前列腺癌患者产生派生异种移植模型从循环肿瘤细胞

这份手稿详细介绍了一种用于从循环肿瘤细胞 （CTC） 生成前列腺癌患者来源的异种移植物 （PDX） 的方法。从 CTC 生成 PDX 模型为研究前列腺癌提供了另一种实验模型;男性最常被诊断出的肿瘤，也是癌症死亡的常见原因。

以下方案的总体目标是产生前列腺癌。患者从循环肿瘤细胞中提取异种移植物。这是通过首先从晚期前列腺癌患者那里采集外周血来实现的。

作为第二步，分离血液单核细胞区室，其中包含循环肿瘤细胞。接下来，用 CD 45 ZI 抗体对单核细胞进行染色，以便使用流式细胞术选择循环肿瘤细胞，然后将细胞注射到免疫功能低下的小鼠中。结果显示，基于注射通过流式细胞术从前列腺癌患者外周血中分离的循环肿瘤细胞，产生前列腺癌异种移植物。

该方法可以通过生成可用于前列腺癌分子表征和开发新生物标志物的新实验模型来帮助回答前列腺癌领域的关键问题。演示该程序的是实验室的学生 Williams 和西奈山肿瘤科的研究员 Omada。首先从选定的转移性前列腺癌患者中收集全血，因为他们的外周血中可能含有大量循环肿瘤细胞。使用 10 mL血清移液管将全血与 Hank 平衡盐溶液一起转移到 50 mL聚苯乙烯锥形管中。

以一比一的比例，轻轻移液混合物以使其均质化。接下来，将 15 mL FI 检出液添加到空的 50 mL 聚苯乙烯锥形管中。轻轻移取 20 毫升稀释的全血，使用溶液顶部的最低设置形成明显的顶层。

然后将试管以 400 Gs 离心 30 分钟。在室温下，将离心机的减速设置为最低设置，以防止分离后溶液混合。离心后，鉴定夹在血浆顶层和分离溶液之间的外周血单核细胞和循环肿瘤细胞的细、白色、灰色条纹。

在试管底部，小心地从白灰色条纹中收集细胞，并将它们转移到 50 毫升聚苯乙烯管中。使用塑料移液管，然后加入 Hank's。将盐溶液平衡到分离的细胞中，总体积为 10 mL。

在室温下以 400 Gs 再次离心混合物 10 分钟。为了洗涤细胞，去除上清液并重复洗涤。再迈出一步。

第二次洗涤后，弃去上清液。将剩余的沉淀悬浮在 5 ml 红细胞裂解缓冲液中，并在室温下孵育溶液 5 分钟。接下来，在室温下以 400 Gs 离心样品 3 分钟，然后弃去上清液去除裂解缓冲液。

最后，在染色前，将沉淀重悬于补充有 10% 胎牛血清的 1 毫升 PBS 中。在血液、细胞仪或自动细胞计数仪上使用标准 trian 蓝排除方法定量活细胞的数量。然后在含 10% FBS 的 PBS 中将细胞稀释至每毫升 100 万个细胞，并将它们置于冰上 1 小时。

为了阻断非特异性结合，将细胞悬液分配到两个单独的试管中。在对照管中标记一个用于对照细胞的试管和一个用于 CD 45 染色细胞的试管。添加 IgG one Kappa Zi，稀释度为 1 至 250，终浓度为 10 ng/mL。

在 CD 45 染色管中。加入相同浓度（10 ng/mL）的 CD 45 ZI 偶联一抗，并将细胞悬液在冰上孵育 30 分钟。接下来，将细胞在 4 摄氏度下以 400 G 离心 3 分钟，然后丢弃 snat。

将每个沉淀悬浮在补充有 10% FBS 的无菌 PBS 中，然后在 4 摄氏度下以 400 G 离心 3 分钟，洗涤细胞两次。洗涤复苏器后，将细胞悬浮在每毫升含有 10 微克 dappy 染色剂的 1 毫升 PBS 溶液中。通过 35 微米过滤器帽将最终溶液过滤到 12 毫米 x 75 毫米的聚苯乙烯管中，以排除任何细胞团块或碎屑。

然后使用荧光激活细胞分选从悬浮液中排除 CD 45 阳性细胞和死细胞，以去除它们，如随附的文本方案中所述。将分选的前列腺肿瘤细胞悬液与细胞外基质蛋白以一比一的比例混合，并将混合物置于冰上。接下来，根据机构指南，在每分钟 1 升氧气中使用 5% 吸入异氟，麻醉 8 至 10 周龄的男性免疫缺陷口腔。

通过检查小鼠的角膜和脚趾反射是否消失，确保适当的麻醉。使用 250 号针头和 1 毫升注射器吸取 25 微升细胞悬液。然后通过每周触诊小鼠注射部位以生长皮下结节密度，将整个体积的细胞外基质细胞悬液皮下注射到小鼠监测肿瘤的两个上侧

基于本协议中使用的阴性选择方法，有必要使用 DAPI 染色排除死细胞。如此处所示，来自剩余活细胞的 CD 45 阴性细胞的百分比是可变的，取决于患者的肿瘤负荷，但很容易与 CD 45 阳性细胞分离。当使用适当的门控时，在植入前列腺肿瘤细胞悬液后，皮下结节密度将在小鼠的两侧变得可见。

每个结节密度代表异种移植物的生长，并且可以被理解为与健康组织不同，因为它从小鼠的背侧肌肉组织突出并且质地更坚硬。由循环肿瘤细胞生成的患者来源的异种移植模型概括了通过血红、toin 和伊红染色以及通过免疫组化对前列腺特异性细胞标志物（如雄激素受体和前列腺特异性膜抗原）所见的人前列腺肿瘤。可以进行其他方案，如基因或蛋白质表达分析，以探索导致前列腺癌侵袭性的细胞和分子机制。