Name: 热成像学习压力非侵入性的无拘无束的小鸟 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习利用红外热成像技术对野生蓝山雀（Cyanistes caeruleus）进行非侵入性急性应激反应监测的方法。通过记录眼部区域皮肤温度变化，研究人员可在不直接接触鸟类的情况下实时评估其生理应激动态。

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本工作得到了英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向 DMcK、DMcC 和 RGN 提供的项目资助（BB/K002775/1）以及一项博士生奖学金（JP，BB/J013854/1）的支持。我们衷心感谢 Nozrat Mirzai（格拉斯哥大学生物电子学单元）、Ross McLeod 和 Matthew Clavey（ThermalVision Research）在整个项目期间就技术设备和野外技术提供的宝贵建议，同时感谢 SCENE 为野外工作提供的全部后勤支持。我们还要感谢 Veracity 公司的 Debbie Kelton 慷慨提供了用于为野外热成像相机供电的设备。

伦理声明：
该项工作采用了英国鸟类学信托基金会批准的对野生小型雀形目鸟类进行常规捕获的方法，且在英国内政部许可证授权下实施了对鸟类产生轻微应激的捕获方案。
1. 拍摄设置
<ol>
	<li>建立一个拍摄装置，使鸟类被引导至摄像机前方就位（图1）。鸟类从一侧端壁的孔洞进入装置，并可接近位于相对端壁附近的食源。</li>
	<li>为使鸟类适应该装置，在正式录制前数周，于喂食器中提供适宜的食物（例如，花生仁）。除补充食物外，避免干扰装置。在此期间，于喂食器前方放置一个假三脚架，使鸟类同时适应摄像机的存在。</li>
	<li>在录制当天，通过清空喂食器中所有剩余食物，并替换为盛装在顶部中央仅留有小孔的透明容器内的食物，以降低花生仁的可获取性。将此食物容器置于笼子远端（与入口相对的一端）中央位置。</li>
	<li>在箱体网孔的一个角落处粘贴一小块已知发射率与天然表皮组织相同的黑色绝缘胶带，使其出现在所有图像中。将该黑色绝缘胶带连接至一个热电偶，并接入温度记录仪，以每秒0.1 °C的分辨率记录胶带温度。</li>
	<li>将热成像相机置于距箱体中心50 cm处，确保整个箱体位于相机视野范围内，且从透明容器取食的鸟类处于相机的对焦区域。将相机连接至笔记本电脑，设置相机以平均每秒7.5帧的速度（带时间戳）采集图像，并将图像传输至笔记本电脑硬盘保存。</li>
	<li>将一根鱼线连接至装置的旋转门，并将其延伸至实验人员可隐蔽观察但鸟类无法看见的位置——距离装置约20 m处。</li>
</ol>
2. 拍摄鸟类对轻度急性应激的反应
<ol>
	<li>一旦鸟类进入饲喂箱，应让其在箱内不受干扰地停留 约 5 秒</li>
	<li>在鸟类活动一段时间后拉动鱼线 约 5 秒内关闭饲喂箱。注意确保鸟类仍位于箱子的远端，以尽量降低其受伤风险。</li>
	<li>立即靠近喂食箱，并在相机后方静止站立约 3 分钟。然后从箱中取出鸟类并放飞。</li>
</ol>
3. 从热成像中提取眼部区域温度
<ol>
	<li>从每一帧中提取最高温度。注意：最高温度几乎总是记录自眼周区域，该区域由眼眶周围环状暴露的皮肤所界定图2），下文简称为眼区温度。
	<ol>
		<li>在热成像分析软件中，右键单击图像，为图像最大值“添加”一个新的绘图。然后，右键单击该绘图，将数据（眼区温度及帧图像采集时间）导出为 CSV 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 CSV 文件中删除鸟类眼部区域不可见的所有帧对应的行。</li>
	<li>在 R 中绘制最高温度随时间变化的曲线 27，手动识别温度骤升的点 &#62; 当瞬膜（眨眼）覆盖眼睛时，连续两次读数之间相差+0.2 °C，且存在低于鸟类体温正常范围的低值点 28 (即， 当眼区在多个连续帧中因运动而可见但模糊时，需从步骤3.1生成的CSV数据文件中删除相应行。</li>
	<li>测量环境温度。
	<ol>
		<li>将数据（时间和记录仪温度）从温度记录仪下载到计算机，并导出至电子表格中。</li>
		<li>在热成像分析软件中，于覆盖温度记录仪探头的黑色绝缘胶带区域绘制一个方框，以获取热图像中的环境温度，然后&#160;右键单击方块，然后选择“添加新图表”以显示该方块的平均温度。</li>
		<li>然后，右键单击该图表，将数据（时间与IRT温度）导出为CSV文件。将得到的温度记录仪和热成像匹配时间的两条温度时间序列合并到一个电子表格中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据环境温度校正眼区温度。将步骤3.4中生成的电子表格导出为与时间匹配的CSV文件。对每个保留的眼区温度值，加上同一时间点温度记录仪与热成像-derived温度值之间的差值（记录仪温度－IRT温度）。</li>
	<li>使用峰值搜索算法（见补充代码文件）进行自动过滤，以去除眼区温度较低且准确性较差的数值，自动提取数据中的最高（即最准确）的点。 
	注意：峰值搜索算法会将温度数据重组为一个具有用户自定义宽度（跨度）的向量，推荐跨度值 = 3，在数值两侧均较小的行中提取中心值 即， 峰</li>
	<li>使用线性插值法填补因未提取到峰值或眼区不可见而产生的序列间隙。使用以下命令 na.approx (zoo 包 v1.7-11 in R) 27为每个个体每秒提供一个温度值。</li>
	<li>在 CVS 数据文件中，将每个眼部区域温度值增加 0.2，以校正通过网格拍摄图像所造成的影响。 
	注意：测试结果表明，当一个黑体被加热至接近鸟类活动期的平均体温约41 ºC时 28通过与拍摄装置中相同网孔尺寸的网格窗口进行成像，热成像相机在未被金属丝遮挡区域记录的温度比无网格间隔时测得的数值低0.2 °C（平均差异 = -0.2 °C ± 0.085 SD，n = 30，黑体温度范围为41.6–42.5 °C）。 
	注意：此校正因子特定于本研究的实验条件，其数值可能因仪器品牌、动物与相机之间网孔的类型和宽度不同而有所变化，需针对每种具体情况下的研究条件进行确定。</li>
	<li>从关闭盒子前记录的最高眼区温度中选取最大值，该值将作为未受干扰鸟类的眼区温度基线。将此眼区温度基线作为新列添加到CSV文件中（基线）。然后从每个保留的最大眼区温度值中减去该基线值，在CSV数据文件中生成新的一列。 
	注意：这一新数值现在表示鸟类对轻度急性应激的反应，即其体温相对于未受干扰时基线温度的偏离程度。</li>
	<li>使用以下命令，绘制陷阱关闭后所有个体眼区最高温度相对于基线眼区温度的偏差 ggplot （R 中的 ggplot2 v1.0.0 包） 27）。使用该选项生成自举法 95% 置信区间 均值置信区间自助法 （R 中的 ggplot2 v1.0.0 包） 27）。详情请参见补充代码文件。</li>
</ol>

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<li>Nakanishi, R., Imai-Matsumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facial+skin+temperature+decreases+in+infants+with+joyful+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infant+Behavior+and+Development%22%5BJournal%5D)">Facial skin temperature decreases in infants with joyful expression.</a> Infant Behavior and Development. 31, 137-144 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

本文的目的是描述一种用于测量自由活动动物在急性应激刺激下皮肤温度变化的必要方法。本研究证明，利用红外热成像技术（IRT）可非侵入性地捕捉野生鸟类在急性应激反应中伴随的皮肤温度快速变化。该方法包括五个关键步骤：（1）使用高度便携式热成像系统设计合适的野外实验装置；（2）测量基础温度；（3）施加轻度应激刺激，即在实验装置内捕获鸟类；（4） 事后检验 眼区温度的自动采样以及（5）提取温度数据的校准。本文所述方法已应用于野生蓝山雀的捕获研究。代表性的眼区基础温度可在短短5秒内获取。在野外记录一只鸟类预计需约1小时，另需1小时处理3分钟的热成像视频序列。
在动物皮肤温度上采集高质量数据需要高质量的热成像图像。热成像相机与可见光相机的根本区别仅在于它们所检测的电磁辐射波长不同，因此许多适用于摄影的概念（例如， 视野、景深）在热成像中同样适用。正如野生动物摄影师通常的做法，动物可被预测到访的任何地点，若具有自然（例如， 巢址）或人工（例如， 喂食器）可用于采集热成像图像。与在动物栖息地中追踪它们相比，将动物吸引至相机前的方法具有优势，可使我们提前设置好相机，一旦动物进入视野，即可在干扰最小的情况下获取高质量图像。然而，采用这种方法时，必须仔细考察或校正测量情境对动物应激状态或皮肤温度的特定影响。例如，本研究中鸟类的测量处于喂食情境下，且使用食物主动诱引蓝山雀进入实验装置。有关鸡的研究表明，急性积极体验（如在联想学习试验中期待并摄取食物奖励）同样会降低眼部温度。 29因此，参与该实验设置的个体“基线水平”可能受到该行为与奖赏关联的影响。这一可能性值得进一步研究，但若存在此情况，预计会增强已观察到的基线水平下降幅度。此外，食物消化过程中会引发产热效应，但在基线测量期间摄入的食物对体温的具体影响，在3分钟捕获期内预计不会显著升高体温。 30.
考虑到这一局限性，在相同背景下测量所有动物也是该方法的一大优势。代表性结果表明，在施加急性应激源之前（即基线眼区温度），个体间的眼区温度存在较大差异。基线眼温的变异（变异系数 = 3.9%）可能部分源于测量误差，也可能真实反映了个体间的差异。在红外热成像仪连续5秒记录黑色绝缘胶带温度（胶带温度未发生变化）的期间，平均变异系数为0.26%（范围为0.08%至0.59%）。尽管活动中的鸟类其测量误差可能更大，但这一结果仍表明，基线眼区温度的大部分变异确实来源于个体间差异。基线测量期间眼区温度在20秒内的高度可重复性进一步支持了活动鸟类测量误差相对较小的观点（图3）。通过控制实验背景，我们可以确保所有鸟类处于相同的活动状态，同时还能最大限度地减少测量时环境因素对皮肤温度个体间变异的影响。例如，应确保测量地点避免受到干扰性入射辐射的影响，否则在热成像过程中会导致动物体表温度被高估。这可以通过在阴凉处操作或使用 strategically placed 遮蔽物（包括大多数能阻隔红外波长的透明塑料）来实现。本文所介绍的方案展示了一种简单的实验装置，可轻松应用于越冬大山雀的研究场景。实验中，大山雀被置于一个带有实心顶盖的喂食箱内，以避免阳光直射。该装置也可推广至其他许多在一年中特定时期会定期光顾人工喂食器的雀形目鸟类。由于大山雀体型相对较小，需进行近距离拍摄以获取足够的细节。与普通摄影相机类似，无论是实际距离还是放大倍数上的接近，都会显著减小景深。为了使鸟类在视野中尽可能大，需从相机的最近对焦距离进行拍摄，本实验中该距离为500 mm，导致景深仅为40 mm。因此，整个拍摄装置的各个设计要素都必须有利于引导动物将其头部保持在所用相机相对狭窄的清晰对焦区域内。
面对动物所受到的已知轻度急性应激刺激，我们预期会出现血流模式的快速变化，即通过交感神经介导的血管收缩，使血流从外周向躯体核心重新分布，从而降低皮肤温度17。选择眼周区域是因为该部位是身体唯一未被绝缘覆盖的区域，且含有丰富的交织小血管网络——眼网（rete ophthalmicum），可影响眼部的热量散失31。由于热成像视频技术具有较高的帧率，能够显示眼周区域温度在10秒内迅速下降约2 °C，随后在3分钟内回升至接近基线水平0.5 °C以内。尽管此前已有研究记录到轻度应激反应引起的外周冷却现象，但观测时间间隔约为1分钟&#160;17,26,32，而本技术表明，温度下降的最大幅度可能极为迅速。若时间分辨率较低，则可能遗漏该效应的真实程度。这在比较不同个体间应激反应差异时可能具有重要意义。鸟类在经历快速的“战斗或逃跑”反应后，体温回升过程并未恢复至基线水平，表明鸟类在仍处于实验箱内时持续处于生理应激状态。为尽量减少对野生个体的束缚时间，研究人员在设定的约3分钟&#160;（ca. 3 min）任意截止点后将鸟类释放。然而，未来研究可能需要延长试验时间，以完整记录动物眼周温度恢复至基线水平的全过程，前提是实验操作上可行。
这一新方案通过采集施加应激源前后的一系列图像，现在可对急性应激反应的动态过程进行详细研究，并实现个体间多个时间点的比较。在不同季节或环境条件下对同一动物个体重复进行该试验，可能有助于解析环境对基础状态或急性应激后皮肤温度的影响，从而为慢性应激评估提供一种可行途径。
鸟类的皮肤温度不仅取决于代谢产热和血流，还受到太阳辐射、风速和湿润程度的热交换影响25。因此，在潮湿和有风的条件下无法获得准确的热成像记录。热成像相机记录的眼区温度有时可能被低估（负误差）或高估（正误差）。显著的正误差需要额外能量输入，但由于采食箱中的鸟类已避开阳光直射，这种情况得以避免。另一种正误差来源是鸟类眨眼。偶尔，鸟类会短暂地将瞬膜拉过眼区，而瞬膜在体内储存时的温度更接近核心体温，因此当其覆盖眼球时会导致温度读数异常升高。然而，这种情况很容易识别，因其具有非常明显的特征，受影响的帧可被剔除。在本研究记录中，负误差的主要原因是运动模糊。当鸟类移动过快，超出相机帧率的清晰捕捉能力时，图像中微小温暖眼区的数据会与周围较冷区域混合（即运动模糊），从而导致眼区温度被低估。因此，在剔除正误差后，眼区测得的最高温度是最准确的测量值，通过使用峰值函数命令进行自动筛选，可去除最大眼区温度中较不可能的较低数值。
此外，由于红外辐射会被水蒸气吸收，所记录的表面温度会受到环境相对湿度的影响。可通过将空气温度、相对湿度和到物体的距离输入分析型热成像分析软件来校正这一影响。然而，一种更为准确且高效的方法（如本研究中所采用的）是在视场内包含一个已知温度和发射率的参考物体。在本例中，该参考物为一块黑色绝缘胶带，其发射率为0.97，与天然表皮的发射率近似33。通过比较绝缘胶带上实际温度与热成像测得的温度之间的差异，可对眼部区域温度进行校准。随后，可利用该黑体表面温度在整个测量期间持续校准图像。
得益于热成像相机技术的进步，如今可部署体积小、重量轻的热成像相机，以每秒采集多帧图像的方式长时间连续记录。尽管热成像技术在鸟类研究中已得到广泛应用 25，热成像系统的体积和成本限制了其在野外的应用。本研究中，该系统具有高度便携性，成本约为 &#163;6,000，能够提供高分辨率热成像视频，可在无需接触鸟类的情况下，以非侵入方式准确获取自由生活动物的体温数据。以每秒多帧的速度进行记录，可获得高分辨率的外周温度时间序列数据，从而为探究急性应激反应的动态变化提供了可能。而传统的糖皮质激素取样方法受限于特定时间内可采集的样本数量，难以实现类似的时间分辨率。本研究中提取了时间间隔为1秒的眼区温度时间序列数据，足以展示眼区温度对急性应激源（捕捉）的反应，但也可实现更高的时间分辨率。然而，大量图像的积累需要一定程度的自动化手段来从图像中提取信息。本方案描述了一种简单的半自动化流程，用于从每幅图像中提取最高温度值。由于感兴趣区域（即眼区）始终是图像中最热的部位，因此该方法可行。若感兴趣区域更为复杂，则分析可能更具挑战性，或需采用定制的模式识别软件例如，34）。在本研究中，某些情况下眼区温度被高估或低估，需要进行一些手动筛选，但这些问题很容易被发现；当然，进一步实现自动化是可取的。通过热成像技术测量应激诱导的外周降温，为其他生理应激指标提供了有价值的补充，且该技术的非侵入性特点在涉及圈养和野生动物的后续研究中具有显著优势。
捕捉完整的应激反应，红外热成像作为应激评估工具显然具有巨大潜力。然而，要成为已建立的激素和核心体温检测方法的一种非侵入性替代手段，有必要在这些测量方法之间进行交叉验证，并确定皮肤温度是否与应激源强度呈相同的比例关系，即皮肤温度反应的程度能否反映应激源的强度。未来的研究还应探讨皮肤温度是否能够捕捉慢性应激。尽管急性应激引发的应激性体温升高（SIH）预期是短暂的，但反复暴露于生理或心理性急性应激源可导致核心体温持续升高35,36。持续性血管收缩是否促成这种核心体温升高，目前尚未得到明确检验。然而，针对患有慢性应激相关疾病的人群的关联性研究确实显示其手指温度降低37。另一个有待探索的特征是效价（valence）：即区分正性与负性事件的能力。激素检测无法区分效价5，因为糖皮质激素水平似乎反映的是兴奋程度，而非特异性的应激状态。对家鸡在遭受厌恶和正性刺激时鸡冠温度的研究表明，皮肤温度变化可能与总体唤醒水平类似22,29。然而，在人类中，不同情绪状态会引发区域性特异性的皮肤温度变化，例如受惊时眼周区域升温而面颊降温38，但发笑时整体皮肤温度下降39。不同区域之间的比较或许能揭示情绪状态。依据本文提出的研究建议，将有可能回答上述所有问题，并验证皮肤温度作为应激的非侵入性指标的有效性。

应激是生物学中的一个核心概念，描述了生物体在应对环境挑战时为恢复稳态而产生的应急反应1,2。在应激状态下，血糖、脂肪酸和氨基酸水平、心率、呼吸频率以及代谢率均会升高，同时血液从外周组织重新分配至核心器官2。这种普遍的生理变化模式使动物能够快速且适应性地应对各种社会性和生理性的挑战。尽管识别和理解应激在基础与应用动物研究中均处于核心地位，但在未束缚的动物中评估应激状态仍是一项挑战。
一种广泛使用的生理应激标志物是循环中糖皮质激素（如皮质醇和皮质酮）水平的升高 1,2这种方法的一个显著优势在于，其浓度会随着应激强度的增加而成比例升高，从而能够对压力进行量化。然而，糖皮质激素并非“应激”激素 本身，但属于能量储备动员剂 2因此，糖皮质激素水平也会随着能量需求、一天中的时间、年龄和生殖状态而变化。 3,4，以及在面对看似积极的情境（如交配机会）时 5因此，必须谨慎结合具体背景来解读糖皮质激素水平。测量糖皮质激素对急性应激的反应也存在一些局限性。急性应激源会引发一种动态反应，表现为糖皮质激素水平先迅速升高，随后逐渐恢复至基础水平。 1,2糖皮质激素样本通常通过采血等侵入性方式获取，而采血本身即是一种应激刺激，因此可能影响所测得的糖皮质激素水平 6此外，糖皮质激素水平只能在一个或极少数时间点进行测量，这可能无法捕捉到峰值水平、峰值出现时间或反应持续时间的变化，从而限制了我们对个体动态应激反应随时间变化的考察能力。激素取样的非侵入性方法，例如通过粪便样本 7，毛发或羽毛 8，尽管可用于测量数天或数月时间尺度上的平均糖皮质激素水平，适用于研究慢性应激，但无法应用于急性应激的研究。由于即使是最成熟的方法也只能提供个体间急性应激变异的有限视角，因此在生理应激测量中亟需一种替代性方法。
由于应激反应涉及多种生理效应，因此还有其他可能指示应激的候选指标。例如，由交感神经介导的血管收缩会将血液从外周转移至躯体核心。这种血液（从而热量）的集中，加上各种应激诱导的产热形式，会使核心部位升温9。因此，这种被称为应激性高体温（stress-induced hyperthermia, SIH）的核心升温现象，也已被用作药物研究中急性应激的标志10。SIH通常在急性应激源出现后10–15分钟内使核心体温升高0.5–1.5 °C10。已有大量文献记载，捕捉和抓握动物这一常见的实验性应激操作，可在多种哺乳动物和鸟类中引起核心体温升高11–17。重要的是，SIH与其他已确立的应激指标相关，例如心率18、糖皮质激素水平19以及行为变化20,21。并且与糖皮质激素水平类似，在某些物种中核心体温与应激程度呈线性关系22。然而，与采血类似，核心体温的测量本身具有侵入性，需要插入或植入探针10。每次重复施加导致应激的抓握操作或探针插入时，基础核心体温会逐渐升高23。近年来体温记录设备的发展使得可远程获取数据，这可能至少为大型动物提供了一种解决方案24。
然而，在产生应激性体温升高的同一机制中，还存在另一种潜在的应激标志物：外周血管收缩会将血液及其携带的热量转移至身体核心，同时导致皮肤降温17。与核心体温不同，皮肤温度可通过红外热成像技术（IRT）实现完全非侵入式测量。IRT 可将物体表面发射的红外辐射转换为温度读数25。由于动物体表通常很少有裸露区域可直接获取皮肤温度，因此需要利用自然暴露的皮肤区域（例如，眼部周围）或通过修剪毛发或羽毛制造出裸露区域。只要能够接触到合适的暴露皮肤区域，并且动物能保持在相机视野范围内，即可使用 IRT 相机远程连续采集皮肤温度数据，从而有可能完整记录温度反应过程，并在个体间进行比较。尽管已有研究证明鸡的体表温度会对急性应激产生反应26，但本研究的新颖之处在于，它以比以往研究更高的时间分辨率测量了野生动物的体表温度，并且证明在温度、湿度和天气条件多变的野外环境中，仍可检测到预期的皮肤温度下降。本文旨在描述利用热成像技术测量自由活动动物皮肤温度所需的方法学流程。我们通过捕捉自由生活的蓝山雀（Cyanistes caeruleus, Linnaeus 1758）以诱发轻度急性应激，详细说明如何获取合适的图像资料、分析图像并处理数据，从而绘制出皮肤温度随时间变化的响应曲线，展示鸟类在轻度应激刺激下皮肤温度显著降低的现象。该方法可为生态学家、保护生物学工作者、生理学家以及动物福利研究人员提供一种评估野生和圈养动物应激状态的有价值替代手段。
该研究在17至th 2013年12月，以及4th 2014年1月，在一片落叶栎树林中（栎属 苏格兰洛蒙德湖东岸，位于西中部苏格兰（56.13°N）格拉斯哥大学苏格兰生态与自然环境中心（SCENE）的（spp.）森林&#160;4.13°W）。该方案包含三个主要步骤：（1）设置适宜条件，以对自由活动的动物进行热成像拍摄；（2）在拍摄热成像视频的同时施加急性应激刺激；（3）从热成像图像中提取并处理数据，用于表征动物对急性应激刺激的反应。在本研究中，我们吸引了一只野生雀形目鸟类——大山雀进入一个取食箱（拍摄装置），在此优化了热成像拍摄条件，随后在鸟类进入箱内后远程关闭取食箱，以施加捕捉应激。热成像采集与数据提取的描述基于我们所使用的设备，不同热成像系统之间可能存在差异。数据处理部分采用开源软件进行说明。

<table><tbody><tr><td>热成像相机</td><td>FLIR</td><td>A65 (f=25 mm)</td><td>紧凑型（106 x 40 x 43 mm），成本低</td></tr><tr><td>热成像分析软件</td><td>FLIR</td><td>ResearchIR v3.4</td><td>支持高速热视频录制和热模式分析</td></tr><tr><td>温度记录仪</td><td>Gemini Data Loggers</td><td>Tinytag Talk 2 TK-4023-PK</td><td>使用配套温度探头可监测 -40 至 +125 &amp;#176;C 范围</td></tr></tbody></table>

利用热成像无创研究自由活动鸟类的应激反应

Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

应激是生物学中的一个核心概念，描述了机体对各种挑战所产生的一系列应急反应。除其他反应外，应激会导致血流重新分布，使血液净流入关键器官，同时引起核心体温升高。这种由应激诱导的体温升高现象可用于评估应激水平。然而，测量核心体温具有侵入性。当血流被重新导向身体核心部位时，外周部位可能降温。本文介绍了一种利用红外热成像技术对中国野生蓝山雀（Cyanistes caeruleus）进行非侵入性外周体温测量的实验方案。在野外，我们通过设置一个放置诱饵的盒子，使鸟类在相机前处于理想位置。在施加轻度应激刺激（关闭盒子从而短暂捕捉鸟类）之前，相机首先对未受干扰的鸟类进行短暂的热成像视频记录，随后记录鸟类被困时的反应。图像中眼区裸露皮肤是温度最高的区域，这使得可从每一帧图像中自动提取眼区最高温度值，再通过人工数据筛选步骤排除最常见的误差来源（如运动模糊、眨眼等）。该方案可提供具有高时间分辨率的眼区温度时间序列，从而实现对应激反应动态过程的非侵入性研究。未来还需进一步研究以验证该方法在应激评估中的有效性，例如探究眼区温度反应是否与应激刺激强度成正比。若得以证实，该方法将为动物应激评估提供一种有价值的替代手段，并广泛适用于生态学、保护生物学、生理学及动物福利研究等领域的科研人员。

展示了9只野生大山雀的研究结果，这些结果说明了通过热成像技术可获取的信息，并证明了在自由活动的动物中能够检测到其眼部区域温度作为应激信号的预期变化。每只鸟在箱门关闭前平均被记录5.1±0.9秒（n=9），从而可以计算出未受干扰状态下的眼部区域温度（基线温度），后续所有测量值均以此为参照。在对9只未施加轻度应激刺激的独立个体（与应激实验所用个体不同）进行的测试中，分析了它们进入诱捕装置并取食时连续20秒的热成像视频片段，结果显示：前5秒内记录到的最高眼部区域温度与前10秒、15秒及20秒内记录到的最高温度之间均存在r > 0.7的相关性（图3）。这表明，进入陷阱后最初几秒内记录到的最高温度值能够代表较长时间内的温度水平，因此采用箱门关闭前约5秒内的平均眼部区域温度作为基线值。本组样本中大山雀的平均基线眼部区域温度为38.4 ± 0.5 °C（均值±标准误），范围介于35.8至39.9 °C之间（n=9）。当鸟类取食达5秒以完成基线眼部区域温度计算后，实验人员随即关闭箱门。所有个体均察觉到箱门关闭，并表现出试图逃离的行为。
陷阱关闭后，眼部区域温度迅速下降，在约10秒后达到最低点，比基线温度低约1.3 °C（图4）。图4展示了基于所有九个个体每秒平均的最大眼部区域温度生成的复合曲线。由于不同个体间眼部区域温度下降的时间和幅度存在差异，该复合曲线掩盖了温度反应的真实程度。分别计算每个个体的平均温度下降值为2.0 ± 0.2 °C，最低温度出现在9.4 ± 2.8 秒时（均值 ± 标准误）。此后，眼部区域温度在接下来的2至3分钟内逐渐回升至基线水平，但在试验结束时尚未完全恢复到基线温度。
<img alt="在森林环境中，三脚架上的摄像机对准木制鸟屋的野生动物监测装置。" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 拍摄区域。 野外装置的设计目的是吸引鸟类进入摄像机视野，并通过一个喂食箱施加轻度急性应激刺激。该装置由胶合板制成，尺寸为25厘米×14厘米，高16.5厘米，前板采用镀锌金属丝网，网孔大小为1厘米×2.5厘米。金属丝网允许红外辐射透过，从而使摄像机能够拍摄到装置内部的鸟类。选择金属丝网是因为玻璃和大多数塑料无法透过红外辐射。在左侧端板上开有一个直径为60毫米的孔，供鸟类进入装置并获取放置在箱体右端的食物。一个温度记录仪探头夹在两片黑色绝缘胶带之间（由黑色箭头标示），固定在前板的右上角，用于记录参考温度。通过关闭箱体，可对箱内的鸟类施加轻度急性应激刺激。实验人员拉动连接入口处旋转门的鱼线，可在鸟类进入后关闭箱体。位于陷阱前方的热成像摄像机记录整个事件过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="鸟类热成像，热图色条，热辐射分析，温度梯度。" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 一只蓝山雀的热成像图。 鸣禽身体的大部分区域被羽毛（或在较小程度上被腿部鳞片）良好隔热，但在正常情况下，眼周皮肤裸露，散发的热量最多，周围则被温度较低的皮肤或背景所包围。在此热成像图中，眼周的黄色表示最高温度，橙色、红色、紫色和蓝色则依次表示温度逐渐降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="斯皮尔曼相关系数折线图，比较三个数据集随时间变化的时间相关性。" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 在不同时段测得的基础体温的重复性。 比较视频片段前1-8秒内记录的最高温度与分别在前10秒、15秒和20秒内最高值上下0.5º范围内多个最高值的平均值（“最大值的均值”）之间的相关系数（分别以红色、蓝色和绿色线条表示）。所有视频片段时长均为20秒（n=9）。在使用更大数据集进行初步分析时，部分“最大值的均值”仅基于单个数值计算，导致所有比较中的rho值相同。这些片段已被从分析中剔除，仅保留“均值”基于超过3个测量值计算的片段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="体温调节图表；时间与基础体温的关系，带有误差范围的数据分析，科学图表。" src="/files/ftp_upload/53184/53184fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 眼区温度对捕获事件的响应。 捕获事件在眼区温度随时间变化的曲线上表现出非常清晰且显著的信号。为了比较不同个体间基础体温的差异，纵轴显示的是眼区温度残差，即实际温度与其个体基础体温的差值。横轴为时间，以陷阱关闭时刻设为 0，鸟类在 3 分钟后被移出陷阱。红线表示平均温度残差，灰色区域代表 95% 置信区间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53184/53184fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

目前需要一种非侵入性的应激评估方法。本文介绍了一种简单的方法，利用热成像技术检测野生蓝山雀在经历轻度急性应激时眼周温度的显著变化。

压力是生物学中的一个核心概念，描述了机体对各种挑战所产生的一系列应急反应。除其他反应外，压力会导致血液中……发生改变

以下方法的总体目标是评估自由活动的动物在不进行人为抓取的情况下，是否会对即时的急性应激源产生反应，评估手段为热成像技术。该方法通过将野生鸟类引诱至热成像相机前方来实现。第二步，鸟类会自行进入一个箱式饲喂器，在此过程中，热成像视频将记录鸟类眼部周围皮肤的基础温度。接下来，关闭作为应激源的鸟类身后的喂食盒，再次记录该鸟类眼部周围的皮肤温度。最终，可通过比较基线状态与喂食盒关闭期间皮肤温度的变化，判断动物是否对外部应激源产生应激反应。该技术相较于现有方法（如应激激素水平测定）的主要优势在于：具有非侵入性、可在未束缚的动物身上实施，并且能够揭示动物对应激的生理反应动态过程。该方法有助于回答生态学、保护生物学、生物学和动物福利领域的一些关键问题，例如动物是否会经历应激反应。首先建立一个拍摄装置，引导鸟类将身体置于摄像机前方。鸟类通过其中一个端壁上的孔进入装置，并可接近位于另一端壁附近的食源。为了使鸟类适应实验装置，在开始记录前的数周内，需在喂食器中提供合适的食物。在此期间，应在喂食器前方放置一个假的三脚架，使鸟类逐渐习惯相机的存在。在记录当天，将与喂食器中相同的食物装入一个顶部中央带有小孔的透明容器中。然后将容器放入饲喂箱中，并使用一小块已知发射率的黑色绝缘胶带将温度探头固定在箱体的一个角落，以确保其在所有记录的图像中均可见。接下来，将一个连接至温度记录仪的热电偶贴附在黑色胶带上，用于以每秒0.1摄氏度的分辨率记录胶带温度，并将记录仪连接至笔记本电脑。随后，将热成像相机置于距饲喂箱中心50厘米的位置，并将相机连接到笔记本电脑。将相机设置为以平均每秒7.5帧的速度拍摄图像，并添加时间戳，同时将图像保存至计算机硬盘。然后将一根鱼线连接到装置的旋转门上，将整个装置移动至距离实验人员约20米处，确保实验人员隐藏在鸟类视线之外，但装置仍处于观察范围内。一旦鸟类进入饲喂箱，让动物在箱内不受干扰地停留约五秒钟。然后拉动鱼线关闭饲喂箱，注意确保鸟类仍位于箱体远端，以便在饲喂箱关闭时尽量降低对鸟类造成伤害的风险。靠近装置后，在相机后方静止站立约三分钟，随后从箱中取出鸟类并将其放飞。为了从每帧中提取出最高眼部区域温度，打开热成像分析软件，然后双击感兴趣的视频。接着，为图像最大值添加一个新的图表，右键点击该图表，将I区域的温度和帧的时间导出为CSV文件。从CSV文件中删除鸟类I区域在对应帧中不可见的所有行。对鸟类体温正常范围之外的低值点重复上述操作。这些数据可用于手动识别在瞬膜覆盖眼睛期间，连续两次读数之间超过 0.2 摄氏度的温度峰值。用于测量环境温度。从温度记录仪下载时间和记录的温度数据，并将其导出到电子表格中。然后在热成像分析软件中，于覆盖温度记录仪探头的黑色绝缘胶带区域绘制一个方框。右键单击该方框，选择“添加新曲线图”以获取该方框区域的平均温度。再右键单击该曲线图，将其数据导出为 CSV 文件。加载三个 CSV 文件：从热成像视频中获取的最大 I 区域温度、黑色绝缘胶带的温度，以及从温度记录仪获取的空气温度，导入 R。然后合并这三个文件。计算热成像视频中黑色遮蔽胶带温度与温度记录仪中空气温度之间的差值。然后对未校准的眼部温度数据进行校正，为每一帧生成校准后的最大眼部区域温度。接着，为每个眼部区域温度值增加0.2，以校正通过网孔拍摄图像所造成的影响。随后，利用峰值搜索算法提取数据中最高且最精确的点，自动执行过滤，去除所有精度较低的眼部区域温度低值。通过减去基线期的持续时间（以秒为单位），将个体间眼部温度反应的时间进行标准化，使陷阱关闭的时刻对应为零秒。然后，根据从关闭箱体前记录到的最高眼部区域温度，对每个个体时间序列的长度进行标准化。选取最高值作为未受干扰状态下鸟类的眼部区域温度基线值。然后通过线性插值法，从绝对温度中减去基线温度（即陷阱门关闭前时段测得的最高温度），对个体间的温度数据进行标准化。填补因未提取到峰值或眼部区域不可见而产生的数据缺失，从而为每个个体获得每秒一个的温度值。最后，利用现有的 R 命令绘制所有个体在陷阱关闭后眼部区域最高温度相对于基线眼部区域温度的偏差图，并包含经自助法（bootstrapped）计算的 95% 置信区间。在热成像图像中，蓝山雀眼睛周围暴露的皮肤呈现黄色，表明该区域为体温最高的部位。身体其他部位呈现的橙色、红色、紫色和蓝色则表示温度逐渐降低。该结果基于对22段热成像视频片段的分析，这些视频记录了未受干扰的野生蓝山雀到达并进入取食装置取食的过程。如前所示，在前五秒内记录到的眼区最高温度与后续温度变化之间存在显著相关性，相关系数R大于0.7。在本实验中，当取食装置关闭后，眼区温度在前10秒内迅速下降，最低温度比基线温度低约1.3摄氏度。针对每位受试者单独计算的平均温度下降为 2.0 ± 0.2 摄氏度，最低温度在 9.4 ± 2.8 秒后达到。在接下来的两到三分钟内，眼部区域温度逐渐回升至接近基线水平，但在试验结束时仍未恢复到基线值。进行该操作时，需牢记这一点。该方法仅可用于判断动物是否处于应激状态，尚需进一步研究以评估其是否能够量化动物应激程度。我们的方法能够展示对急性应激（即即时应激）的反应，而我们实验室的后续工作将聚焦于对持续性和慢性应激的反应。

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神经科学

热成像学习压力非侵入性的无拘无束的小鸟

介绍了一种用于自由活动小鼠的市售遥测发射器植入手术技术，该发射器可连续测量生物电位（单导联心电图）、心率、核心体温和运动活动。同时提供了术后护理和镇痛的建议与操作规程，以促进动物恢复、改善健康状况并提高存活率。...

植入遥测发射器以获取自由活动实验小鼠心电图、心率、核心体温和活动数据

本文介绍了一种利用功能磁共振成像（fMRI）技术对鸣禽大脑中听觉刺激神经基础进行成像的优化流程。该方法涵盖了声音刺激的制备、受试动物的定位、fMRI数据的采集以及后续分析过程。...

鸣禽听觉刺激下的功能性磁共振成像（fMRI）

在本视频报告中，我们展示了切伦科夫发光成像（CLI）技术在小鼠肩胛间棕色脂肪组织中的应用，涵盖其在激活状态和抑制状态下的成像结果。...

肩胛间棕色脂肪组织的切伦科夫发光成像

非束缚式脑电遥测技术是一种有价值的实验方法，可用于在自由活动的啮齿类动物中长期记录体内脑电图。本详细方案描述了立体定位下在不同脑区进行硬膜外和深部脑内电极植入的操作步骤，以实现对中枢神经系统节律性活动及相关行为阶段的可靠记录。...

非束缚式脑电遥测：硬膜外与深部脑内立体定位脑电电极植入

将演示一种用于实时无创小动物成像的临床手持式光声成像系统。...

用于实时无创小动物成像的手持式临床光声成像系统

本方案描述了利用热成像相机和热水浴，对去毛的鸟类标本进行热传导量化的方法。该方法可利用干燥的去毛皮肤标本，获得关于不同物种羽毛覆盖层热性能的定量、可比较数据。...

使用热成像相机测量鸟类羽毛覆盖层的热量散失

在热应激过程中测量心率，有助于了解生物体因急性环境变化而产生的生理反应。本实验方案以美洲龙虾（Homarus...

用于无脊椎动物晚期心率微创测量的阻抗呼吸描记法

本文介绍了一种用于测量人类和实验动物餐后棕色脂肪组织活性的实验方案。...

红外热成像技术用于检测棕色脂肪组织活性变化

在本视频文章中，我们介绍了一种利用红外捕获（IR）型激光显微切割技术（LCM）从三龄幼虫中分离单个或多个黑腹果蝇（Drosophila）da神经元的方法。从分离的神经元中获得的RNA可直接用于后续实验，包括定量逆转录PCR（qRT-PCR）或微阵列分析。...

激光捕获显微切割 果蝇 外周神经元

在此，我们介绍一种快速、可靠且简便的方法，用于确定大鼠或小鼠出现伤害性防御行为的最低温度。 即 的 热伤害感受性阈值...

糖尿病大鼠热伤害性感受阈值的快速测定

学习利用红外热成像技术对野生蓝山雀（Cyanistes caeruleus）进行非侵入性急性应激反应监测的方法。通过记录眼部区域皮肤温度变化，研究人员可在不直接接触鸟类的情况下实时评估其生理应激动态。

利用热成像无创研究自由活动鸟类的应激反应

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