肺肿瘤细胞募集实验
2019年2月26日
本论文描述了一种在肿瘤转移动物模型中定量肺部肿瘤细胞聚集的方法。
该方法有助于解答肿瘤生物学领域中关于转移分子机制的关键问题。此技术的主要优势在于能够定量分析肿瘤细胞在远端器官中的募集情况。首先，使用非酶解细胞解离试剂，按照标准操作流程从培养容器中分离表达荧光蛋白的路易斯肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）细胞。
将所得细胞悬液转移至15毫升锥形管中，离心后用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀物，共洗涤两次。第二次洗涤后，通过40微米孔径的细胞筛过滤细胞，并将细胞悬液稀释至浓度为1×10⁶个细胞/毫升。然后将细胞悬液加入配有29号针头的1毫升注射器中，向每只8至10周龄的C57-Black-6雄性小鼠尾静脉注射100微升细胞悬液。
在适当的实验终点，使用剪刀去除每只小鼠腹侧的皮肤，并剪开肋骨和膈肌以暴露胸腔。使用25号带翼输液针和管路，经右心室灌注15毫升PBS进行冲洗，随后取出心脏和胸腺。用镊子夹住气管并轻轻上提，分离气管周围的结缔组织，以完整取出肺组织。
然后用 PBS 清洗肺组织，并取一个肺叶用于在荧光显微镜下原位观察荧光标记的细胞。为了消化肺组织，首先用剪刀将尾叶剪碎，将肺组织碎片放入一个 10 毫升注射器中。用活塞封闭注射器，吸入 5 毫升消化液，反复推动和抽拉活塞，使肺组织在溶液中充分分散。
将肺组织匀浆液分装至50毫升离心管中，在37摄氏度、150 rpm条件下于往复摇床中消化组织15分钟。孵育结束后，反复吹打剩余组织，直至肺细胞完全分散，再将离心管放回摇床继续振荡30分钟。随后通过40微米孔径滤网过滤细胞，并通过离心收集细胞。
为了通过流式细胞术分析分离的肺细胞，将细胞沉淀在室温下重悬于两毫升红细胞裂解缓冲液中孵育一分钟，然后通过离心收集细胞。随后，每次用五毫升新鲜添加1%牛血清白蛋白的PBS洗涤，共离心洗涤两次。第二次离心后，将细胞沉淀重悬于一毫升含BSA的新鲜PBS中，并通过一个新的40微米孔径滤网过滤，以进行流式细胞术对肿瘤细胞的定量分析。
注射后2小时，肺部出现大量GFP-LLC细胞，但绝大多数细胞在24小时内从肺部消失。请注意，任何在红色滤光片下检测到的荧光点均应从细胞计数中排除。为确认肺部GFP-LLC细胞的数量，可取其中一个肺叶进行流式细胞术分析，如图所示。
在进行此操作时，重要的是要记住，冰冻切片法是观察肿瘤细胞确切位置的更准确方法。
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概述
本手稿描述了一种在肿瘤转移动物模型中定量肺部肿瘤细胞聚集的方法。该技术可实现对远端器官内肿瘤细胞归巢的定量分析，有助于揭示转移的分子机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 了解肿瘤转移对癌症研究至关重要。
- 定量分析肿瘤细胞的聚集可揭示重要的生物学信息。
- 在研究癌症进展过程中，常使用动物模型。
- 表达荧光蛋白的细胞有助于追踪和定量分析。
研究目的
- 建立一种定量分析肿瘤细胞在肺部聚集的方法。
- 研究转移模型中肿瘤细胞的募集过程。
- 加深对转移发生分子机制的理解。
使用的方法
- 使用非酶解细胞解离试剂。
- 在 PBS 中离心并洗涤细胞沉淀。
- 通过 40 微米孔径的细胞筛过滤细胞。
- 将稀释后的细胞悬液注射到小鼠尾静脉中。
主要结果
- 该方法可有效量化肿瘤细胞的聚集。
- 证明了在活体中追踪肿瘤细胞的可行性。
- 揭示了肿瘤细胞募集的动力学特征。
- 有助于深入理解转移过程的机制。
结论
- 该方法是研究肿瘤生物学的有力工具。
- 它增强了在动物模型中研究转移的能力。
- 未来的研究可在此技术基础上进一步探索治疗靶点。
常见问题
行业重要性概述
该检测方法可实现对肿瘤细胞向远端器官迁移的定量评估，有助于在靶向转移瘤药物研发中进行作用机制的去风险化分析。该方法通过绕过原发性肿瘤侵袭步骤，聚焦于间质相互作用及血管外渗等关键过程，从而支持临床前靶点验证。该技术可提供可重复且可放大的检测读数，用于在体内评估抗转移化合物的效果。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：探究基质在远端器官转移过程中对治疗假设的影响。
- 操作价值：通过量化注射后肺部肿瘤细胞的聚集情况，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过测量化合物对肿瘤细胞募集动态的影响，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过流式细胞术产生标准化的定量输出，用于化合物筛选实验。
- 可重复性：采用确定的细胞浓度和注射体积，以确保转移建模的一致性。
- 可扩展性：兼容多孔板处理和高内涵分析，适用于靶点风险评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性： 建立肺微转移模型，用于研究器官特异性定植机制。
- 转化连续性： 将发现阶段的研究结果与抗转移药物的临床前验证相衔接。
- 风险调整决策： 基于标记肿瘤细胞数量的减少情况，为“继续”或“终止”决策提供依据。
流程与工作流整合
从靶点假设验证到先导化合物优化的发现连续体中的各个阶段，可实现对调节转移的化合物进行定量评估。
- 发现生物学：支持对转移微环境中肿瘤-基质相互作用的机制性研究。
- 筛选：通过基于荧光的定量读数，实现转移实验中候选分子的有效性验证。
- 分析：利用流式细胞术生成可计数的肿瘤细胞数据，用于剂量-反应及统计学分析。
- 转化研究：通过追踪标记细胞在体内的扩散情况，与生物标志物研究策略相一致。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于跨项目的转移机制研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可量化的器官特异性归巢效应，降低转移途径中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化肿瘤细胞递送和组织处理流程，实现可重复的实验室间比较。
- 战略价值：通过实现对靶向转移疗法的早期风险排除，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于临床前转移抑制数据，促进经风险调整的项目推进决策。
实施注意事项
- 需要掌握小鼠尾静脉注射和组织解离技术的专业技能。
- 依赖于流式细胞仪设备以及荧光补偿对照。
- 要求不同研究团队之间采用标准化的细胞制备流程。
- 需要优化细胞剂量，以避免因细胞在肺部过度积聚而产生干扰信号。
- 仅限于量化肺部积聚，无法反映原发肿瘤的侵袭或后续转移灶的生长情况。
