斑马鱼幼虫骨骼肌诚信与伊文思蓝分析

Evans Blue Dye 和 Fitzy Dextrin 总主静脉注射的总体目标是观察活斑马鱼的骨骼肌膜完整性，以帮助表征与各种肌营养不良亚型相关的致病机制。Evan 的蓝色染料注射液可以帮助揭示导致疾病病理学的生物学机制在表征肌肉萎缩症的动物模型时，它也有助于我们了解疾病治疗的潜在治疗机制。这种技术的主要优点是可以使用活斑马鱼进行和分析。

此外，Fitz Dextrin 的共注射证明了成功注射的质量控制，从而提高了严谨性和定量性。该技术的意义与验证肌肉疾病斑马鱼模型的效用有关。它们还增强了对某些突变如何导致肌肉疾病表型（如肌肉萎缩症）的理解，这对于寻找治疗方法和治愈方法至关重要。

要制备琼脂注射板，请在 E 三种培养基中煮沸 2% 至 3%aros，并让溶液在工作台上略微冷却。将大约 35 毫升冷却的 agros 倒入每个 100 毫米的培养皿中。然后将首选注射模具的一端放入溶液中，然后将模具的其余部分铺设到农业溶液上。

让农业溶液在室温或 4 摄氏度下凝固约 30 分钟。然后用抹刀将模具的一端与固体 agros 分开，并慢慢去除模具的其余部分。在一种 x 林格溶液中制备 1% 的 Evan's Blue 染料或 EBD 储备液。

然后在一个 x 林格溶液中制备 Fitzy Dextrin 储备溶液，并在零下 20 摄氏度下储存。要制作注射混合物，直接在 Fitz 糊精储备溶液中将 EBD 稀释至 0.1%，请在注射前使用铝箔包裹试管，彻底涡旋注射混合物并避免阳光直射。将注射板预热至室温。

将微纵器放在金属板上，并站在注射显微镜旁边。打开气动微型注塑控制器。然后用大约 2 到 4 微升的 EBD 混合物回填注射针。

接下来，用大约 5 纳升的 EBD 混合物校准注射体积。然后使用 1 x 林格溶液润湿注射板并从孔中除去多余的溶液，用 0.04% trica 在 1 x 林格溶液中稀释的 0.04% trica 预处理幼虫，以在用玻璃移液管注射之前完全固定幼虫。将麻醉的幼虫放入螺旋注射板的孔中，确保幼虫完全位于侧卧的孔中。

去除多余的 trica 溶液以尽量减少幼虫在孔内的移动，但要留出足够的以防止脱水。将幼虫注射板放在解剖镜上，并定位含有 EBD 的注射移液管针头。混合在靠近心脏的斑马鱼幼虫上，并与前后轴成 45 度角。

将注射针插入蛋黄前部附近的总主静脉或 CCV，静脉最初向背侧转动的地方。接下来，注射 5 纳升 EBD 混合物，并将注射针保持在原位 5 到 8 秒。为了尽量减少 EBD 混合物的立即泄漏，良好的注射将在心腔中显示染料，并且可以重复。

如果在成功注射后没有立即在心脏中看到 EB DMX，胚胎将在脉管系统中积累 Fitz Dextrin，如图所示。注射所需数量的幼虫后，将幼虫放回 100 毫米培养皿中不含 trica 的 x 林格溶液中，以提高存活率并保持信号强度。将盘子包裹在铝箔中。

将幼虫在 28.5 摄氏度下孵育 4 到 6 小时，以确保 EBD 的有效摄取。为了在肌肉中可视化 EBD，使用 0.04% trica 麻醉幼虫，然后在红色荧光下观察幼虫。如图所示，在充满心腔的 3D PF 注射中将 EBD 注射到 Sapia 均质突变体和野生型兄弟姐妹的 CCV 中，然后通过在绿色荧光下观察脉管系统中的 fitzy 糊精来分析模具灌注是否成功。

4 小时潜伏期后，在 so 螨水平检查 EBD 摄取，如图所示。野生型兄弟姐妹在任何可见的肌肉纤维内均未表现出 EBD 荧光，而 sapia 纯合突变体显示 EBD 摄取表明肌肉膜受损。一旦将伊文思蓝染料熟练注射到斑马鱼的总主静脉中，幼虫可以在 30 到 60 分钟内完成，具体取决于注射的幼虫数量。

此外，可以在一天内获得实验结果，以确保熟练程度。重要的是要记住仔细瞄准基静脉，以产生一致且可解释的结果。这可能具有挑战性，并且可能需要练习遵循此程序。

可以执行其他方法，例如化学和遗传筛选，以确定导致与肌营养不良症相关的膜损伤的分子机制。这些实验可以帮助建立新的治疗策略 肌肉疾病发展后.这项技术为肌肉疾病研究领域的研究人员探索肌肉萎缩症斑马鱼模型中的膜完整性铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何将 Evan 蓝染料注射到斑马鱼幼虫的共同主静脉中有一个透彻的了解。您还应该了解如何识别由于纤维中存在 Evan 蓝染料而导致膜损伤的肌肉纤维。