利用相关显微技术研究完整细胞中表皮生长因子受体的化学计量比

以下实验的总体目标是利用荧光显微镜和电子显微镜，观察完整且处于水合状态的细胞质膜中表皮生长因子受体（EGFR）的分布及其化学计量关系。首先，在微芯片上培养表达EGFR的细胞（例如cos seven细胞），该微芯片中央区域设有由50纳米厚氮化硅膜构成的窗口。随后，将细胞与生物素标记的表皮生长因子孵育，该因子可结合受体并诱导EGFR构象改变，从而引起受体二聚化和活化。

接下来，固定细胞以固定受体，并与去包被的Hagen偶联量子点孵育，这些量子点可结合被EGF激活的受体，随后对细胞进行成像。最后，使用戊二醛进行第二次固定，使去包被的Hagen与偶联量子点交联并固定在EGFR上，从而稳定样品以用于电子显微镜观察。结果显示，通过荧光量子点成像可观察到红色荧光信号，而通过扫描透射电子显微镜可获得EGFR的分布、化学计量状态或簇集情况。

该方法可提供关于完整细胞中膜受体储存形态及其分布的独特信息，可用于深入了解表皮生长因子受体在正常细胞和癌细胞中的激活机制。该方法也可用于研究其他膜受体，例如离子通道。开始操作时，在化学通风橱内进行。对于氮化硅膜微芯片的初始制备步骤，在按照文本方案浸入丙酮后，立即将微芯片转移至盛有乙醇的烧杯中，静置两分钟，随后将芯片从乙醇中取出，并放置于洁净室专用纸巾上。

芯片干燥后，将其转移至先前放入培养皿中的载玻片上，然后盖上培养皿盖子。接着，将带有微芯片的载玻片放入等离子清洗仪中。

运行五分钟的标准清洗程序，使氮化硅膜表面变为亲水性。随后在超净工作台内，将微芯片从玻璃上转移。将其滑入洁净室擦拭纸上，然后放入含有聚-L-赖氨酸溶液（PLL）的24孔板的一个孔中，孵育五分钟。

然后，将微芯片逐个转移至含有HPLC级水的第二个孔中，再在另一个水孔中冲洗。最后，将微芯片分别放入96孔板中含DM的孔内，并将该板置于二氧化碳培养箱中，使用COS七细胞亚培养。制备浓度约为5×10⁵的单分散细胞悬液。

每毫升含第五代细胞。取一滴细胞悬液加入96孔板的每个微芯片中，在室温下孵育5分钟，并使用倒置显微镜进行观察。开始检查微芯片的区域，以达到每个150乘以400微米窗口内约20至30个cos七细胞的密度。

当细胞充分贴壁后，小心地将带有细胞间隔的微芯片转移至含有 dm 的新孔中。当有足够数量的细胞保持贴壁时，将细胞面向上的微芯片转移至含有无血清 dmm 的新孔中。随后，将微芯片置于二氧化碳培养箱中，在 37 摄氏度下孵育数小时至过夜，以进行后续步骤。

使用96孔板，向各孔中补充所需的溶液，每张微芯片使用一列。将微芯片放入含有新鲜BSA-GE-LPB-S的孔中进行清洗，并在37摄氏度下孵育5分钟。随后将微芯片转移至300纳摩尔的EGF生物素溶液中，再次放入孵育箱中孵育3分钟，因为细胞将开始内吞带有EGF标记的EGFR。

迅速使用 PBS 清洗微芯片三次。然后使用 0.1 摩尔的儿茶酚缓冲液（CB）清洗样品。接着，将微芯片转移至 3% PFA 中，孵育 10 分钟。

用CB冲洗一次，再用PBS冲洗三次后，将芯片转移至G-L-Y-P-B-S中，孵育两分钟。然后用PBS冲洗两次。接着，将微芯片置于10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D中放置10分钟，随后用B-S-A-P-B-S冲洗四次。

然后将一个微芯片浸入预先加入室温 B-S-A-P-B-S 的玻璃底 35 毫米培养皿中，用于通过微分干涉差（DIC）和荧光显微镜观察细胞。使用 40 倍空气物镜获取用 QD 655 标记的细胞的概览图像。使用激发波长为 340 至 380 纳米、发射波长高于 420 纳米的滤光立方体。

降低光照强度，以避免过强的光线可能对样品造成损伤。将曝光时间设置为至少300毫秒，以便捕获所有量子点的信号，因为量子点荧光会闪烁；调整光照强度和放大倍数，使图像明亮且无可见图像噪声，同时尽量降低光照强度。成像后，将微芯片放回含有BSA-PBS的96孔板中。

用 cb 冲洗一次，然后转移至 2% 戊二醛中，再次孵育 10 分钟。洗涤后，使用 B-S-A-P-B-S 对微芯片清洗三次，随后将其储存在新 96 孔板中预先装有 B-S-A-P-B-S 的孔内，每个微芯片对应一个孔。在 96 孔板中另取一列四个孔，每孔加入 HPLC 级水。

按照文本方案设置环境扫描电子显微镜（ESEM）后，将96孔WAT板从冷却容器中取出并靠近打开的ESEM样品台放置，以将样品载入预冷却的ESEM STEM样品台。在其旁边放置一片洁净室专用纸巾。迅速将微芯片浸入装有HPLC级水的孔中，每次1秒，重复4次，进行快速冲洗。

用纸巾轻轻吸干微芯片背面，将其放入预冷的载物台中，并加入3 µL预冷的HPLC级水。润湿样品表面，并将样品固定在载物台上。然后在样品附近的载物台位置再滴加三滴各3 µL的水，随后关闭样品室。

在确定目标细胞后，根据文本方案记录该细胞的扫描透射电子显微镜（STEM）概览图像，移动至细胞边缘区域（可见细胞边界处），并将放大倍数调至50,000倍。记录显示单个量子点（qds）的图像，使用20至30微秒的像素驻留时间。图中所示为完整、充分水化的COS-7细胞中，膜结合型EGFR经QD 655标记后的结果。此处的微分干涉差（DIC）图像展示了细胞膜的表面形貌，对应的荧光图像则显示了在EGF生物素孵育三分钟后，EGFR在细胞整个表面的分布情况。

这些低倍率环境扫描电镜透射成像显示了从细胞延伸至邻近细胞的伪足，以及较薄细胞区域内部的一些结构。较厚的细胞中央区域（包括细胞核）呈现白色，这是因为电子能量不足以穿透样品。高分辨率。

较薄的周边区域的环境扫描电镜扫描透射成像显示，量子点标记位于对角线方向穿过图像的膜折叠上。该膜结构在多个位置的EGFR密度高于周围膜区域，且有两个标记彼此靠近。用箭头标示了两个间距分别为20和24纳米的示例。

这些成对的标记被解释为属于EGF受体（EGFR）。该图像记录的是EGFR密度和荧光信号较低的区域。尽管如此，此处仍检测到EGFR以二聚体形式存在，并出现了两个由10或11个EGF组成的簇。

一旦掌握，样品制备可在两小时内完成，远快于常规电子显微镜技术。随后的essem STEM成像可在半天内提供多达100张高分辨率图像。