Name: 前列腺癌患者产生派生异种移植模型从循环肿瘤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解从循环肿瘤细胞生成前列腺癌患者来源异种移植模型的方法。本方案通过流式细胞术分离CTCs并植入免疫缺陷小鼠，为前列腺癌分子特征研究和新生物标志物开发提供可靠的实验模型。

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我们感谢西奈山医学中心流式细胞术共享资源平台的Jordi Ochando博士在流式细胞术分析方面的协助。我们感谢西奈山医学中心显微成像共享资源平台的Rumana Huq博士在成像方面的技术支持。作者感谢TJ Martell基金会对本项目的资助与支持。

本方案已在本机构实施，并获得了机构研究伦理委员会的批准，符合所有机构、国家和国际关于人类福祉的指南。
1. 晚期前列腺癌患者外周血的采集
注意：选择转移性前列腺癌患者。获取患者的书面知情同意，并记录患者的临床特征，包括分离时的年龄、既往化疗和激素治疗情况。转移性疾病的患者外周血中可能存在最高浓度的循环肿瘤细胞&#160;。
<ol>
	<li>在获得知情同意并遵循经机构审查委员会批准的适当方案后采集血样。整个操作过程中需佩戴乳胶手套并穿上实验服。</li>
	<li>将25 G&#160;蝶形针与导管连接至针柄。使用酒精棉片清洁上臂与前臂之间肘正中静脉区域，然后在患者上臂绑扎止血带。</li>
	<li>将蝶形针插入肘正中静脉，推动采血管进入针柄以开始采血。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管收集约10 ml&#160;血液，以防止凝血。</li>
	<li>从患者身上移除蝶形针，并用无菌纱布垫在静脉穿刺部位施压1分钟。随后用无菌绷带覆盖该部位。</li>
</ol>
2. 单个核细胞的分离
注意：从步骤1收集的血液除单核循环肿瘤细胞（CTCs）外，还将含有外周血单个核细胞（PBMCs）（例如，&#160;淋巴细胞和单核细胞）。
<ol>
	<li>用5 ml血清移液管将全血移入50 ml聚苯乙烯锥形管中，并以1:1比例加入Hanks平衡盐溶液（HBSS）。轻轻吹打混合液以混匀。</li>
	<li>向一个空的50 ml聚苯乙烯锥形管中加入15 ml商品化溶液（Ficoll-Paque），用于通过低速密度梯度离心法分离血液成分。</li>
	<li>将步骤2.1中的全血与HBSS混合液轻轻吹打，加入步骤2.2的聚苯乙烯管中，形成明显的上层液层。将移液器调至最低档位以最小化溶液混合，从而确保有效的分离。</li>
	<li>在室温下以 400 x g 离心 30 分钟&#160;（25 °C）。将减速设为最低档，以防止分离后溶液混合。加速度可设为任意速度。</li>
	<li>离心后，识别位于管中上层血浆与底部分离液之间的薄层白色至灰白色条带，即为 PBMCs 与 CTCs 的夹层。</li>
	<li>从步骤2.5中的灰白色条带收集细胞，使用塑料移液管将其转移至一个50 ml聚苯乙烯管中。</li>
	<li>向含有PBMCs和CTCs的50 ml聚苯乙烯圆锥形管中加入HBSS，于室温下以400 × g离心10 min&#160;洗涤。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于50 ml HBSS中，在室温下以400 × g离心3分钟以洗涤。</li>
	<li>弃去上清液，用5 ml红细胞裂解缓冲液重悬剩余沉淀，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在室温下以 400 x g 离心 3 分钟，去除红细胞裂解缓冲液。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 1 ml PBS 1x 中&#160;添加10%胎牛血清（FBS）以封闭，再进行抗体染色。</li>
</ol>
3. 使用CD45-FITC抗体对单个核细胞进行染色以进行荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
	<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对存活细胞（台盼蓝染色阴性细胞，来自步骤2.11）数量进行定量。制备浓度为1 × 10⁶ cells/mL的细胞悬液。6 细胞/ml 悬液（在 PBS 1× 中）&#160;含10% FBS）并置于冰上1小时。</li>
	<li>将上一步定量的细胞悬液分装至两个试管中，标记为对照和CD45染色。</li>
	<li>在对照管中加入IgG1κ-FITC（2.5 µg/ml），稀释比例为1:250。在CD45染色管中加入CD45 FITC（2.5 µg/ml）偶联的一抗，稀释比例为1:250，将细胞悬液置于冰上孵育30分钟。CD45抗原标记用于排除造血细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀用含10% FBS的无菌1×PBS重悬，4 °C、400 × g离心3 min，重复洗涤两次。</li>
	<li>用1 ml 1× PBS溶液重悬细胞&#160;含浓度为10 µg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</li>
	<li>将最终溶液通过35 µm滤膜帽过滤至12 mm × 75 mm聚苯乙烯管中。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分离前列腺循环肿瘤细胞
注意：利用流式细胞仪收集活的 CD45 阴性循环肿瘤细胞（CTCs）。
<ol>
	<li>使用标记为“Control”的试管中的细胞设置补偿对照。</li>
	<li>利用适当的前向散射和侧向散射参数，建立门控以排除碎片和细胞聚集体。</li>
	<li>使用标记为“CD45-FITC”的试管中的细胞悬液建立FITC门控。</li>
	<li>通过Pacific Blue-A通道对活细胞（DAPI阴性）进行门控。</li>
	<li>将CD45阴性细胞群收集至含有2 ml添加10% FBS的RPMI 1640培养基的无菌15 ml聚苯乙烯圆锥形试管中。</li>
	<li>将分选后的前列腺肿瘤细胞悬液以400 × g离心3分钟，然后将沉淀重悬于200–500 µl&#160;含10% FBS的RPMI培养基中。</li>
</ol>
5. 将循环肿瘤细胞注射入小鼠及异种移植瘤生长的监测
注意：所有动物实验操作均须遵守机构动物护理委员会批准的方案。本方案已在本机构开展，所依据的动物使用方案已获得本机构动物护理委员会批准，并符合所有相关监管机构和机构的规定、法规及指南。
<ol>
	<li>将分选后的前列腺肿瘤细胞悬液与细胞外基质按1:1比例混合，并置于冰上。</li>
	<li>在皮下植入前，使用含5%（v/v）异氟烷（以1 L/min氧气为载体）的麻醉舱对小鼠进行麻醉。通过检查小鼠角膜反射和脚趾反射是否消失，确认麻醉效果充分。</li>
	<li>使用25 G针头和1 ml注射器，将250 µl前列腺肿瘤细胞与细胞外基质的混合悬液皮下注射至8–10周龄雄性免疫缺陷小鼠双侧上背部。无论循环肿瘤细胞（CTC）浓度如何，均注射250 µl，因注射体积是关键参数。&#160;小鼠皮下给药最大体积不超过1 ml。 &#160;</li>
	<li>通过每周触诊小鼠注射部位以监测皮下结节性肿块的生长情况，并每周两次测量小鼠体重，进行动物监测。</li>
	<li>当肿瘤最大直径超过0.5 cm但小于1 cm时，采用二氧化碳窒息法处死小鼠，随后行颈椎脱位，并收获皮下生长的人源前列腺癌异种移植瘤，以确保获得足够的肿瘤组织用于分子分析和连续传代。若小鼠出现痛苦体征或体重减轻达15%，即使未触及肿瘤，也应立即处死。&#160;</li>
</ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%2C+detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+cancer+journal+for+clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics , 2013.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植（PDX）模型的方法。使用CTCs建立PDX 与现有方法相比，模型具有若干潜在的重要优势。首先，通过外周血可便捷地收集循环肿瘤细胞（CTCs），从而能够从同一患者在不同疾病阶段建立实验模型。其次，与需要通过手术获取肿瘤细胞的现有方法相比，血液采集是一种更安全且成本较低的肿瘤细胞分离方法。
已报道多种循环肿瘤细胞（CTC）富集方法，但由于经费和资源限制，许多方法并非所有实验室均可采用。我们旨在本实验室建立一种可充分利用流式细胞分选术（FACS）的检测方法，该技术对许多实验室而言便捷、经济且易于获取。该方法的一个潜在局限性在于其对稀有细胞的检测灵敏度不足，这可能限制本方案在肿瘤负荷较低患者中的应用。若干其他技术可通过利用上皮细胞的物理或生物学特性来克服这一局限性，从而提高此类稀有细胞群体的检出与分离效率4。本方案所描述的CTC富集方法采用阴性筛选策略：去除表达CD45+的白细胞，保留CD45-的CTC。在进行流式细胞...

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Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

患者来源的异种移植模型（PDX）是目前癌症研究中日益流行的实验模型。该模型可用于生物标志物和生物学通路的表征、药物疗效的临床前评估，以及为个体化癌症治疗创建“替身”模型1,2。此前，其他研究团队已通过将单细胞肿瘤悬液或完整肿瘤组织移植或注射到免疫缺陷小鼠体内，建立了PDX模型1。这些PDX 模型需要通过外科手术从接受手术的患者体内获取新鲜的实体肿瘤、恶性腹水或胸腔积液，这一过程不仅成本高昂，而且会增加患者发生医源性并发症的风险。
癌症研究领域的一项重要近期进展是循环肿瘤细胞的检测、分离与表征。这些肿瘤细胞从原发性肿瘤组织脱落，进入血液循环，在转移和复发过程中发挥关键作用，而转移与复发是癌症相关死亡最常见的原因3。对多种实体瘤来源的循环肿瘤细胞（CTC）进行评估与表征，已为疾病的诊断、预后判断以及残留病灶监测提供了重要的临床信息3。目前已有多种方法可用于高效分离CTC，这些方法主要依赖于CTC的物理特性、生物标志物表达或功能特征4。现有的宏观尺度CTC分离技术包括密度梯度离心法、滤膜孔径物理过滤法以及基于表面分子的分离法。其中应用最广泛的CTC分离方法是基于抗体捕获CTC的技术。可通过正向或负向筛选细胞表面标志物，从外周血中分离CTC。在外周血中对CTC进行正向筛选通常采用上皮标志物（例如，EpCAM），该标志物在CTC上表达，但在造血细胞中不表达。这种方法的缺点在于，具有转移潜能的CTC常经历上皮-间质转化（EMT），导致上皮表面标志物表达下调3。为了分离具有转移潜能的CTC，可采用负向筛选策略，利用造血细胞表面标志物CD45去除白细胞等正常细胞群体，从而富集CTC5。
前列腺癌是男性中最常见的诊断癌症，也是男性癌症相关死亡的主要原因 6肿瘤进展和侵袭性的机制尚未完全阐明，因此建立和表征能够重现前列腺癌分子异质性的实验模型具有重要意义。前列腺癌的PDX模型已被 通过将人前列腺癌细胞移植到免疫缺陷小鼠体内先前建立的模型 7,8然而，由于前列腺癌疾病进展缓慢的特性，导致其在免疫缺陷小鼠中的移植率较低，从而阻碍了此类模型的建立。最近，循环肿瘤细胞（CTCs）已被用于建立乳腺癌模型。 9，肺癌 10 和前列腺癌 11 PDX模型。这些概念验证研究提出了无需依赖手术样本采集即可构建PDX模型的可能性。本文详细描述了这种新型实验模型的构建方法。

<table><tbody><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m 细胞滤器</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚苯乙烯圆锥形离心管</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>带细胞滤器帽的 12 mm x 75 mm 聚苯乙烯试管</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 紫色抗凝血采集管（含 EDTA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 带推钮回缩针头的蝶翼式采血套装（23 号）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 一次性使用采血针 holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性乳胶止血带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乳胶或非乳胶手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 英寸 × 2 英寸棉纱垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘性绷带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

患者来源的异种移植（PDX）模型在癌症研究中日益受到重视，被广泛用于临床前药物评估、生物标志物鉴定、生物学研究以及个体化治疗策略的开发。循环肿瘤细胞（CTC）在肿瘤转移过程中发挥关键作用，并已从多种肿瘤类型的患者中成功分离。近期，CTC已被用于建立乳腺癌和前列腺癌的PDX实验模型。本文详细描述了我们课题组建立的从CTC衍生前列腺癌PDX模型的技术方法。相较于传统PDX模型，该方法的优势在于无需依赖手术标本获取，并可在疾病的不同阶段建立实验模型。通过密度梯度离心，继而进行红细胞裂解及流式细胞术去除CD45阳性单个核细胞，可从转移性肿瘤患者外周血样本中富集CTC。随后将富集的CTC注射至免疫缺陷小鼠体内，所形成的异种移植瘤可用于功能学研究，或收获后进行分子特征分析。该方法的主要局限性在于CTC富集中采用的阴性筛选策略。尽管存在这一局限，从CTC建立PDX模型仍为前列腺癌研究提供了一种全新的实验平台。

本方案将通过分离的CD45阴性前列腺癌循环肿瘤细胞（CTC）建立PDX模型。根据本方案中采用的阴性筛选方法，必须使用DAPI染色排除死细胞。通过流式细胞术检测到的CD45阴性细胞比例存在差异，具体取决于患者的肿瘤负荷（图1A）。对未分选细胞进行CD45和DAPI（用于识别细胞核）的免疫荧光染色，可观察到CD45阴性细胞，如白色箭头所示（图1B）。在图1C中，可见小鼠双侧 flank 出现皮下结节样密度影。每个结节样密度代表异种移植瘤的生长，其自小鼠背部肌肉组织突出，质地较硬，可与正常组织明显区分。从细胞植入到异种移植瘤形成的时间间隔可能差异较大，具体取决于患者样本中CTC的负荷量、植入细胞数量以及CTC的生物学侵袭性。由CTC建立的前列腺癌PDX模型在苏木精-伊红染色以及针对前列腺特异性细胞标志物（如雄激素受体（AR）和前列腺特异性膜抗原（PSMA））的免疫组化染色中，均能重现人类前列腺肿瘤的特征（图1D）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。

患者来源的异种移植（PDX）模型在癌症研究中日益受到重视，被广泛用于临床前药物评估、生物标志物鉴定、……

以下方案的总体目标是建立前列腺癌患者来源的循环肿瘤细胞异种移植模型。该目标首先通过采集晚期前列腺癌患者的外周血来实现。第二步，分离血液单个核细胞组分，其中含有循环肿瘤细胞。接着，使用 CD45 ZI 抗体对单个核细胞进行染色，以便通过流式细胞术筛选循环肿瘤细胞。随后将这些细胞注射到免疫缺陷小鼠体内。结果显示，通过从前列腺癌患者外周血中经流式细胞术分离出的循环肿瘤细胞进行注射，成功建立了前列腺癌异种移植模型。该方法可通过建立新的实验模型，帮助解答前列腺癌领域的关键科学问题，这些模型可用于前列腺癌的分子特征分析以及新型生物标志物的开发。本实验操作将由来自西奈山医院实验室的学生 Williams 和肿瘤科研究员 Omada 共同演示。首先，采集特定转移性前列腺癌患者的全血样本，因为这些患者的外周血中可能含有较高数量的循环肿瘤细胞。使用 10 毫升血清学移液管，将全血转移至 50 毫升聚苯乙烯圆锥形管中，并加入 Hank's 平衡盐溶液。按照1:1的比例，轻轻吹打混合液以使其均匀。接着，将15毫升FI call pack溶液加入一个空的50毫升聚苯乙烯圆锥管中。然后，用最低档轻轻吹打20毫升稀释后的全血，将其加在溶液顶部，形成清晰的上层。然后在室温下以400 G离心30分钟。将离心机的减速档位调至最低，以防止分离后溶液重新混合。离心结束后，识别位于血浆上层与分离液之间的薄层白色或灰色条带，该条带为外周血单个核细胞和循环肿瘤细胞。在离心管底部，仔细收集白色灰带处的细胞，并将其转移至一个50毫升的聚苯乙烯管中。使用塑料移液管，向分离的细胞中加入Hank's平衡盐溶液，直至总体积达到10毫升。将混合物再次在室温下以400 G离心10分钟。为洗涤细胞，移除上清液并重复此洗涤步骤一次。第二次洗涤后，弃去上清液。将剩余的沉淀物重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育5分钟。接着，在室温下以400 G离心3分钟，弃去上清液以去除裂解缓冲液。最后，在加入10%胎牛血清的1毫升PBS中重悬细胞沉淀，然后进行染色。使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板或自动细胞计数仪上对活细胞数量进行定量。随后将细胞用含10% FBS的PBS稀释至每毫升100万个细胞，并置于冰上孵育1小时。为阻断非特异性结合，将细胞悬液分装至两个独立的离心管中。将其中一管标记为对照细胞，另一管标记为对照管中的CD45染色细胞。加入IgG one Kappa Zi，按1:250稀释，使其终浓度为10纳克/毫升。在 CD 45 染色管中，加入终浓度为 10 纳克/毫升的 CD 45 ZI 偶联一抗，将细胞悬液置于冰上孵育 30 分钟。接着，在 4 摄氏度下以 400 ×g 离心 3 分钟，然后弃去上清液。将每个细胞沉淀用含10% FBS的无菌PBS重悬，洗涤两次，每次在4°C条件下以400 G离心三分钟。洗涤后，将细胞重悬于1 mL含10 微克/毫升DAPI染料的PBS溶液中。为排除细胞团块或碎片，将最终溶液通过35 微米滤膜帽过滤至12 毫米 × 75 毫米的聚苯乙烯管中。然后，按照随附的文字方案所述，使用荧光激活细胞分选法从悬液中去除 CD45 阳性细胞和死细胞。将分选后的前列腺肿瘤细胞悬液与细胞外基质蛋白按 1:1 比例混合，并将混合物置于冰上。接下来，根据机构指南，使用每分钟 1 升氧气中含 5% 吸入用异氟烷，对 8 至 10 周龄的雄性免疫缺陷小鼠进行麻醉。通过检查小鼠角膜反射和脚趾反射是否消失，确认麻醉效果适当。使用25号针头和1毫升注射器抽取250 µL细胞悬液。然后将细胞外基质细胞悬液全部经皮下注射至小鼠双侧上背部区域，并通过每周触诊小鼠注射部位，监测皮下结节样密度物的生长情况。根据本实验方案中所采用的阴性筛选方法，有必要使用 DAPI 染色排除死细胞。如图所示，剩余活细胞中 CD45 阴性细胞的比例存在差异，取决于患者的肿瘤负荷，但可轻松与 CD45 阳性细胞区分开来。在正确设置门控的条件下，接种前列腺肿瘤细胞悬液后，可在小鼠两侧 flank 部位观察到皮下结节样密度。 每个结节状病灶代表异种移植瘤的生长，因其从小鼠背部肌肉组织突出且质地较硬，故可与正常组织明显区分。由循环肿瘤细胞建立的患者来源异种移植模型，经苏木精-伊红染色以及针对雄激素受体和前列腺特异性膜抗原等前列腺特异性细胞标志物的免疫组织化学染色观察，可再现人类前列腺肿瘤的特征。在成功建立异种移植模型后，还可开展基因或蛋白质表达谱分析等其他实验方案，以探究与前列腺癌侵袭性相关的细胞与分子机制。

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前列腺癌患者产生派生异种移植模型从循环肿瘤细胞

我们介绍了压缩激素颗粒的制备方法以及将其通过皮下手术植入小鼠体内的操作。该策略可与将细胞和组织异种移植物在无胸腺裸鼠肾包膜下进行移植相结合，用于评估激素诱导的致癌作用及良性前列腺增生的调控机制。...

肾包膜异种移植与皮下颗粒植入法评估前列腺癌变及良性前列腺增生

前列腺癌是美国癌症相关死亡的第二大常见原因。原位癌模型为理解前列腺癌的生物学特性以及评估治疗方案的有效性提供了一种有效的方法。本方案详细描述了建立原位前列腺癌小鼠模型所需的各个步骤。...

人前列腺癌的临床前原位小鼠模型

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

本实验方案的目的是演示前列腺癌细胞的前列腺内注射，随后进行阉割。在具有临床相关性的肿瘤微环境和免疫健全宿主的背景下，建立依赖雄激素及去势抵抗性前列腺癌的原位临床前模型，对于研究该疾病至关重要。...

一种用于雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌的生物发光与荧光同基因小鼠原位模型

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。...

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。...

利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

本方案描述了从手术获取的胃癌样本中建立患者来源的异种移植（PDX）模型和原代癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。...

建立胃癌患者来源的异种移植模型和原代细胞系

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

我们提出了一种通过超声引导下注射人胰腺癌细胞建立微创原位胰腺癌模型并随后监测肿瘤生长的实验方案。 体内...

通过超声引导注射建立胰腺癌细胞原位异种移植模型

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。...

建立和维持患者来源的前列腺癌类器官：一份详细的实验方案

了解从循环肿瘤细胞生成前列腺癌患者来源异种移植模型的方法。本方案通过流式细胞术分离CTCs并植入免疫缺陷小鼠，为前列腺癌分子特征研究和新生物标志物开发提供可靠的实验模型。

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

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