伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

伊文思蓝染料与荧光标记的葡聚糖经共同主静脉注射的总体目标，是观察活体斑马鱼骨骼肌细胞膜的完整性，从而有助于阐明与多种类型肌营养不良症相关的致病机制。在表征肌营养不良动物模型时，伊文思蓝染料注射可帮助揭示参与疾病病理过程的生物学机制，同时也有助于加深我们对潜在治疗机制的理解，以用于疾病治疗。该技术的主要优势在于，可在活体斑马鱼中完成操作并进行分析。

此外，共注射Fitz Dextrin可用于评估注射是否成功，从而实现质量控制，提高实验的严谨性和定量性。该技术的应用意义在于验证斑马鱼肌肉疾病模型的有效性，同时有助于深入理解特定突变如何导致肌肉疾病表型（如肌营养不良症），这对于寻找治疗方法和治愈手段至关重要。

制备琼脂注射平板时，将2%至3%的琼脂加入E3培养基中煮沸，然后将溶液在实验台上稍作冷却。将约35毫升冷却后的琼脂溶液倒入每个100毫米的培养皿中。随后，在将整个注射模具平放于琼脂溶液之前，先将模具的一端放入溶液中。

将琼脂溶液在室温或4°C下静置约30分钟，使其凝固。然后使用刮铲将模具的一端从凝固的琼脂中分离，并缓慢取下模具的其余部分。用1×林格液配制1%伊文思蓝染料（Evan's Blue Dye 或 EBD）的储备液。

然后用1×林格溶液配制Fitzy Dextrin的储备液，并于-20 °C保存。制备注射混合液时，将EBD直接稀释至0.1%，加入Fitzy Dextrin储备液中，充分涡旋混匀。注射前用铝箔包裹试管以避光，并将注射用培养板预先升温至室温。

将显微操作仪放置在金属板上，并将其置于显微注射镜旁。打开气动显微注射控制器。然后用约 2 至 4 微升的 EBD 混合液对注射针进行反向填充。

接下来，使用约5纳升的EBD混合液校准注射体积。然后用1倍林格溶液润湿注射板，并吸除孔中的多余溶液。将幼虫用含有0.04%三卡因（trica）的1倍林格溶液预处理，以在玻璃移液管注射前完全 immobilize（固定）幼虫。将麻醉后的幼虫放入螺杆式注射板的孔中，确保幼虫完全进入孔内并侧向平躺。

吸除多余的三卡溶液以尽量减少幼虫在孔内的活动，但保留足够液体以防止脱水。将含有幼虫的注射板置于解剖显微镜下，并将含有EBD的注射移液针就位。在靠近斑马鱼幼虫心脏处混合，并与前后轴呈约45度角。

将注射针插入卵黄前部附近共同主静脉（CCV）的初始背侧转向处。接着，注入5纳升（5 nL）的EBD混合液，并将注射针保持在原位5至8秒。为尽量减少EBD混合液的即刻泄漏，成功的注射应能在心脏腔室内观察到染料，且可重复操作。

如果在成功注射后立即于心脏中未观察到 EB DMX，则胚胎的血管系统将蓄积Fitz Dextrin，如图所示。在完成所需数量的幼虫注射后，将幼虫转移至不含三卡的1×林格溶液中，置于100毫米培养皿内，以提高存活率并维持信号强度。将培养皿用铝箔包裹避光保存。

将幼虫在 28.5 摄氏度下孵育 4 至 6 小时，以确保高效摄取 EBD。为观察肌肉中的 EBD，使用 0.04% trica 对幼虫进行麻醉，然后在红色荧光下观察幼虫。将 EBD 注射到 Sapia homogeneous 突变体及其野生型同胞的 CCV 中，在 3 dpf 时进行注射，注射液充满心腔（如图所示），随后通过在绿色荧光下观察血管系统中的 fitzy dextrin 来分析染料灌注是否成功。

经过四小时的孵育后，EBD 摄取情况在该图所示的体节水平上进行观察。野生型同胞在任何可见的肌纤维中均未出现 EBD 荧光，而 sapia 纯合突变体则表现出 EBD 摄取，提示肌膜受损。一旦熟练掌握向斑马鱼共同主静脉注射伊文思蓝染料的操作，根据注射幼鱼的数量，整个过程可在 30 至 60 分钟内完成。

此外，实验结果可在一天内获得。为确保操作熟练，务必牢记要准确地对准主静脉，以获得一致且可解释的结果。这一步骤可能具有挑战性，需要在遵循本方案的基础上进行练习。

还可以采用其他方法，例如化学筛选和遗传筛选，以确定与肌营养不良相关的膜损伤的分子机制。这些实验有助于在该技术建立后，为肌肉疾病确立新的治疗策略。该技术为肌肉疾病研究领域的研究人员探索肌营养不良斑马鱼模型中的膜完整性问题奠定了基础。

观看本视频后，您应充分掌握如何将伊文思蓝染料注射到斑马鱼幼鱼的常见主静脉中。您还应了解如何通过肌纤维内伊文思蓝染料的存在来识别因膜损伤而染色的肌纤维。