲和力钙指示剂。最后的步骤是使用大容量 profusion 定量环将心脏加热至 37 摄氏度，并添加电压敏感染料。因此，在实验过程中，通过用蓝光激发心脏并使用高速 CM OS 相机测量发射光来测量钙和跨膜电位的变化。
与现有方法相比，该技术的主要优点是它允许研究人员直接探测肌浆网或 SR 以获得短钙动力学，而不会受到跨膜钙信号的干扰。这种方法还可以帮助回答与 SR 钙处理在导致心律失常中的作用相关的关键问题，因为跨膜电位与 SR 钙同时记录，通常刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为光学 SR 钙信号的振幅非常低。因此，钙指示剂的适当加载对于此协议至关重要，手头有必要有新鲜制备的 tyro 溶液。
四升就足够了。不要混合未经稀释的浓缩储备液。还要按照文本方案中的指示提前准备其他溶液，用 95% 氧气和 5% 二氧化碳鼓泡 tyros 的供应，并调整气体流量，使溶液的 pH 值非常接近 7.4。
溶液应在室温下。放置一个带有 11 微米孔的在线尼龙过滤器来过滤灌注液，以制备再循环的 L andorf 灌注系统。现在用大约两升含氧 tyros 灌注主 profusion 系统。
2 升总体积包括储液槽中的溶液。接下来，准备并灌注一条绕过溶液储液罐的短 profusion 线，以便为流感 oh five N am 创建一个小体积再循环 profusion 回路。在较小的再循环系统中下载总体积应约为 150 毫升。
要准备压力监测系统，请将压力传感器连接到大量管路，并将传感器的输出连接到跨桥放大器。现在打开数据采集系统。将其设置为持续监测 ECG 和充血压。
接下来，将基线灌注压力调整为零毫米汞柱。最后，按照文本协议中的说明对齐光学映射相机。首先固定兔子并用戊巴比妥以及 1000 单位推注肝素对其进行麻醉。
遮住眼睛，让兔子平静下来。从中线切口开始，使用钝头剪刀露出胸骨和肋骨。切开剑突和睑板之间的胸骨。
接下来，小心地打开胸骨，不要损坏心脏，并张开肋骨以露出心脏。然后通过切掉周围的所有血管和组织来快速去除整个心肺阻滞。将心肺阻滞剂转移到约 100 毫升冰冷的 tyro 溶液中。
在切除的组织块中，找到主动脉并切开主动脉弓三个分支的近端升主动脉。然后用连接到增流系统的 8 号套管插管主动脉。用一根 USP 零丝缝合线将主动脉固定到套管上。
固定套管后，小心解剖气管、肺和心外膜脂肪。接下来，确定二尖瓣，并小心地使用锋利的镊子和剪刀损坏或去除一个瓣叶。因此，左心室溶液充血不会发生。
继续将心脏水平浸入灌注室中，正面朝上。将套管放在一块沙子上。用 U 形针穿过 sard 片并插入灌注皿的硅底部固定
套管。这将阻止心脏移动。在成像过程中，如果需要，可以使用一个小昆虫针来稳定根尖，测量插管过程中使用的 tyro 溶液的量，并用新鲜溶液代替，以保持总循环溶液为 2 升。现在将 ECG 电极完全浸入心脏两侧的浴槽中，但不与心脏接触。
然后验证这是否使正常的导联 1 心电图形态。同时，通过将灌注流量调整在每分钟 25 至 35 毫升之间，将主动脉压保持在 60 至 70 毫米汞柱。现在，关掉房间的灯，向 PERFU 8 中加入 0.3 至 0.6 毫升 BLEs 他汀类药物储备液，最终浓度为 10 至 20 微摩尔。
10 到 15 分钟后，心脏收缩应该停止。然后切换到小容量 Profusion 系统。SR 钙成像成功的关键之一是正确加载流式 5 N am 染料。
这需要小体积灌流以实现高染料浓度和室温条件。为避免胞质溶胶中 D 的 D 酯化，现在准备 500 微升流感 O 5 N am 加载溶液，并将其与 500 微升道路溶液混合。然后将其添加到 PERFU 8 中。
让下载继续进行 45 分钟，然后打开循环水浴将系统加热到 37 摄氏度。下载一个小时后，切换回更大的 Perfu eight 卷。接下来，将 50 微升电压敏感染料 RH 2 37 混合到一毫升温热的 tyros 中。
在大约 5 分钟内慢慢将其注入系统，然后进行心脏的光学标测。首先，将光学映射相机聚焦在适当的区域上，以减少 PERFU 8 表面上的运动。在溶液上漂浮盖玻片。
现在调整 LED 光束，为心脏提供均匀的照明。对于每个光纤记录，请设置所需的起搏协议。打开激发灯，在 1 到 2 小时内收集 1 到 4 秒的数据。
泄漏染料产生的噪音将结束实验。然后用去离子水冲洗系统。然后加入 70% 乙醇，最后用去离子水再次冲洗。
使用所描述的方案，可以分离跨膜电位信号和肌浆网或 SR 钙信号的光谱分离。还记录了连续起搏期间的光学轨迹。然后通过绘制每个像素的激活时间，从数据中构建激活图。
在等时图上，两个信号之间通常存在 8 到 10 毫秒的延迟。可以量化舒张压 SR 的相对变化。不同起搏周期的钙负荷和收缩 SR 钙释放振幅。在应用 β 肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素后观察到病理性 SR 钙处理。
红色箭头指出 sr 有明显的钙泄漏。在这些条件下，可以发生钙介导的动作电位触发。观看此视频后，您应该对如何在完整的 Lang Endorf 灌注兔心脏中同时进行跨膜电位和 SR 钙信号的光学映射有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种在离体兔心Langendorff灌注模型中对跨膜电位和肌浆网内游离钙离子进行双光学标测的实验方案。该方法可实现对完整心脏中上述动态过程的直接观察与定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 心血管生理学
- 光学成像技术
背景
- 理解心脏动力学对于研究心脏功能至关重要。
- 跨膜电位和钙离子水平是心脏健康的关键指标。
- 光学标测技术为研究这些参数提供了一种无创方法。
- 朗根多夫灌流技术可实现离体心脏研究。
研究目的
- 开发一种同时光学标测膜电位（V m）和肌浆网钙离子（SR Ca 2+）的方法
- 为了增进对心脏电生理学的理解。
- 为该领域的研究人员提供详细的实验方案。
使用的方法
- 切除兔心脏并插管主动脉以进行逆向灌注。
- 使用兴奋-收缩解偶联剂以消除心肌收缩。
- 切换至带有低亲和力钙指示剂的循环灌注系统。
- 加温心脏并加入电压敏感性染料以进行光学标测。
主要结果
- 成功实现了膜电位（V m）与肌浆网钙离子（SR Ca 2+）动态的同步测量。
- 验证了光学标测技术的有效性。
- 揭示了钙离子与跨膜电位之间的关系。
- 建立了一套可靠的实验方案，可供后续研究使用。
结论
- 双光学标测技术在研究心脏动力学方面具有显著效果。
- 该方法可推动心脏生理学领域的研究进展。
- 未来应用可能包括对心脏疾病的研究。
常见问题
行业高管相关性
该方法能够在完整的心脏组织中直接、同时测量肌浆网内钙离子浓度和跨膜电位，为兴奋-收缩耦联及致心律失常基质提供机制性见解。通过在生理相关模型中解析肌浆网Ca2+调控的空间和时间动态，该技术可支持心血管药物研发中的靶点验证和风险降低。该方法连接了分子机制与组织水平的表型，提高了临床前安全性与有效性评估的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化病理生理应激（如β-肾上腺素能刺激）条件下肌浆网Ca2+的负荷与释放动力学，验证治疗假设。
- 操作价值：可对钙处理相关靶点进行功能验证，减少早期靶点筛选中的机制不确定性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：构建经过验证的双读出生物系统，用于评估化合物对电生理学和钙稳态的双重影响。
- 操作价值：通过同时监测膜电位（Vm）和肌浆网钙离子（SR Ca2+），支持检测方法的标准化，提高离子通道和钙调节剂筛选的可重复性。
转化与临床前研究
- 科学价值：将分子水平的扰动与组织水平的心律失常表型相联系，从而实现面向转化生物标志物匹配的疾病相关系统建模。
- 操作价值：通过在临床前评估早期识别致心律失常信号，促进基于风险调整的研发推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物优化，再到临床前安全性评价的整个发现流程，尤其适用于作用于心脏离子通道或钙调节蛋白的化合物。
- 发现生物学：通过揭示在起搏和药物干预条件下膜电位（Vm）与肌浆网钙离子（SR Ca2+）之间的双向关系，支持假设验证和信号通路的阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的标准化定量输出结果，允许以统一格式将待测化合物与对照条件进行比较。
- 分析：提供高分辨率的钙瞬变和动作电位动态的时空测量数据，支持不同实验组之间的比较分析。
- 转化研究：通过模拟疾病状态下观察到的致心律失常基质，将研究发现与临床前研究的连续性相连接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于多个项目中的心脏安全药理学研究及作用机制研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接观察肌浆网钙离子（Ca2+）处理及其电生理后果，实现对靶点验证的预测性信心。
- 操作价值：在受控的Langendorff灌注系统中，通过双参数光学标测实现标准化与可重复性。
- 战略价值：在昂贵的后期失败发生前，检测钙介导的致心律失常触发因素，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：根据化合物对肌浆网钙稳定性和跨膜稳定性的影响，进行风险调整后的化合物优先级排序。
实施注意事项
- 成功获取信号需要具备光学标测、灌注技术以及荧光染料操作方面的专业知识。
- 所需仪器包括高速CMOS相机、LED激发系统，以及能够实现循环灌流和大容量灌流模式的灌注装置。
- 跨团队标准化依赖于各实验室之间染料负载、温度控制和起搏方案的一致性。
- 若将该技术应用于其他模型系统（例如大鼠、人类组织），可能需要优化指示剂浓度和灌注参数。
- 实际限制因素包括肌浆网钙指示剂信号幅度较低，因此需要精确控制染料负载并尽量减少胞质干扰。
