新生儿期母体分离小鼠模型中肛周感觉敏感性及前列腺肥大细胞活化的评估

以下实验的总体目标是通过检测经历新生儿期母体分离的雄性C57黑六小鼠生殖器周围机械敏感性及前列腺内肥大细胞的活化情况，来确定早期生命应激对泌尿生殖系统的影响。该目标首先通过对C57黑六小鼠幼崽进行连续20天的新生儿期母体分离操作，以诱导早期生命应激。第二步是通过将一系列Von Frey单根纤维丝施加于生殖器周围区域，测量其机械敏感性。

接下来对小鼠前列腺的冷冻切片进行酸性品红染色，以定量分析肥大细胞的活化情况。结果表明，根据我们的行为学和组织学分析，新生期母体分离会增加生殖器周围机械敏感性和前列腺肥大细胞的活化。

与现有的实验性自身免疫性前列腺炎等方法相比，该技术的主要优势在于其在早期发育阶段引入了应激暴露，从而在生命后期诱发症状，类似于慢性前列腺炎患者中所观察到的情况。该方法有助于回答慢性盆腔疼痛领域中的关键问题，例如早期生活应激对行为的影响，并提供疼痛状态改变的组织学证据。尽管该方法可用于研究慢性前列腺炎，也可应用于其他功能性疼痛综合征，如间质性膀胱炎、膀胱疼痛综合征、外阴痛、纤维肌痛或偏头痛。

它甚至可应用于其他常见的心理共病，例如焦虑和抑郁。出生后第二天，将母鼠从其家笼中移出，并将其放入一个干净的次级容器中。用戴有洁净手套的手揉搓一把垫料，以保留家笼的气味，然后将家笼垫料中1至2厘米厚的垫料转移至一个干净且适当标记的2升玻璃烧杯中。此外，将家笼中现存的其他丰容垫料材料（如垫巢物或皱纸）约一半的量单独添加至该玻璃烧杯中。随后，将同一窝的所有幼鼠放入已准备好的烧杯中，并立即将烧杯置于33摄氏度、50%湿度环境中持续180分钟。

在分离孵育期间，将母鼠从次级容器中移出，并放回其家庭笼具中。将家庭笼具放回动物房内指定的饲养位置。分离期结束后，取回家庭笼具并移出母鼠，将其放入一个干净的次级容器中。

然后将烧杯从培养箱中取出，用戴好洁净手套的双手之间撒入少量垫料，以在处理仔鼠时保持其原笼盒的气味。轻轻地将仔鼠逐个从烧杯转移至原笼盒中，并将烧杯内剩余的垫料和 enrichment 物品一并放回原笼盒。待所有仔鼠均返回后，将母鼠从次级容器转移至原笼盒，并将笼盒放回动物房内指定的饲养位置。

对每窝接受新生儿期母体分离的小鼠，从出生后第1天至第21天每天重复此完整操作流程。随后将幼鼠断奶，并在整个实验期间将其饲养在与对照组小鼠相同的条件下。通过在高度为55厘米的带网孔金属顶桌下方放置吸水垫，准备测试区域。

该操作台应提供足够的空间，以便实验人员能够从下方接近小鼠，而不会惊扰到它们。将最多12只八周龄小鼠分别单独放置在置于金属网操作台上的透明带孔塑料罩内。在罩子上方放置重物，以防止小鼠逃逸。

握住一个三点22克von Frey纤维丝的基部，并露出回缩的单丝纤维。将探针放置成垂直方向。当小鼠处于清醒、静止状态，且其体重在两只后足之间均匀分布时。

将单丝纤维施加于阴囊左侧或右侧，避免接触中线，直至观察到纤维出现轻微弯曲。保持单丝纤维位置不动持续10秒，或直至动物出现阳性反应，例如迅速抽动、跳跃，或朝向单丝纤维的舔舐或啃咬行为。若小鼠在10秒的单丝纤维刺激期间未发生移动，也未表现出任何阳性反应，则记录为阴性反应。对所有小鼠使用相同规格的单丝纤维进行测试后，再更换为下一个合适的单丝纤维。

根据前一次测试结果，选择相应更粗或更细的单根尼龙丝，继续对每只小鼠进行额外四次测试。首次观察到阳性反应后，解剖并从9周龄小鼠中获取固定后的前列腺组织，将其切成7微米厚的冷冻切片。接着，通过将1克甲苯胺蓝O加入100毫升70%乙醇中，配制1%甲苯胺蓝储备液，并涡旋混合物直至完全溶解。

将储备液在室温下保存，最长可达三周。在另一个烧杯中，将一克氯化钠加入置于搅拌器上的 100 毫升水中。使用 12 摩尔盐酸调节盐溶液的 pH 值，直至 pH 范围达到 0.5 至 1.0。

然后，通过将8毫升乌丁蓝储备液与32毫升酸性1%氯化钠溶液混合，配制0.25%酸化乌丁蓝工作液。反复吹打混匀，确保乌丁蓝储备液完全混入，并使用涡旋振荡器混合。每批玻片均需新鲜配制工作液。用PBS清洗组织切片时，将玻片逐个浸入含有足量PBS的50毫升锥形管中，浸泡约1秒钟，确保PBS完全浸没组织。

将载玻片置于纸巾上自然晾干。随后将载玻片放入盛有足量0.25%甲苯胺蓝工作液的玻璃染色缸中，确保组织切片完全浸没。将载玻片置于转速为15 RPM的水平摇床上孵育10至15分钟。

然后将载玻片浸入 PBS 中约一秒钟，以洗去多余的酸性品红，随后将载玻片放入载玻片盒中，使其侧立放置，以便沥干。将载玻片在 37 摄氏度的烘箱中干燥至少两小时，或在室温下过夜干燥。

干燥后，将切片浸入95%乙醇中约一秒钟，然后让组织切片完全干燥。重复此步骤1至10次，直至组织呈现的蓝色多于紫色。接着，将切片浸入100%乙醇中约一秒钟，并让组织切片完全干燥。

重复此步骤一到十次，直至组织呈现深蓝色至中等蓝色，但不得变为紫色。最后，将切片在100%二甲苯中孵育三分钟以固定染色。待其干燥后，用甘油-PBS或基于二甲苯的永久封片介质封片。

吸除多余的培养基，将制备好的载玻片于室温下保存。使用Von Frame单丝纤维系列进行测试时，与未受干预的对照组小鼠相比，经历新生期母体分离的8周龄小鼠表现出生殖器周围机械性异常性疼痛。这表现为引发阳性行为反应的机械性缩足阈值显著降低。

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的其他证据可在组织学上观察到，图中显示的是前列腺组织的冰冻切片，经酸化甲苯胺蓝染色以观察肥大细胞内的类胰蛋白酶颗粒。与未处理小鼠相比，在新生期分离小鼠的前列腺切片中观察到显著更高比例的脱颗粒肥大细胞。在进行新生期母体分离操作时，重要的是要保持家笼的气味，以避免母鼠排斥幼崽。完成此操作后。

其他方法，如旷场实验或双选择液体偏好实验，可用于评估共病性情绪障碍的行为学证据。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估生殖器周围机械敏感性及前列腺肥大细胞活化，以此作为慢性前列腺炎及新生期母体分离小鼠模型的行为学和组织学证据。