Name: 的Perigenital敏感性和前列腺肥大细胞活化新生母婴分离的小鼠模型评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解新生母婴分离对C57BL/6小鼠前列腺功能的影响，通过Von Frey单丝测量会阴机械敏感性，并使用酸化甲苯胺蓝染色评估肥大细胞活化。该方法为研究早期生活压力与慢性盆腔疼痛综合征的关系提供了重要的临床前模型。

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作者谨此感谢 Janelle Ryals、Rachel Supple 和 Frank Wang 提供的技术支持。本研究由以下基金资助：NIH 资助项目 R03 DK080182（JAC）、R01 DK099611（JAC）、R01 DK103872（JAC）、生物医学研究中心卓越中心（COBRE）资助项目 P20 GM104936（JAC）、堪萨斯州实验发展奖（IDeA）P20 GM103418 提供的启动资金和核心支持、堪萨斯州智力与发育障碍研究中心（IDDRC）P30 HD002528 提供的核心支持，以及 Madison 和 Lila Self 研究员项目（ANP）。

本方案中描述的所有实验均符合美国国立卫生研究院（NIH）指南，以及堪萨斯大学医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）规定的相关指南。
1. 新生儿期母体分离（NMS）
<ol>
	<li>每天监测怀孕母鼠的分娩情况。 
	注意：幼崽出生的当天记为P0。</li>
	<li>在P1天，将母鼠从原笼中移出，并放入一个干净的次级容器中。</li>
	<li>用戴有洁净手套的双手揉搓一把原笼垫料，以保留原笼的气味。</li>
	<li>将1–2 cm厚的原笼垫料加入一个洁净且适当标记的2 L玻璃烧杯中。同时加入原笼中所含额外丰富化垫料材料约一半的量，e.g., 巢垫（nestlet）、皱纸（crinkle paper），一同放入玻璃烧杯中。</li>
	<li>将同一窝的所有幼崽逐个轻柔地放入同一个烧杯中。</li>
	<li>立即将烧杯放入温度维持在33 oC、湿度50%的培养箱中，持续180分钟。</li>
	<li>将母鼠从次级容器中移出，并将其放回原笼。将原笼放回动物房内指定的饲养位置。</li>
	<li>对每窝接受NMS处理的幼崽重复此操作，每次均需使用洁净的手套和次级容器。</li>
	<li>在180分钟分离期结束时，按先前移出的相同顺序将各窝幼崽放回其原笼中。</li>
	<li>取出当天早些时候被分离的第一窝幼崽的原笼。将母鼠从原笼中移出，并放入一个干净的次级容器中。</li>
	<li>将第一个烧杯从培养箱中取出，在处理幼崽时，用戴有洁净手套的双手揉搓一把垫料，以保持原笼的气味。</li>
	<li>逐个轻柔地将幼崽从烧杯转移至原笼中。</li>
	<li>将烧杯中剩余的所有丰富化材料和垫料一并放回原笼中。</li>
	<li>将母鼠从次级容器中放回原笼，并将原笼放回动物房内指定的饲养位置。</li>
	<li>用水冲洗烧杯后将其放回培养箱。在整个分离过程中对每窝幼崽均使用同一个烧杯。</li>
	<li>按照先前放入培养箱的相同顺序，对每窝接受NMS处理的幼崽重复此操作。</li>
	<li>从P1至P21每天重复对每窝接受NMS处理的幼崽执行整个操作流程。</li>
	<li>在P22天对NMS处理组和未处理组（naïve）幼崽进行断奶，将同性别同胞幼崽共同置于洁净笼具中，提供充足的食物和饮水。未处理组幼崽应与NMS小鼠在相同条件下出生并饲养，除常规动物饲养管理操作外，不接受任何额外的人为干预。</li>
</ol>
2. 肛门周围机械敏感性
<ol>
	<li>von Frey 仪器设置
	<ol>
		<li>将小鼠带入测试室，保持其在原饲养笼内，适应环境 30 分钟。</li>
		<li>准备测试区域，在一张高约 55 cm 的金属网面桌（79 cm × 28 cm）下方铺设吸水垫，并确保实验人员可从底部接近小鼠而不惊扰它们。</li>
		<li>将最多 12 只小鼠分别单独置于金属网面上的透明带孔塑料罩（11 cm × 5 cm × 3.5 cm）内，并在罩上放置重物以防止小鼠逃逸。</li>
		<li>在开始缩足阈值评估前，让小鼠在测试网上再适应 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>会阴区机械敏感性评估
	<ol>
		<li>采用标准递增式 von Frey 单纤维丝组进行上下法测试43。使用以下规格的单纤维丝：1.65 g、2.36 g、2.83 g、3.22 g、3.61 g、4.08 g、4.31 g 和 4.74 g。
		<ol>
			<li>手持 3.22 g 单纤维丝的基部，拉出收缩状态的纤维丝。 
			注：某些型号可能无收缩式纤维丝。</li>
			<li>将探头置于垂直方向，当小鼠处于清醒、静止状态且体重均匀分布于双后肢时，将纤维丝轻触阴囊左侧或右侧（避开中线），直至纤维丝出现轻微弯曲。</li>
			<li>保持纤维丝接触位置持续 10 秒，或直至动物出现阳性反应。 
			注：阳性反应定义为对纤维丝刺激产生迅速抽动或跳跃，或出现舔舐、啃咬纤维丝的行为。若小鼠在 10 秒测试期间移动但未表现出上述行为，则需在至少休息 1 分钟后重新测试。若小鼠在 10 秒内既未移动也未表现出上述任何行为，则记为阴性反应。</li>
			<li>在实验记录本或笔记本电脑中记录反应结果（阴性或阳性），并使用 3.22 g 纤维丝对所有剩余小鼠重复此操作。</li>
			<li>使用下一个合适的纤维丝再次测试所有小鼠。注：若小鼠对 3.22 g 纤维丝无反应，则以相同方式施加 3.61 g 纤维丝并记录反应；若小鼠对 3.22 g 纤维丝有阳性反应，则改用 2.83 g 纤维丝施加并记录反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在首次出现阳性反应后，继续根据情况依次使用更大或更小的纤维丝对每只小鼠再进行 4 次测试。</li>
		<li>测试结束后将小鼠放回原饲养笼。</li>
		<li>根据 Chaplan et al.43 所述方法，利用试验序列中最后一次使用的 von Frey 单纤维丝数值（以对数单位表示），计算 50% 缩足阈值（g）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 酸性亚甲蓝肥大细胞染色
<ol>
	<li>组织处理
	<ol>
		<li>解剖前列腺组织44 来自经冰冻的4%多聚甲醛心脏灌注的小鼠45用4%多聚甲醛在室温下固定组织1小时，然后在30%蔗糖（溶于1x PBS）中进行冷冻保护&#160;4 °C 下用 PBS 过夜。</li>
		<li>准备少量（30 ml）庚烷，置于干冰中冷却。</li>
		<li>用1×PBS冲洗前列腺组织，然后使用轻质擦拭纸擦干。</li>
		<li>将前列腺组织放入冷庚烷中，直至其冻结。</li>
		<li>立即将冷冻的前列腺组织放入含有包埋介质的冷冻模具中，并置于干冰上直至完全冻结。</li>
		<li>将冷冻模具储存在 -20 °C。</li>
		<li>使用冷冻切片机将前列腺组织横向切成7 µm厚的冷冻切片。</li>
		<li>将8至12张覆盖组织全长的非连续冷冻切片置于带正电荷的载玻片上。</li>
		<li>将制备好的载玻片于 -20 °C 保存，直至进一步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制酸性品蓝
	<ol>
		<li>将1 g甲苯胺蓝O加入100 ml 70%乙醇中，涡旋至完全溶解，配制1%储备液。该储备液可在室温下保存长达三周。</li>
		<li>将1 g NaCl加入盛有100 ml水的烧杯中，烧杯置于搅拌器上。</li>
		<li>使用12 M HCl调节NaCl溶液的pH，直至达到0.5 - 1.0的pH范围。</li>
		<li>将8 ml甲苯胺蓝储备液与32 ml 1% NaCl溶液混合，配制0.25%甲苯胺蓝工作液。使用移液器反复吹打，确保甲苯胺蓝储备液充分混匀，并用涡旋振荡器混合。工作液须现配现用，使用后弃去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前列腺冷冻切片染色
	<ol>
		<li>从冰箱中取出待处理的载玻片，室温平衡约30分钟。</li>
		<li>用50 ml锥形管中足量的1x缓冲液，将载玻片逐一浸入约1秒，清洗组织切片&#160;用 PBS 确保载玻片上的组织切片完全浸没。将载玻片置于纸巾上晾干。</li>
		<li>将载玻片放入盛有足量0.25%工作浓度甲苯胺蓝溶液的玻璃染色缸中，确保载玻片上的组织切片完全浸没，并置于转速为15 rpm的水平摇床中孵育10–15分钟。</li>
		<li>将玻片浸入1×PBS中约1秒，以洗去多余的甲苯胺蓝。</li>
		<li>将载玻片以侧立方式放入载玻片盒或载玻片架中，以便于液体排出。</li>
		<li>将载玻片置于37 °C烘箱中干燥至少2小时，或在室温下过夜。</li>
		<li>使用酒精快速脱水，每次酒精处理后让载玻片完全干燥。将载玻片在纸巾上沥干，并用轻质擦拭纸轻轻擦拭背面和边缘以干燥。
		<ol>
			<li>将载玻片浸入95% EtOH中约1秒，然后使其完全干燥。重复此操作1至10次，直至组织呈现的蓝色多于紫色。</li>
			<li>将切片浸入100% EtOH中约1秒，然后使其完全干燥。重复此步骤1至10次，直至组织呈现深蓝色至中等蓝色，但不可变为紫色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将载玻片在100%二甲苯中孵育3分钟以固定染色。待其自然干燥。</li>
		<li>用甘油、PBS 或二甲苯基永久封片剂封片，去除多余封片剂后室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量肥大细胞
	<ol>
		<li>使用光学显微镜在20倍放大倍数下观察甲苯胺蓝染色的组织切片图2).</li>
		<li>统计可视化区域内肥大细胞的总数，并区分未脱颗粒和已脱颗粒的肥大细胞。某些情况下可能需要使用40倍放大倍数以确认肥大细胞的颗粒状态。 
		注：未脱颗粒的肥大细胞表现出明显的异染性，细胞核轮廓不明显或几乎不可见，且细胞周围无或仅有微弱的颗粒外排现象。脱颗粒的肥大细胞异染性减弱，细胞核轮廓清晰可见，且胞质内或细胞边界外可见游离颗粒。</li>
		<li>继续评估当前组织切片中全部未脱颗粒和已脱颗粒肥大细胞的总数。在至少另外7个独立的切片上重复此操作，覆盖每份组织的全长。</li>
		<li>根据以下公式计算每份组织/每只小鼠中脱颗粒（DG）肥大细胞占总肥大细胞的百分比：（DG 肥大细胞数 / 总肥大细胞数）× 100。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了采用新生儿期应激（NMS）诱导成年雄性小鼠出现慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）相关症状的方法。成年期的NMS小鼠表现出显著的生殖器周围机械性异常性疼痛，以及前列腺组织中肥大细胞脱颗粒的证据。使用NMS建立CP/CPPS临床前模型是一种新颖的方法，因为它模拟了CP/CPPS患者常报告的早期生命应激12-14，同时采用非侵入性诱导方式，而非更常用的化学或免疫诱导的前列腺炎症34,36-39。此外，已有研究表明，小鼠的NMS可导致共病症状，包括焦虑样行为和快感缺失行为的改变、排尿频率增加以及后爪感觉过敏（16；数据未显示），这与CP/CPPS患者表现出的共病性躯体、情绪及内脏功能障碍相似4-6。
使用新生期母体分离（NMS）在小鼠中诱导慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的主要优势在于，它通过心理干预引发生理变化。CP/CPPS患者的病因具有异质性，大多数情况下并不涉及前列腺的既往感染或直接损伤1-3。尽管如此，已发表的CP/CPPS动...

慢性盆腔疼痛本身并非一种疾病，而是一个术语，用于描述被诊断为肠易激综合征（IBS）、间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/PBS）、外阴痛或慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的患者所经历的持续性自发性疼痛和/或诱发性疼痛。这些综合征常合并存在，且具有许多共同特征，例如均无明确的相关病理改变或已知的潜在病因，尽管已有研究表明免疫系统、中枢神经系统及周围神经系统的功能障碍可能参与了这些疾病的发生与进展1-3。患有慢性盆腔疼痛的患者更可能出现其他非盆腔相关的功能性疼痛障碍及情绪障碍症状，包括焦虑、抑郁和惊恐障碍4-6，这些症状与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能改变相关7-10。早年生活压力或创伤是导致HPA轴异常及相关的慢性疼痛综合征的重要危险因素10,11，因此，相当一部分功能性盆腔疼痛障碍患者报告曾经历过虐待或忽视等不良童年事件12-14。
在过去的二十年中，新生期母鼠分离（NMS）动物模型被广泛用于研究生命早期应激的影响，该模型在断奶前特定时期将幼鼠从母鼠身边移开一段时间。通常情况下，NMS 可通过直接影响下丘脑内的基因表达以及干扰边缘系统结构的下游调控，增强下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的激活，从而导致类似焦虑的行为15-18。已有研究表明，HPA 轴功能的紊乱可导致 NMS 啮齿类动物模型出现结直肠19-22和阴道16敏感性增加；然而，尽管对出生后膀胱炎症的长期影响已有广泛表征23-25，早期生命应激对泌尿生殖器官的影响在很大程度上仍未得到充分研究。因此，本研究将介绍如何在小鼠中实施 NMS，并进一步评估其生殖器周围机械敏感性以及前列腺中肥大细胞的浸润与活化情况，以验证雄性 NMS 小鼠作为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）临床前模型的适用性。
在所有已诊断的慢性盆腔疼痛疾病中，慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）可能是认知度最低且特征最不明确的综合征，尽管其终生患病率约为14%&#160;26，患者每年的医疗费用估计达4,400美元（是下背痛或类风湿性关节炎的两倍27）。CP/CPPS患者报告的疼痛部位包括会阴、直肠、前列腺、阴茎、睾丸和/或腹部28，其心理压力程度高于对照组患者29，且常伴有其他共病性慢性盆腔疼痛或情绪障碍的症状，或被同时诊断出患有这些疾病5,29-31。反复感染、上皮屏障通透性增加、神经源性炎症和自身免疫均被推测为CP/CPPS的潜在病因2,32,33，肥大细胞的活化与脱颗粒也被认为可能参与其中34。患有CP/CPPS的男性其前列腺液中肥大细胞类胰蛋白酶和神经生长因子（NGF）水平升高34，后续研究进一步证实，类胰蛋白酶以及羧肽酶A（CPA3，肥大细胞活化的标志物）在CP/CPPS患者的尿液中也显著升高35。肥大细胞在CP/CPPS发病与持续过程中的潜在作用，迄今已成为该综合征动物研究的主要焦点。目前研究CP/CPPS最常用的啮齿类动物模型是实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）模型，该模型通过皮下注射前列腺抗原与完全弗氏佐剂制备，可导致不同程度的前列腺炎症，炎症程度因所用物种和品系而异34,36-39。研究表明，EAP诱导后肥大细胞的浸润及活化/脱颗粒现象增加34,35,40。缺乏肥大细胞的转基因小鼠34或缺乏类胰蛋白酶受体PAR2的转基因小鼠35在EAP诱导后不会出现前列腺触痛敏感，而野生型EAP小鼠则会出现。尽管该临床前模型复制了人类CP/CPPS的多种特征，但其诱导方案并不能代表人类疾病的实际情况，因为人类CP/CPPS病因多样，且通常并不涉及前列腺的直接炎症、感染或损伤。
早期生活压力对人类慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）发展的影响在很大程度上尚未得到充分研究；然而，Hu 的一项研究显示， 等41,&#160;研究表明，有童年期身体、情感和/或性虐待史的男性出现提示慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）症状的可能性显著增加。此外，研究还显示，有身体和情感虐待史的患者其疼痛和排尿评分均升高。我们先前已证实，在雌性C57BL/6小鼠中采用相同的非伤害性应激（NMS）范式可导致阴道过度敏感，以及阴道和膀胱中出现异常基因表达，提示下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能失调。16这一证据，加上慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）患者常伴有其他共病的高发率42包括间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征（IC/PBS）和情绪障碍，这些疾病已被更明确地证实与早期生活压力暴露相关12-14为使用NMS模型研究小鼠的慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）提供了理论依据。

<table><tbody><tr><td>妊娠 C57BL/6 雌性小鼠&amp;nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>应每日监测定时或非定时妊娠雌鼠，以观察其在本单位内分娩情况。</td></tr><tr><td>2 L 玻璃烧杯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10002L</td><td>每窝新生小鼠在整个 21 天分离期间应始终置于同一烧杯中。</td></tr><tr><td>VWR 强制通风培养箱，基础型</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>培养箱应维持在 33&amp;deg;C 和 50% 湿度。</td></tr><tr><td>触觉测试感觉评估仪，20 套装（Semmes-Weinstein Von Frey 麻醉计用于触觉评估）</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>以下单丝应被用于会阴部敏感性评估：1.65 g、2.36 g、2.83 g、3.22 g、3.61 g、4.08 g、4.31 g 和 4.74 g。</td></tr><tr><td>动物饲养盒（可容纳 12 只小鼠或 6 只大鼠）</td><td>IITC</td><td>435</td><td>务必在单个丙烯酸动物饲养盒顶部放置重物，以防止小鼠逃逸。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠和大鼠用网架（可容纳 12 只小鼠或 6 只大鼠）</td><td>IITC</td><td>410</td><td>将网架放置于稳固的台面上，以便于操作。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>将 10x PBS 储存液稀释为 1x PBS。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>需要配制 4% 多聚甲醛溶液，用于小鼠心脏灌注及组织后固定，为肥大细胞染色做准备。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>将固定组织在 30% 蔗糖溶液中于 4&amp;deg;C 下过夜进行冷冻保护。</td></tr><tr><td>庚烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td>将庚烷置于干冰上冷却，以冻结组织。</td></tr><tr><td>标准冷冻模具&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>用于协助在冷冻切片前冻结前列腺组织</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>经生物染色剂委员会认证，适用于肥大细胞的异染性染色。</td></tr><tr><td>乙醇，绝对乙醇（200 证明）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>分子生物学级，Fisher Bioreagents；在观察肥大细胞前，需要使用 95% 和 100% 溶液对染色后的冷冻切片进行脱水。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>酸化 NaCl 溶液应在染色冷冻切片前新鲜配制。</td></tr><tr><td>GeneMate 无菌 50 ml 离心管&amp;nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>一次性试管，用于混合甲苯胺蓝组分或将载玻片浸入 1xPBS 中。</td></tr><tr><td>可容纳 10 张载玻片的 Coplin 染色缸，带磨砂玻璃盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>最多可容纳 10 张标准尺寸 3 x 1 英寸（75 x 25 mm）载玻片，背对背放置。分别使用不同的染色缸盛装甲苯胺蓝工作液、95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯。</td></tr><tr><td>二甲苯（组织学用）</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>组织脱水后需用二甲苯进行透明处理。</td></tr><tr><td>显微载玻片盒，100 片装</td><td>VWR International</td><td>82003</td><td>可用于载玻片的储存和运输。</td></tr><tr><td>Fisherbrand 显微载玻片盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>此类载玻片盒通常足够小，可放入冷冻切片机中。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>甘油是一种传统的封片介质。</td></tr><tr><td>封片介质，Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>封片介质可牢固地将盖玻片粘附于载玻片上。</td></tr><tr><td>矩形显微盖玻片，1 号</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>在脱水和透明处理后的组织上加盖盖玻片，以保护样本。</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>我们实验室使用的 Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i 已停产，由 Eclipse Ni-E 取代。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

新生儿期母体分离小鼠模型中肛周感觉敏感性及前列腺肥大细胞活化的评估

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的终生患病率为14%，是50岁以下男性最常见的泌尿系统诊断疾病，然而它却是最不被了解且研究最少的慢性盆腔疼痛障碍。相当一部分慢性盆腔疼痛患者报告曾经历过早年生活压力或虐待，这些经历可能显著影响下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的功能与调节。肥大细胞活化在CP/CPPS患者的尿液和前列腺按摩液中均被发现增强，而该过程部分受到HPA轴下游激活的调控。新生期母体分离（NMS）已被用于啮齿类动物模型中研究早年生活压力的影响达二十多年，包括对HPA轴功能和内脏敏感性的改变。本文提供了一项详细的实验方案，介绍如何使用NMS作为雄性C57BL/6小鼠中CP/CPPS的临床前模型。我们描述了实施NMS的操作方法、评估生殖器周围机械性异常性疼痛以及肥大细胞活化的组织学证据的方法。此外，我们还提供了证据表明，早期心理应激可对小鼠雄性泌尿生殖系统产生长期影响。

经历新生儿母体分离（NMS）的小鼠表现出与慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）相关的行为学证据。在使用一系列强度递增的冯·弗雷单丝纤维进行测试时，8周龄的NMS小鼠（n = 4）与未受干预的对照组小鼠相比，表现出明显的会阴区机械性异常性疼痛（图2）（n = 5）。表现为诱发阳性行为反应的机械缩足阈值显著降低（p &lt; 0.01；学生t检验）。阳性行为反应记录为单丝刺激后迅速的抽动或跳跃，或对单丝出现舔舐或啃咬行为。
暴露于NMS的小鼠也表现出慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的组织学证据。前列腺组织的冰冻切片经酸性甲苯胺蓝染色，以观察肥大细胞内储存的类胰蛋白酶颗粒（图3A-D显示活化迹象的肥大细胞百分比， 例如， 弥散性异染性，细胞边界外存在颗粒（图3D），与未处理的对照组小鼠相比，在8周龄NMS小鼠的前列腺组织中显著升高p &lt; 0.0001，学生t检验， 图3E</str...

我们正在测量经历早期生活应激范式——新生儿期母体分离的雄性C57BL/6小鼠前列腺中的会阴部机械敏感性及肥大细胞活化情况，以建立慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的临床前模型。

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的终生患病率为14%，是45岁以下男性最常见的泌尿系统诊断疾病。

以下实验的总体目标是通过检测经历新生儿期母体分离的雄性C57黑六小鼠生殖器周围机械敏感性及前列腺内肥大细胞的活化情况，来确定早期生命应激对泌尿生殖系统的影响。首先，对C57黑六小鼠幼崽进行连续20天的新生儿期母体分离操作，以诱导早期生命应激。第二步是通过将一系列Von Frey单根纤维丝施加于生殖器周围区域，测量其机械敏感性。接下来对小鼠前列腺的冷冻切片进行酸性品红-亮甲苯蓝染色，以定量分析肥大细胞的活化情况。结果表明，根据我们的行为学和组织学分析，新生期母体分离可增加生殖器周围机械敏感性和前列腺肥大细胞的活化。与现有的实验性自身免疫性前列腺炎等方法相比，该技术的主要优势在于其在早期发育阶段引入了应激暴露，从而在生命后期诱发症状，这与慢性前列腺炎患者中观察到的情况相似。该方法有助于解答慢性盆腔疼痛领域中的关键问题，例如早期生活应激对行为的影响，并提供疼痛状态改变的组织学证据。尽管该方法可用于研究慢性前列腺炎，也可应用于其他功能性疼痛综合征，如间质性膀胱炎、膀胱疼痛综合征、外阴痛、纤维肌痛或偏头痛。它甚至可应用于其他常见的心理共病，如焦虑和抑郁。出生后第二天，将母鼠从其家笼中移出，并将其放入一个干净的次级容器中。用戴有洁净手套的手揉搓一把垫料，以保留家笼的气味，然后将家笼垫料中1至2厘米厚的垫料转移至一个干净且适当标记的2升玻璃烧杯中。此外，将家笼中现存的其他丰容垫料材料（如筑巢垫片或皱纹纸）约一半的量单独添加至该玻璃烧杯中。随后，将同一窝的所有幼鼠放入已准备好的烧杯中，并立即将烧杯置于33摄氏度、50%湿度的环境中持续180分钟。在分离孵育期间，将母鼠从次级容器中移出，并放回其家庭笼具中。将家庭笼具放回动物房内指定的饲养位置。分离期结束后，取回家庭笼具并移出母鼠，将其放入一个干净的次级容器中。然后将烧杯从培养箱中取出，用戴好洁净手套的双手之间撒入少量垫料，以在处理仔鼠时保持其原笼的气味。轻轻地将仔鼠逐个从烧杯转移至原笼，并将烧杯中剩余的垫料和丰容物一并放回原笼。待所有仔鼠均返回后，将母鼠从次级容器转移至原笼，并将原笼放回动物房内指定的饲养位置。对每窝接受新生儿期母体分离的小鼠，从出生后第1天至第21天每天重复此完整操作流程。随后将幼鼠断奶，并在实验期间将其饲养在与对照组小鼠相同的条件下。准备测试区域时，在高度为55厘米的带孔金属网顶桌下方放置吸水垫。该操作台应提供足够的空间，以便研究人员从下方接近时不会惊扰小鼠。将最多12只八周龄小鼠分别置于金属网操作台上方透明带孔的塑料罩内。在罩子上方放置重物，以防止小鼠逃逸。握住一个三点22克von Frey纤维丝的基部，并露出回缩的单丝纤维。将探针放置成垂直方向。当小鼠处于清醒、静止状态，且其体重均匀分布在两只后肢之间时。将单丝纤维施加于阴囊左侧或右侧，避免接触中线，直至观察到纤维出现轻微弯曲。保持单丝纤维位置10秒，或直至动物出现阳性反应，例如迅速抽动、跳跃，或朝向单丝纤维的舔舐或啃咬行为。若小鼠在10秒的单丝纤维刺激期间未发生移动，也未表现出任何阳性反应，则记录为阴性反应。对所有小鼠使用相同规格的单丝纤维进行测试后，再更换为下一个合适的单丝纤维。根据每次测试结果，选择下一档更粗或更细的单丝纤维，继续对每只小鼠进行额外四次测试。首次观察到阳性反应后，解剖并取9周龄小鼠的前列腺组织，将其制成7微米厚的冷冻切片。接着，通过将1克甲苯胺蓝O加入100毫升70%乙醇中，配制1%甲苯胺蓝储备液，并涡旋混合至完全溶解。将储备溶液在室温下保存，最长可达三周。在另一个烧杯中，将一克氯化钠加入置于搅拌器上的 100 毫升水中。使用 12 摩尔盐酸调节盐溶液的 pH 值，直至达到 0.5 至 1.0 的 pH 范围。然后通过将8毫升乌定蓝储备液与32毫升酸性1%氯化钠溶液混合，配制0.25%酸化乌定蓝工作液。反复吹打使其充分混匀，并使用涡旋振荡器混合。每批玻片均需新鲜配制工作液。用PBS清洗组织切片时，将玻片逐个浸入含有足量PBS的50毫升锥形管中，浸泡约1秒钟，确保PBS完全浸没组织。 将载玻片置于纸巾上自然晾干。随后将载玻片放入盛有足量0.25%甲苯胺蓝工作液的玻璃染色缸中，确保组织切片完全浸没。将载玻片置于转速为15 RPM的水平摇床中孵育10至15分钟。然后将载玻片浸入 PBS 中约一秒钟，以洗去多余的酸性品红，随后将载玻片放入染色片盒中，使载玻片侧立放置，以便于液体排出。将载玻片在 37 摄氏度的烘箱中干燥至少两小时，或在室温下过夜干燥。干燥后，将切片浸入95%乙醇中约一秒钟，然后让组织切片完全干燥。重复此步骤1至10次，直至组织呈现的蓝色多于紫色。接着，将切片浸入100%乙醇中约一秒钟，并让切片完全干燥。重复此步骤一到十次，直至组织呈现深蓝色至中等蓝色，但不可为紫色。最后，将切片在100%二甲苯中孵育三分钟以固定染色。待其干燥后，用甘油-PBS或基于二甲苯的永久封片介质封片。吸去多余的培养基，将制备好的载玻片在室温下保存。使用Von Frame单丝纤维系列进行测试时，与未受干预的对照组小鼠相比，8周龄的新生期母体分离小鼠表现出会阴区机械性异常性疼痛。这表现为引发阳性行为反应的机械性缩足阈值显著降低。慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的其他证据可通过组织学观察得到，此处显示的是前列腺组织的冰冻切片，经酸性化甲苯胺蓝染色以观察肥大细胞内的类胰蛋白酶颗粒。在新生期分离小鼠的前列腺切片中，观察到脱颗粒肥大细胞的比例显著升高，与未处理小鼠相比尤为明显。在进行新生期母体分离操作时，需注意保持家笼气味，以避免母鼠排斥幼崽。完成此操作后应遵循相应后续步骤。其他方法，如旷场实验或双选择液体偏好实验，可用于评估共病性情绪障碍的行为学证据。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估生殖器周围机械敏感性及前列腺肥大细胞活化，以此作为慢性前列腺炎及新生期母体分离小鼠模型的行为学和组织学证据。

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