Name: 集成的无人类诱导多能干细胞的生成方法头发衍生角质形成细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 了解如何利用头发来源的角质形成细胞通过非整合型 episomal 载体重编程生成无整合的人类诱导多能干细胞。该方法避免了基因组整合风险，适用于再生医学和疾病模型研究。

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作者谨此感谢 Harene Ranjithakumaran 和 Stacey Jackson 提供的技术支持。本工作部分得到了以下机构的资助：澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（R.C.B. Wong、A. Pébay）、墨尔本大学（R.C.B. Wong）、澳大利亚视网膜基金会（R.C.B. Wong、S.S.C. Hung、A. Pébay）以及澳大利亚眼科学研究所（R.C.B. Wong、S.S.C. Hung、A. Pébay）；澳大利亚研究理事会未来奖学金（A. Pébay，FT140100047）、克兰伯恩基金会奖学金（R.C.B. Wong）；美国国立卫生研究院的院内资助（R.C.B. Wong、S.S.C. Hung）；以及维多利亚州政府提供的运营基础设施支持。

采集人体毛发样本需获得所在机构人体研究伦理委员会的伦理批准，并应遵守机构的相关指南。
1. 从拔下的毛发中分离角质形成细胞
<ol>
	<li>解冻细胞外基质（ECM）溶液（即， Matrigel) 冰上孵育过夜。</li>
	<li>使用预冷的移液器吸头，加入 200 µl&#160;将ECM溶液加至12 ml&#160;预冷的DMEM/F12培养基。用1 ml培养基包被12孔板&#160;将稀释的ECM溶液加入每个孔中。将包被好的培养板在37 °C孵育过夜。使用前用预热的DMEM/F12培养基洗涤包被好的培养板。</li>
	<li>从个体头部采集原代人发时，将手指靠近毛发根部，以快速而流畅的动作拔取毛发。检查每根采集的毛发，确认其含有完整的毛囊，并在解剖显微镜下判断毛发的生长阶段。图1).
	<ol>
		<li>从每位个体收集5-10根生长期毛发以提取角质形成细胞。拔取的毛发应尽快处理，以确保成功分离角质形成细胞。 
		注意： 图1 展示了毛发生长周期不同阶段的毛发形态。生长期（anagen）毛发处于生长阶段，其毛发全长可见被一层上皮外层（即外根鞘，ORS）所包围。而休止期（telogen）毛发代表处于静止阶段的毛发，无可见的外根鞘，但在毛根部位有明显的细胞团块覆盖，称为休止期隆起（telogen bulge）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将毛发样本放入含有10 ml的培养皿中&#160;用抗生素混合液洗涤5分钟&#160;室温下</li>
	<li>使用灭菌的剪刀和镊子剪去多余的毛干，保留带有完整毛囊及约0.5–1 cm毛干的毛发片段。</li>
	<li>使用镊子将1根毛发片段小心转移至每孔ECM包被的板中。</li>
	<li>使用1 ml&#160;用移液器向毛发样本中加入约3滴无血清替代培养基（Knockout Serum Replacement, KSR）（约100–200 µl）。 
	注意：将毛发碎片保持与培养板表面紧密接触，以利于其贴附及后续角质形成细胞的生长。此步骤中若加入过多培养基，可能导致毛发碎片漂浮，从而降低毛发成功贴附的几率。</li>
	<li>将毛发样本置于含5% CO₂的37 °C培养箱中孵育2 让毛囊附着过夜。次日，轻轻加入另外3滴KSR培养基（约100–200 µl），以保持毛囊样本湿润。</li>
	<li>每日观察毛发样本，以确认毛囊已成功附着。通常毛囊附着情况在1至3天内可见。粗毛通常比细毛更容易附着，因为细毛更易漂浮，从而阻碍附着过程。
	<ol>
		<li>毛发附着到包被板后，加入 500 µl&#160;向孔中加入KSR培养基。添加培养基时需格外小心，因为毛发样本可能尚未牢固附着。此后，每2天更换一次培养基。 
		注意：3-7 天后应可见从毛发片段的外根鞘区域长出的角质形成细胞。图2A-B)。在传代细胞之前，让角质形成细胞培养最多14天，具体操作见下一节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 角质形成细胞的维持与传代
<ol>
	<li>使用包被基质试剂盒预包被6孔板。加入680 µl&#160;试剂盒中的稀释液加入每孔，随后加入6.8 µl&#160;加入包被基质溶液。轻轻振荡培养板，确保包被基质溶液在板上均匀分布。</li>
	<li>将包被好的培养板置于37℃孵育30分钟&#160;室温下孵育。在接种角质形成细胞之前，去除包被基质溶液。</li>
	<li>用500 µl将角质形成细胞解离成单细胞悬液&#160;每孔加入 0.25% 胰蛋白酶，作用 2–5 分钟&#160;37 °C下，加入500 µl终止胰蛋白酶活性&#160;含血清的培养基例如， 胎牛血清（FBS）培养基），并收集至无菌15 ml离心管中&#160;移液管。使用无菌镊子移除毛发片段。</li>
	<li>使用血细胞计数板确定收获的细胞数量。</li>
	<li>离心细胞3分钟&#160;在200 × g条件下离心。用PBS洗涤细胞，并重复离心。吸除PBS，将细胞沉淀重悬于新鲜的角质形成细胞培养基中。</li>
	<li>接种 4 × 104 将角质形成细胞接种至经细胞外基质包被的培养板的一个孔中，加入角质形成细胞培养基。将角质形成细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2 (图2C每天更换培养基，当细胞培养物汇合度达到约80%时进行传代，具体时间可能因角质形成细胞的传代次数和增殖速率而异，大约需要2–7天。应扩增所获得的角质形成细胞，以利用标准的慢速冷冻法建立足够的冻存储备。16. 
	注意：所述培养条件可支持具有典型鹅卵石样形态的均一角质形成细胞群体的扩增图2C偶尔可在培养物中观察到少量已分化的角质形成细胞，这些细胞具有较大且扁平的形态，并已丧失复制潜能。角质形成细胞的表征可通过免疫染色进行，使用抗细胞角蛋白14的抗体，方法如前所述。 17建立的角质形成细胞系在传代1-3次后，应使用市售试剂盒检测支原体污染。</li>
</ol>
3. 使用附加体型载体从角质形成细胞生成人诱导多能干细胞
<ol>
	<li>用0.1%明胶（2 ml/孔）预包被6孔板，明胶包被时间至少20分钟。&#160;室温下</li>
	<li>用于重编程实验时，应使用传代不超过第6代的角质形成细胞。用1 ml单细胞悬液消化角质形成细胞&#160;每孔加入 0.25% 胰蛋白酶，作用 2–5 分钟&#160;在37 °C下，用1 ml使胰蛋白酶失活&#160;含血清的培养基例如， FBS 培养基）并收集至 15 ml 离心管中&#160;管</li>
	<li>离心细胞 3 分钟&#160;在200 × g条件下离心并用角质形成细胞培养基重悬细胞。接种1 × 105-1.5 × 105 每孔角质形成细胞置于明胶包被的培养板中过夜。</li>
	<li>次日（第0天），检查培养板，确保细胞融合度达到50–60%。 
	注意：如果角质形成细胞的融合度小于约 50%，转染后可能生长不良。</li>
	<li>第0天，使用8 µl的比例，对角质形成细胞进行附加体型重编程载体的转染&#160;转染试剂与2 µg总质粒DNA混合。
	<ol>
		<li>取每种质粒（pCXLE-eGFP、pCXLE-hOct3/4-shP53F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL）各0.5 µg，溶于100 µl中&#160;减血清培养基（例如， OPTI-MEM 
		注意：质粒pCXLE-eGFP用于监测角质形成细胞中的转染效率，但并非成功重编程所必需。</li>
		<li>加入 8 µl&#160;将转染试剂加入稀释后的DNA中，轻轻弹击管壁混匀。室温下静置DNA反应混合物15分钟，避免扰动。</li>
		<li>更换为新鲜的角质形成细胞培养基。</li>
		<li>轻轻将DNA反应混合物加入角质形成细胞培养物中，并在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2 4小时 
		注意：不建议在角质形成细胞中进行长时间转染（如过夜），因为转染后其存活率较低。</li>
		<li>4 小时后&#160;转染后，将角质形成细胞培养基更换为新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第1天（转染后1天），更换角质形成细胞培养基，并在荧光显微镜下通过估算表达eGFP的细胞百分比来检测转染效率。通常 &#62; 使用本方案对原代角质形成细胞进行转染，可观察到60-70%的转染效率。</li>
	<li>第2天，按照步骤3.5所述重复转染。连续两次转染通常可达到 &#62; 90% 转染效率。角质形成细胞培养通常在第二次转染结束时达到汇合。
	<ol>
		<li>为每种重编程反应准备一皿10 cm的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层。有丝分裂失活的MEF饲养层的制备方法参照先前描述 18.</li>
		<li>用5 ml预包被一个10 cm培养皿&#160;0.1% 明胶中孵育至少 20 分钟。接种 4 × 106 每10 cm培养皿中加入经有丝分裂失活的MEF，置于含FBS的培养基中。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜，使其充分沉降并贴壁。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天，按照步骤3.2和3.3所述，用0.25%胰蛋白酶消化收集角质形成细胞。将角质形成细胞重悬于KSR培养基中，并将6孔板中1个孔的90%角质形成细胞接种至含KSR培养基的10 cm MEF饲养层培养皿中。</li>
	<li>从第4天开始，每天更换KSR培养基。
	<ol>
		<li>或者从第18天起，每隔一天更换一次培养基。 
		注意：未重编程的角质形成细胞将停止增殖，而具有明确边界、类似于人胚胎干细胞（hESCs）的hiPSC克隆将在第14至21天出现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从第21天开始，通过手动解剖分离hiPSC克隆。避免选择紧密聚集的hiPSC克隆，仅挑选与其他克隆明显分离的hiPSC克隆。 
	注意：hiPSC 克隆可更早进行挑选， &#160;但早期时间点的菌落较小，边界清晰的菌落可能并不明显。&#160;不同患者的角质形成细胞重编程效率可能存在差异，且该效率还受角质形成细胞的传代次数或增殖速率等因素影响。
	<ol>
		<li>使用26G针头在解剖显微镜下对hiPSC集落进行手动解剖。将hiPSC集落切割成大小约为300–600 µm的小块。将一个hiPSC集落切割后的组织块转移至新的MEF饲养层培养板（2.5 × 10⁴ cells/cm²）中。4 MEF/cm2) 以建立hiPSC的克隆系。最初将每个hiPSC克隆系培养于12孔板或器官培养皿中的一个孔内，随后扩增至6孔板培养体系。</li>
		<li>在饲养层细胞（MEF）上使用KSR培养基维持已建立的hiPSC克隆系。当培养物达到70–80%融合度，且hiPSC克隆直径约为1.5 mm时，根据制造商说明书，采用标准的酶法传代方法（Accutase、Dispase或Collagenase IV）对hiPSC进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征已建立的hiPSC细胞系，以确认其多能性及其分化为三胚层代表性细胞的能力 体外 和/或 体内13,19此外，应使用市售试剂盒对已建立的hiPSC细胞系常规进行支原体检测，以确保无病原体污染。常规监测hiPSC细胞系的基因组稳定性 &#160;通过核型分析或基于芯片的拷贝数变异（CNV）分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

生成患者特异性hiPSC为在病变细胞类型中研究发病机制提供了一种独特的方法 体外，并为药物筛选提供了一个平台，以鉴定能够挽救疾病表型的新分子。利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行疾病建模的方法已在多种疾病中取得有前景的成果，包括长QT综合征、亨廷顿病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症 22美国、欧洲、澳大利亚、中国、韩国和日本已有多项计划正在推进，旨在建立大规模的患者特异性hiPSC文库 23,24.
本文描述了一种从毛发来源的角质形成细胞建立人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案，该方案有望促进并加速构建大规模的疾病特异性hiPSC文库。本方案具有两个优势：首先，该方案采用的附加体型系统可利用六种重编程因子的混合物（OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、靶向p53的shRNA）以相对较高的效率获得无整合的hiPSCs4。与逆转录病毒或慢病毒介导的重编程方法相比，附加体载体的使用可避免在重编程过程中外源转基因意外整合到基因组中。因此，许多研究项目倾向于采用无整合的重编程方法（如附加...

人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）的发现彻底改变了再生医学领域，为获得患者特异性的干细胞提供了一种可行的方法1-3。hiPSCs已成功从多种体细胞类型中获得，包括成纤维细胞4,5、造血细胞6,7、尿液中的肾上皮细胞8以及角质形成细胞9,10。迄今为止，皮肤成纤维细胞和造血细胞仍是生成患者特异性iPSCs最常用的细胞来源。这可能是因为皮肤活检和采血属于常规医疗操作，且许多国家已建立了大量的患者血液或皮肤样本生物库。
与需要侵入性提取方法的血细胞和皮肤成纤维细胞相比，角质形成细胞是一种易于获取的细胞类型，可用于诱导多能干细胞（hiPSC）的生成。角质形成细胞是富含角蛋白的上皮细胞，构成皮肤的外部表皮屏障，也存在于指甲和毛发中11。特别是，角质形成细胞可存在于毛囊的外根鞘（ORS）中，这是一种外部细胞层，与内根鞘（IRS）细胞共同包覆毛干（12，图1）。由于毛发采集是一种简单操作，无需医务人员协助，患者可自行采集并寄送毛发样本至实验室，这将极大促进用于hiPSC生成的患者样本收集。与成纤维细胞相比，表皮角质形成细胞还具有更高的重编程效率和更快的重编程动力学，进一步增强了其作为hiPSC起始细胞的优势9,13。此外，也可利用毛囊内的其他细胞群体生成hiPSC，包括位于毛囊基底部的真皮乳头细胞14,15。
既往关于利用毛发来源细胞生成诱导多能干细胞（iPSC）的报道通常采用逆转录病毒或慢病毒介导的重编程方法9,14,15。然而，这些病毒方法在重编程过程中会导致外源性转录因子基因整合到宿主基因组中，带来安全隐患。相比之下，使用附加体型载体是一种可行的非病毒重编程方法，可生成无基因组整合的iPSC4。我们此前已建立了一种简单、经济且非病毒的方法，能够高效地利用附加体型载体将角质形成细胞重编程为人诱导多能干细胞（hiPSC）13。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，用于生成角质形成细胞来源的hiPSC，包括从拔取的毛发中分离角质形成细胞、角质形成细胞的扩增与培养，以及后续重编程生成hiPSC的完整流程。

<table><tbody><tr><td>抗生素混合液：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml 抗真菌剂两性霉素B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>抗生素混合液用PBS配制。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X 青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS（-）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代培养基（Knockout Serum Replacement, KSR）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>使用 Stericup（Millipore，#SCGPU05RE）过滤 KSR 培养基，使用前新鲜加入 bFGF。</td></tr><tr><td>20% 敲除血清替代物 (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺的DMEM/F12培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times; MEM非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;0.5&amp;times; 青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;0.1 mM &amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;bFGF（10 ng/ml，新鲜添加）</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞培养基：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EpiLife 加 60&amp;nbsp;&amp;micro;M 钙</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times; 人角质形成细胞生长补充剂（HKGS）</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）培养基：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>使用 Stericup（Millipore，#SCGPU05RE）过滤 FBS 培养基，过滤后使用。</td></tr><tr><td>10% 胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x 青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>细胞外基质（ECM）：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>康宁&amp;nbsp;</td><td>354234</td><td>分装 Matrigel 原液并保存于 -80&amp;deg;C 按照制造商说明&amp;rsquo;s 操作说明。Matrigel 的储存浓度因批次略有差异（~9 mg/ml）。我们建议使用 200&amp;micro;l 用于包被12孔板的Matrigel（约150&amp;micro;g/孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>包被基质试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>质粒：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>请注意，pCXLE-eGFP 仅用于监测转染效率，重编程过程并不需要。</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂 Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>明胶（来自猪皮）</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>用蒸馏水配制0.1%明胶溶液，使用前高压灭菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>低血清培养基：OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层</td><td></td><td></td><td>MEF 可通过丝裂霉素 C 处理或辐照灭活，具体方法如先前所述16。</td></tr><tr><td>26G针头</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6孔板（组织培养处理）</td><td>BD 生物科学</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12孔板（组织培养处理）</td><td>BD 生物科学</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿（组织培养处理）</td><td>BD 生物科学</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>使用浓度为 10 mg/ml</td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>使用浓度为 1 mg/ml</td></tr><tr><td>TRA-160 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>使用浓度为5 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>5时使用 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>NANOG 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1997</td><td>10时使用 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert 检测试剂盒</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

近年来，重编程技术的进步使我们能够将体细胞转化为人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。利用患者特异性的hiPSCs进行疾病建模，可研究疾病发病机制的潜在机理，同时也为疾病治疗策略的开发提供了平台。 体外 药物筛选和基因治疗以改善治疗方案。近年来，关于iPSC的研究论文数量不断增加（超过7000篇），充分表明hiPSC在再生医学中具有广阔的应用前景。已成功用于生成hiPSC的细胞类型涵盖多种不同谱系，包括皮肤成纤维细胞、造血细胞和表皮角质形成细胞。尽管目前许多实验室常规采用皮肤活检和血液采集作为获取体细胞以生成hiPSC的来源，但毛发角质形成细胞的采集与后续分离培养则较少被使用。来源于毛发的角质形成细胞为获取患者细胞样本提供了一种非侵入性方法。本文概述了一种从拔取的毛发中分离角质形成细胞的简便且非侵入性方法，并提供了角质形成细胞的培养维持以及利用附加体型载体进行重编程以生成无整合的hiPSC的技术步骤。

毛发经历三个不同的生长周期阶段：生长期（anagen）、退行期（catagen）和休止期（telogen）20,21。生长期的毛囊包含多层上皮组织，这些层次包括外根鞘（ORS）、内根鞘（IRS）和毛干（图1）。生长期毛发最终会转变为退行期，此阶段以外根鞘细胞发生凋亡以及毛干分化终止为特征。最后，退行期毛发进入休止期，此时细胞凋亡停止，休止期毛囊处于静息状态，并形成典型的休止期隆起结构20,21。
图1展示了休止期毛发和生长期毛发的形态。我们通常使用生长期毛发来分离角质形成细胞。根据本方案，在毛发附着后3天即可观察到角质形成细胞的外延生长（图2A），并会持续增殖（图2B）。根据我们的经验，部分生长期毛发可能无法附着或未见角质形成细胞外延生长；因此，建议从每位个体收集至少5–10根生长期毛发，以确保成功分离角质形成细胞。随后，角质形成细胞可传代至新培养板，并可维持多次传代（图2C</stron...

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。

重编程技术的最新进展使我们能够将体细胞转化为人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。利用疾病建模……

本实验的总体目标是利用毛发来源的角质形成细胞生成人诱导性多能干细胞。首先从供体获取毛发，第二步是将毛发接种培养，以促进角质形成细胞的迁移生长。接下来，将角质形成细胞在体外进行维持和扩增。最后一步是利用附加体型重编程方法将角质形成细胞重编程为人类诱导性多能干细胞。最终，可通过免疫组织化学鉴定多能性标志物的表达，从而分离并表征人类iPS细胞。与现有的逆转录病毒或慢病毒方法相比，该方法的总体优势在于使用附加体质粒因子可避免产生不良的外源基因整合。在生成的干细胞中，外源基因不会整合到基因组中。首先将一管细胞外基质溶液在冰上过夜解冻。次日早晨，使用预冷的移液器吸头将200 µL该溶液加入12 mL预冷的DMEM/F12培养基中。向12孔板的每孔中加入1毫升稀释后的细胞外基质溶液，在37摄氏度孵育过夜，以使基质包被各孔。接着，通过将手指靠近供体头部毛发根部，并以快速而流畅的动作拔取毛发，收集原代人毛发。检查并确认每根采集的毛发均含有完整的毛囊。将毛囊置于解剖显微镜下，确定每根毛发的生长期。从每个个体收集5至10根抗原毛发，以提取角蛋白冰。与T相不同，抗原相包含多层上皮。将毛发样本放入含有10毫升抗生素混合液的培养皿中，孵育5分钟，然后在室温下用PBS洗涤5分钟。接着，用无菌镊子夹住毛发，使用无菌剪刀剪去多余的毛干，保留一段带有完整毛囊及约0.5至1厘米毛干的毛发片段。用无菌镊子小心地将一根毛发片段转移至包被有细胞外基质的培养板的每个孔中。向含有毛发样本的各孔中逐滴加入约100至200微升的血清替代物培养基。然后将培养板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜，次日进行后续操作。轻柔地以滴加方式加入100至200微升的血清替代物培养基，以保持毛发样本湿润。每天检查毛发样本，确认毛囊已成功附着于培养板上。贴壁后，轻柔地向孔中再加入 500 微升培养基。每两天更换一次培养基。用胶原预包被六孔板。使用预处理方法，例如在每个孔中加入680微升试剂盒中的稀释液，再加入6.8微升包被基质溶液进行I型包被。轻轻振荡培养板，以确保包被均匀。在接种角质形成细胞前，将包被好的培养板于室温孵育30分钟。移除包被液，每孔加入 500 微升 0.25% 胰蛋白酶，将培养物中的角质形成细胞解离为单细胞悬液，并在 37 摄氏度下孵育 2 至 5 分钟。待细胞从培养板上脱落时，加入 500 微升含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化作用，将细胞收集至无菌的 15 毫升离心管中。使用灭菌镊子去除毛发碎片，离心沉淀细胞，然后重悬。将角质形成细胞重悬于新鲜的角质形成细胞生长培养基中，每孔接种40,000个角质形成细胞至胶原包被的培养板中，并在角质形成细胞培养基存在下进行培养。每天更换培养基，当细胞培养达到约80%融合度时进行传代。用明胶对6孔板进行包被：向每孔加入2毫升0.1%明胶溶液，在室温下孵育至少20分钟。在此期间，通过向每孔加入1毫升0.25%胰蛋白酶，孵育2至5分钟，将传代次数为六代或更低的角质形成细胞解离为单细胞悬液。在37摄氏度条件下，加入一毫升含血清的培养基以终止胰蛋白酶消化，并将细胞收集至15毫升离心管中。离心沉淀细胞后，重悬于角质形成细胞培养基中。随后，将每孔100,000至150,000个角质形成细胞接种于经明胶包被的六孔板中，于次日（即第零天）孵育过夜。孵育后检查培养板，确保细胞融合度达到50%至60%。按照随附文本方案中的描述，使用8微升转染试剂与2微克总质粒DNA的比例，对角质形成细胞进行附加体质粒重编程载体的转染。次日（第1天），更换角质形成细胞培养基，并在荧光显微镜下通过估算绿色荧光蛋白阳性细胞的百分比来检测转染效率。第2天的转染效率预计为60%至70%。重复转染以将转染效率提高至90%以上。然后用5毫升0.1%明胶预包被10厘米培养皿，至少20分钟。按照Conrad Al等所述方法，在FBS培养基中每10厘米培养皿接种400万个有丝分裂失活的饲养细胞，并在第3天将其置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中过夜，使细胞沉降并贴壁。按前述方法收集转染的角质形成细胞，并将其重悬于KSR培养基中接种。将一个孔中90%的角质形成细胞接种至已铺有饲养层细胞的10厘米培养皿中，并用KSR培养基覆盖。从第21天开始，通过手工解剖法分离人诱导性多能干细胞克隆。避免选择紧密聚集的克隆，仅挑选与其他克隆明显分离的克隆。进行手动解剖时，使用26号针头在解剖显微镜下将菌落切割成大小约为300至600 µm的片段。将一个菌落的片段转移至新的MEF饲养层培养板中，以建立人诱导性多能干细胞的单克隆系。当培养物达到70%至80%汇合度，且人诱导性多能干细胞菌落直径约为1.5 mm时，采用标准的酶消化传代方法（如Accutase、TrypLE或胶原酶）进行细胞传代。根据制造商说明书操作。按照本方案进行时，最早可在毛发附着后三天观察到克隆样细胞集落的生长，且这些集落将持续增殖。此处展示的角质形成细胞已被传代至新的培养皿，这些细胞可维持多次传代培养。此图像显示一个典型的由角质形成细胞衍生的人诱导性多能干细胞克隆。经过32天的重编程后，人诱导性多能干细胞克隆的中心区域可能出现一定程度的分化。经人工挑选后，衍生的细胞通常表现出较高的核质比以及清晰的克隆边界。它们还表达多种多能性标志物，例如 OCT4、Nanog 和 TRA-1-60。观看本视频后，您应能充分理解如何从毛发中提取角质形成细胞，并将其重编程为人类诱导性多能干细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

集成的无人类诱导多能干细胞的生成方法头发衍生角质形成细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

以下方案提供了将人诱导性多能干细胞（iPS细胞）适应于无饲养层培养的详细说明，使用完全 KnockOut...

无饲养层人诱导多能干细胞的适应、培养与传代——使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基

本方案详细描述了使用KnockOut SR冻存液对人iPS细胞进行低温冻存，并在完全KnockOut SR无饲养层（KSR-FF）培养基或含饲养层的KnockOut...

使用完全型KnockOut血清替代无饲养层培养基冻存与复苏人iPS细胞

本文介绍了一种从人类毛囊中分离和培养神经嵴干细胞的可靠方案。...

从人毛囊中分离和培养神经嵴干细胞

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential...

使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

本文介绍了一种在化学成分明确的条件下将人诱导性多能干细胞分化为每种体节衍生物（肌节、生骨节、生皮节和生腱节）的实验方案，该方法在未来骨科手术的疾病建模和细胞治疗中具有应用价值。...

由人诱导性多能干细胞体外生成体节衍生物

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本方案概述了一种利用平面化、符合生理条件的气液界面培养系统，从人类诱导多能干细胞生成包含毛囊的皮肤类器官的方法，以模拟皮肤的结构与功能。...

利用气液界面培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的含毛囊平面皮肤类器官

了解如何利用头发来源的角质形成细胞通过非整合型 episomal 载体重编程生成无整合的人类诱导多能干细胞。该方法避免了基因组整合风险，适用于再生医学和疾病模型研究。

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

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