利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本实验的总体目标是利用毛发来源的角质形成细胞生成人诱导性多能干细胞。首先从供体获取毛发，然后将毛发接种培养，以促进角质形成细胞的迁移生长。

接下来，将角质形成细胞在体外进行维持和扩增。最后一步是利用附加体型重编程方法将角质形成细胞重编程为人类诱导性多能干细胞。最终，可通过免疫组织化学方法分离并鉴定人类iPS细胞，以检测多能性标志物的表达。

与现有的逆转录病毒或慢病毒方法相比，该方法的总体优势在于，通过使用附加体型因子，可避免产生不良的外源基因整合到所生成的干细胞基因组中。首先，将一管细胞外基质溶液在冰上过夜解冻。次日早晨，使用预冷的移液器吸头将200 µL该溶液加入12 mL预冷的DMEM/F12培养基中。

向12孔板的每孔中加入1毫升稀释后的细胞外基质溶液，在37摄氏度孵育过夜，以使基质包被各孔。接下来，通过将手指靠近供体头部毛发根部，并以快速而流畅的动作拔取毛发，收集原代人毛发。

检查并确认每根采集的毛发均含有完整的毛囊。将毛囊置于解剖显微镜下，确定每根毛发的生长阶段。从每个个体收集5至10根抗原毛发，以提取角蛋白冰。

抗原相与T相不同，包含多层上皮。将毛发样本放入含有10毫升抗生素混合液的培养皿中孵育5分钟，然后在室温下用PBS洗涤5分钟。接着，用无菌镊子夹住毛发，使用一把无菌剪刀剪去多余的毛干，保留带有完整毛囊及约0.5至1厘米毛干的毛发片段。

用无菌镊子小心地将一根毛囊片段转移至包被有细胞外基质的培养板的每个孔中。向每孔含有毛囊样本的孔中滴加约100至200微升的血清替代物培养基。

然后将培养板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜，次日继续培养。轻轻逐滴加入100至200微升的血清替代物培养基，以保持毛发样本湿润。每天检查毛发样本，确认毛囊已成功附着于培养板上。

贴壁后，轻柔地向孔中再加入 500 µL 培养基。每两天更换一次培养基。用胶原蛋白包被六孔板。

使用预处理方法，例如在每个孔中加入680微升试剂盒中的稀释液，再加入6.8微升包被基质溶液。轻轻振荡培养板，以确保包被均匀。在接种角质形成细胞前，将包被好的培养板于室温孵育30分钟。

移除包被液，每孔加入 500 微升 0.25% 胰蛋白酶，将培养物中的角质形成细胞解离为单细胞悬液，并在 37 摄氏度下孵育 2 至 5 分钟。待细胞从培养板上脱落时，加入 500 微升含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化，将细胞收集至无菌的 15 毫升离心管中。使用灭菌镊子去除毛发碎片，离心收集细胞沉淀，然后重悬。

将角质形成细胞重悬于新鲜的角质形成细胞生长培养基中，每孔接种40,000个角质形成细胞至胶原蛋白包被的培养板中，并加入角质形成细胞培养基。每天更换培养基，当细胞培养达到约80%融合度时进行传代。通过向六孔板的每个孔中加入2毫升0.1%明胶溶液，在室温下孵育至少20分钟，以明胶包被六孔板。在此期间，将传代次数为六代或更低的角质形成细胞通过每孔加入1毫升0.25%胰蛋白酶消化液，孵育2至5分钟，使其解离为单细胞悬液。

在37摄氏度条件下，加入一毫升含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化，并将细胞收集至15毫升离心管中。离心沉淀细胞后，将其重悬于角质形成细胞培养基中。随后，将每孔100,000至150,000个角质形成细胞接种于经明胶包被的六孔板中，于次日（即第零天）培养过夜。之后观察细胞培养板，确保细胞融合度达到50%至60%。

按照随附文本方案中的描述，使用8微升转染试剂与2微克总质粒DNA的比例，对角质形成细胞进行附加体型重编程载体的转染。次日（第1天），更换角质形成细胞培养基，并在荧光显微镜下通过估算绿色荧光蛋白阳性细胞的百分比来检测转染效率。第2天的转染效率预计为60%至70%。

重复转染以将转染效率提高至90%以上。然后用5毫升0.1%明胶预包被10厘米培养皿，至少20分钟。按照Conrad Al等所述方法，在FBS培养基中每10厘米培养皿接种400万个有丝分裂失活的饲养细胞，并于第3天在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜，使细胞沉降并贴壁。按照前述方法收获转染的角质形成细胞，并将其重悬于KSR培养基中接种。

将一个孔中90%的角质形成细胞转移至已铺有饲养层细胞的10厘米培养皿中，并用KSR覆盖。从第21天开始，通过显微解剖法分离人诱导性多能干细胞克隆。避免选择紧密聚集的克隆，仅挑选与其他克隆明显分离的克隆。

进行手动解剖时，在解剖显微镜下使用26号针头将克隆切割成长度约为300至600微米的小片段。将一个克隆的片段转移至新的MEF饲养层培养板中，以建立人诱导性多能干细胞的单克隆系。当培养物达到70%至80%融合度，且人诱导性多能干细胞克隆直径约为1.5毫米时，采用标准的酶消化传代方法（如Accutase、胰蛋白酶或胶原酶）进行细胞传代。

根据制造商的说明，四天后即可观察到毛囊外植体的细胞生长，最早在毛发附着后三天就能看到细胞增殖，且细胞将持续增殖。此处展示的角质形成细胞已被传代至新的培养板，这些细胞可进行多次传代培养。

此图像显示一个典型的由角质形成细胞衍生的人诱导性多能干细胞克隆。经过32天的重编程后，人诱导性多能干细胞克隆的中心区域可能出现一定程度的分化。经人工挑选后，衍生的细胞通常表现出较高的核质比以及清晰的克隆边界。

它们还表达多种多能性标志物，例如 OCT4、Nanog 和 TRA-1-60。观看本视频后，您应能够充分理解如何从毛发中提取角质形成细胞，并将其重编程为人类诱导性多能干细胞。