Name: 肺肿瘤细胞招募分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: 学习利用荧光标记的Lewis肺癌细胞在小鼠模型中定量分析肺肿瘤细胞招募的方法。该技术通过流式细胞术精确量化远端器官的肿瘤积累，为研究转移机制提供重要工具。

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所有涉及小鼠的操作程序均经东京女子医科大学动物研究委员会批准。
1. Lewis肺癌细胞（LLC细胞）尾静脉注射
<ol>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，将LLC细胞培养于添加10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中。细胞应含有荧光蛋白表达系统（例如，GFP）。</li>
	<li>使用非酶解细胞解离试剂将细胞从培养皿中分离，操作遵循试剂生产商的说明书。</li>
	<li>将细胞收集至15 mL离心管中，在400 × g条件下离心3分钟。用移液器将细胞重悬于5 mL PBS中，再次离心（400 × g，3分钟），然后弃去上清液。
	<ol>
		<li>重复此洗涤步骤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次洗涤后，将细胞通过40 µm孔径的细胞筛滤，再用PBS重悬，调整细胞终浓度为1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>通过尾静脉向每只C57BL/6小鼠（8–10周龄雄性）注射0.1 mL细胞悬液（含1 × 105 个细胞，使用29G针头）。</li>
</ol>
2. 肺组织的分离及在荧光体视显微镜下进行细胞计数
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死小鼠。</li>
	<li>用剪刀剪除胸部腹侧的皮肤，随后剪开肋骨和膈肌以暴露胸腔。通过带翅输液针（25G）和导管，从右心室灌注 PBS（100 cmH2O，总量 15 mL）。</li>
	<li>取出心脏和胸腺。用镊子夹住气管并向上提起，用剪刀分离气管周围的结缔组织，完整剥离肺脏，并在 PBS 中清洗。</li>
	<li>分离各个肺叶，并在荧光体视显微镜下观察。</li>
</ol>
3. 肺组织消化
<ol>
	<li>将10 mg胶原酶、10 mg分散酶和10 µg DNase溶解于10 mL无血清DMEM中，通过0.22 µm注射器滤器过滤，制备酶消化液。</li>
	<li>用剪刀将分离的尾叶剪碎，将肺组织碎片放入10 mL注射器中，随后插入推杆。</li>
	<li>通过回拉推杆将消化液（5 mL）吸入注射器中，反复推动和回拉推杆直至肺组织沉入溶液中，然后将肺组织和消化缓冲液转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>在37 °C下，将离心管置于往复式摇床（150 rpm）上振荡15分钟。孵育过程中肺组织可能变得破碎。</li>
	<li>用移液器反复吹打，直至肺细胞完全分散，再将离心管置于往复式摇床（150 rpm）上，37 °C继续振荡30分钟。</li>
	<li>将肺细胞悬液通过40 µm细胞筛网过滤，以400 × g离心3分钟收集细胞。</li>
</ol>
4. 肺细胞的流式细胞术
<ol>
	<li>将 100 mg BSA 溶解于 10 mL PBS 中，通过 0.22 µm 注射器滤器过滤，制备 PBS-1% BSA。</li>
	<li>用移液器吸除步骤 3.6 所得样品的上清液，加入 2 mL 红细胞裂解液，然后以 400 × g 离心 3 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用移液器将细胞重悬于 5 mL PBS-1% BSA 中，离心（400 × g，3 分钟）。弃去上清液。
	<ol>
		<li>再重复此洗涤步骤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞悬浮于 1 mL PBS-1% BSA 中，并通过一个新的 40 µm 细胞筛网过滤。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞，计数肿瘤细胞（使用 FL1 滤光设置检测 GFP-LLC）。</li>
</ol>

<ol><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li>
<li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-%CE%BAB+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li>
<li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li>
<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-metastatic+niche%3A+finding+common+ground%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li>
<li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li>
<li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853(2013).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4%2FMD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li>
<li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在注射肿瘤细胞之前，可对小鼠进行抗体、药物、高脂饮食或肿瘤条件培养基的预处理。该实验中最困难的步骤是尾静脉注射，注射不完全会导致结果不明确。C57BL/6小鼠的尾静脉尤其难以辨认，容易导致注射失败。将小鼠置于加热垫（37 °C）上有助于扩张尾静脉，使注射更容易进行。
该实验需要使用大量（1 × 104 - 1 × 105）肿瘤细胞，远超过患者血液中所观察到的数量。一次性注射如此大量的细胞可能引发宿主动物的不良反应。在荧光体视显微镜计数过程中，位于组织深部的肿瘤细胞难以被检测到。在流式细胞术分析中，肺组织需被完全消化以计数其中的肿瘤细胞，该过程会导致有关肿瘤细胞位置（血管内或血管外）的重要信息丢失。相比之下，在共聚焦荧光显微镜下检测肿瘤细胞可有效区分位于血管内的肿瘤细胞与其他位置的细胞10。
荧光体视显微镜是一种非常简单的方法。使用流式细胞术计数肿瘤细胞与显微镜扫描相比无偏倚。可以在共聚焦荧光显微镜下扫描整个肺组织切片，但该检测将变得较为...

肿瘤转移是导致癌症相关疾病高死亡率的主要原因。从分子水平的研究角度来看，转移过程可分为多个步骤：原发肿瘤部位的肿瘤启动、原发肿瘤的生长及对周围组织的侵袭、内渗、经血管循环、在远端器官的外渗，以及肿瘤的再次生长。每个步骤均涉及不同的分子/信号通路1。
迄今为止的研究主要关注肿瘤细胞进入血液循环之前远处器官中发生的一系列事件，这一阶段也被称为转移前阶段2,3,4,5,6。我们通过小鼠模型研究发现，转移前阶段可通过在肺部引发持久且低水平的炎症反应，促进肺转移的发生。转移前阶段的特征包括微血管通透性增高、骨髓来源细胞（BMDC）的募集，以及S100A8和SAA3等细胞因子/趋化因子样分子的上调3,4。已有研究报道，赖氨酰氧化酶可修饰肺部的细胞外基质，从而招募BMDCs7。另一项研究揭示了Angpt2、MMP3和MMP10在转移前阶段中的重要作用8。换句话说，为了预防未来的转移，必须深入理解并有效调控原发性肿瘤、骨髓与远端器官之间复杂的相互作用（例如，通过靶向参与这些相互作用的蛋白质的药物）9。为了调控转移前阶段，首先需要对其进行可视化观察和评估，以便开展诊断或治疗干预。本文中，我们报道了一种肺肿瘤细胞募集检测方法，可用于研究肺部的转移前阶段。
将肿瘤细胞直接注射到小鼠血管中，与癌症患者体内的循环肿瘤细胞类似，尽管培养的细胞与循环肿瘤细胞之间可能存在差异。循环肿瘤细胞本身在从原发性肿瘤进入血液循环时会经历一些特征性变化。然而，培养的细胞在尾静脉注射后仍可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤。此外，在小鼠模型系统中，可使用荧光标记的肿瘤细胞，从而实现对这些细胞在体内迁移过程的追踪。循环肿瘤细胞的行为至关重要，因为它们决定了癌症患者的最终疾病转归10。血液环境并不利于肿瘤细胞的存活2。它们必须逃避免疫系统攻击，并需要抗凋亡信号以防止因缺乏物理支持而引发的凋亡。在转移部位具有更强肿瘤起始能力的肿瘤细胞可形成更多的肿瘤结节。若肿瘤细胞表现出特定的器官趋向性，则应在相应特定器官中观察到转移现象。本实验不包含转移级联反应的初始步骤（原发性肿瘤生长与侵袭），因此重点在于循环肿瘤细胞与基质细胞（内皮细胞、上皮细胞和血细胞）之间的相互作用。在传统的肿瘤细胞注射实验中，研究人员必须等待肿瘤结节生长至可触及的大小才能检测转移情况。在此情况下，无法准确量化血管内肿瘤细胞的精确数量。此外，该过程包含肿瘤再增殖阶段，表明肿瘤细胞中的其他因素可能影响实验结果。
在荧光体视显微镜下计数标记的肿瘤细胞是一种简单的方法。体视显微镜提供宽阔的视野，可对整个肺组织进行扫描。流式细胞术也是一种有效的工具，能够快速准确地测定组织中肿瘤细胞的数量。此外，也可在共聚焦显微镜下对组织中的荧光标记细胞进行计数，该方法可呈现转移性肿瘤细胞最精确的图像，但耗时较长，且若仅对选定区域进行计数，可能产生偏差结果。本实验的最终目标是观察肿瘤细胞在肺部聚集的难易程度。如先前报道所述3,4，如果由于原发性肿瘤的炎症信号导致肺部处于转移前阶段，那么注射的肿瘤细胞容易在肺部积聚，从而意味着肺转移的可能性更高。其他情况（类风湿性关节炎、哮喘、 等等。），并且使用抗炎药物（如抗TNFα）治疗可能减轻肺转移。因此，我们得出结论：该检测方法是评估肺转移可能性的一种有力工具。

<table><tbody><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>无钙无镁磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>无钙、无镁</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td>微量</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛</td><td>BD</td><td>352340</td><td>40 微米网孔</td></tr><tr><td>荧光标记试剂盒</td><td>Sigma</td><td>MIN26-KIT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>sartorius</td><td>17597K</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr></tbody></table>

肺肿瘤细胞募集实验

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

为了研究调控肿瘤转移的分子机制，已提出多种以小鼠为模式动物的实验方法。本文展示了一种用于评估肿瘤细胞外渗或微转移的简单实验方法。在该实验中，将肿瘤细胞通过尾静脉注射，经过短暂时间后，解剖并消化肺组织，以计数积聚的标记肿瘤细胞。该方法跳过了原发性肿瘤侵入血管的初始步骤，便于研究肿瘤转移所发生的远端器官中的相关事件。可通过优化注入血管的细胞数量，以观察有限数量的转移灶。已有研究报道，远端器官中的基质细胞参与了转移过程。因此，该实验方法可作为探索预防肿瘤转移的潜在治疗药物或器械的有效工具。

注射后2 h，肺部可见大量表达GFP的LLC细胞（图1A）。需要注意的是，红光滤镜下观察到的荧光斑点不应计入细胞数量。注射后24 h，绝大多数LLC细胞已从肺部消失（图1C）。
为了确认肺部GFP-LLC的数量，可取其中一个肺叶进行流式细胞术分析（图2）。
<img alt="荧光显微镜图像、蛋白质定位研究、绿色和红色通道比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/53172/53172fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1">...

本论文描述了一种在肿瘤转移动物模型中定量肺部肿瘤细胞聚集的方法。

为研究调控肿瘤转移的分子机制，已提出多种以小鼠为模型动物的实验方法。此处，我们……

该方法有助于解答肿瘤生物学领域中关于转移分子机制的关键问题。此技术的主要优势在于能够定量分析肿瘤细胞在远端器官中的募集情况。首先，使用非酶解细胞解离试剂，按照标准操作流程从培养容器中分离表达荧光蛋白的路易斯肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）细胞。将所得细胞悬液转移至15毫升锥形管中，离心后用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀物，共洗涤两次。第二次洗涤后，通过40微米孔径的细胞筛过滤细胞，并将细胞悬液稀释至浓度为1×10⁶个细胞/毫升。然后将细胞悬液加入配有29号针头的1毫升注射器中，向每只8至10周龄的C57-Black-6雄性小鼠尾静脉注射100微升细胞悬液。在适当的实验终点，使用剪刀去除每只小鼠腹侧的皮肤，并剪开肋骨和膈肌以暴露胸腔。使用25号带翼输液针和管路，经右心室灌注15毫升PBS进行冲洗，随后取出心脏和胸腺。用镊子夹住气管并轻轻上提，分离气管周围的结缔组织，以完整取出肺组织。然后用 PBS 清洗肺组织，并取一个肺叶用于在荧光显微镜下原位观察荧光标记的细胞。为了消化肺组织，首先用剪刀将尾叶剪碎，将肺组织碎片放入一个 10 毫升注射器中。用活塞封闭注射器，吸入 5 毫升消化液，反复推动和抽拉活塞，使肺组织在溶液中充分分散。将肺组织匀浆液分装至50毫升离心管中，在37摄氏度、150 rpm条件下于往复摇床中消化组织15分钟。孵育结束后，反复吹打剩余组织，直至肺细胞完全分散，再将离心管放回摇床继续振荡30分钟。随后通过40微米孔径滤网过滤细胞，并通过离心收集细胞。为了通过流式细胞术分析分离的肺细胞，将细胞沉淀在室温下重悬于两毫升红细胞裂解缓冲液中孵育一分钟，然后通过离心收集细胞。随后，每次用五毫升新鲜添加1%牛血清白蛋白的PBS洗涤，共离心洗涤两次。第二次离心后，将细胞沉淀重悬于一毫升含BSA的新鲜PBS中，并通过一个新的40微米孔径滤网过滤，以进行流式细胞术对肿瘤细胞的定量分析。注射后2小时，肺部出现大量GFP-LLC细胞，但绝大多数细胞在24小时内从肺部消失。请注意，任何在红色滤光片下检测到的荧光点均应从细胞计数中排除。为确认肺部GFP-LLC细胞的数量，可取其中一个肺叶进行流式细胞术分析，如图所示。在进行此操作时，重要的是要记住，冰冻切片法是观察肿瘤细胞确切位置的更准确方法。

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淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

该方法可同时评估三维球状体实验中的癌细胞侵袭和T细胞介导的细胞毒性。球状体在无支架的琼脂糖多微孔模具中生成。共培养及包埋于I型胶原基质均在同一装置内完成，从而可实时监测癌细胞的侵袭行为以及T细胞介导的细胞毒性效应。...

在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。...

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