Name: 采用数字液滴PCR技术检测BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋的参考标准细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习使用数字液滴PCR技术检测BRAF V600E突变的方法，从福尔马林固定石蜡包埋样本中自动提取高质量基因组DNA。该技术可在四小时内处理多达48个样本，为分子肿瘤学研究提供可靠的低频突变检测方案。

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本研究由R资助&amp;#38;D 计划&#160;韩国科学与信息通信技术部资助的国家研究基金会（NRF） &amp;#38; 未来规划（资助编号：2013M3C8A1075908）。

1. 从FFPE参考标准细胞系中提取DNA
注意：本实验中，使用FFPE组织DNA提取试剂盒，按照下述方案从FFPE参考标准细胞系（HD598、HD593、HD617、HD273及野生型（WT））中提取DNA。通过遵循生产商提供的总DNA提取说明，实现了DNA的自动化提取。
<ol>
	<li>根据既定操作流程，使用切片机和原始的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，在进行DNA提取与分析前手工制备新鲜切片。确保所分析的组织切片样本总厚度不超过10 µm，单张切片的表面积不超过600 mm2。</li>
</ol>
1.2 TPS 实验方案
注意：表1中所示体积为处理48个样本所需的最小体积，所示操作步骤遵循TPS指南。实验开始前，通过离心将FFPE样本在e管中沉淀。&#160;在自动程序中以600 × g离心，以避免样品损失。
<ol>
	<li>打开自动DNA提取仪和计算机。启动运行控制软件，并将自动加载托盘插入TPS甲板加载区域。</li>
	<li>按照 图&#160;1 所示，将试剂分别加入对应的试剂槽中。
	<ol>
		<li>将4个样本（BRAF WT、BRAF V600E 50%、5% 和 1%）放入样本载体架中。</li>
		<li>将吸头盒放入第2列和第3列的试剂槽中，并检查每个吸头内是否含有一个以上的滤芯，否则将导致运行中止。</li>
		<li>通过倒置3–5次确保裂解缓冲液和洗涤缓冲液充分混匀，并将其加入第4列对应的试剂槽中（图&#160;1）。</li>
		<li>倒置数次或轻微涡旋混匀后，将洗脱缓冲液、磁珠和FFPE缓冲液加入第5列的小试剂槽中，按指示留出一个空位（图&#160;1，表&#160;1）。</li>
		<li>将一个2&#160;ml&#160;深孔板（DWP）放置于板载体上（图&#160;1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始运行前执行以下最后步骤：
	<ol>
		<li>打开所有试管和试剂槽的盖子。确认液体废液瓶有足够的容量。确认固体废液瓶为空且内衬有生物危害袋。确认吸头弹出板位于废液组件中央。</li>
		<li>关闭前盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动软件，打开NA_Prep_Main_MLSTARlet.med文件。</li>
	<li>点击“开始”。仪器状态将从空闲切换为运行中。</li>
	<li>输入本次运行的样本数量。选择本次运行所需的方法（DNA = 0）。输入首个高容量吸头的位置，若所有托盘均装满则选择“1”。输入首个标准容量吸头的位置，若所有托盘均装满则选择“1”。 
	注意：随后仪器将自动执行各步骤，无需用户干预。详细工作流程见 图&#160;2。实验完成后，试剂废液和吸头将被注入废液组件中。</li>
	<li>采用荧光定量法对纯化的基因组DNA进行定量。 
	注意：浓度不低于3.3 ng/µl&#160;的DNA样本将用于ddPCR分析（第2节）。</li>
</ol>
2. DNA突变谱分析：数字PCR方案
注意：DNA突变谱分析的实验方案包括3个主要步骤：1）液滴生成，2）常规PCR扩增，3）液滴读取，以及4）DNA突变谱分析。
2.1. 液滴生成
注意：建议使用 ddPCR 超混合液进行 ddPCR，因为该混合液含有生成液滴所需的试剂。
<ol>
	<li>为避免污染，请遵循标准预防措施，例如佩戴手套、使用洁净的PCR操作台、洁净的移液器以及低蛋白结合力的离心管。</li>
	<li>确保人基因组DNA样本的最低浓度为3.3 ng/µl。注意：纯化后DNA样本的浓度将根据突变频率检测百分比的分析结果而有所不同。</li>
	<li>在96孔PCR板中配制反应体系。将反应组分解冻并平衡至室温（RT）。通过将2X ddPCR超级混合液（10 µl）、20倍引物（正向和反向，900 nM）和探针（250 nM）与每份纯化的DNA样本（66 ng/2 µl）混合，并用蒸馏水补足至20 µl&#160;（按照液滴生成仪操作说明书进行）。</li>
	<li>充分涡旋混匀以确保均一性，并短暂离心使液体沉降至管底后再进行分装。将20 µl&#160;反应液加入到微滴生成卡盒中用于生成液滴。</li>
	<li>按照制造商推荐的操作流程运行液滴生成仪：
	<ol>
		<li>将卡盒插入支架中，确保卡盒的缺口位于支架的左上方。向中间孔加入含有样本的20 µl&#160;反应混合液，向底部孔加入70 µl&#160;生成油。</li>
		<li>将密封垫圈覆盖在卡盒顶部，并确保垫圈两端牢固地固定在支架上；否则将无法产生足够的压力以完成液滴生成。</li>
		<li>按下仪器顶部的绿色按钮打开液滴生成仪，插入卡盒。当支架处于正确位置时，电源指示灯（右前方）和支架指示灯（中间右方）均显示为绿色。</li>
		<li>再次按下仪器顶部按钮关闭舱门，启动液滴生成过程。注意：按下按钮后，歧管会自动定位至出口孔上方，将油和样本通过微流控通道吸入，在此过程中形成液滴。液滴流入液滴收集孔并逐渐积聚。液滴指示灯（右侧）在10秒后开始闪烁绿色，表示液滴生成正在进行中。</li>
		<li>当液滴生成完成后，三个指示灯均变为稳定的绿色；按下按钮打开舱门，从仪器中取出支架。取下支架上的一次性密封垫圈并丢弃。注意：卡盒的上部孔中含有生成的液滴，中部和下部孔几乎为空，仅残留少量油。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.2. PCR 准备
<ol>
	<li>每个样本中移取 40 µl&#160;将液滴内容物从上样孔转移至推荐的96孔PCR板中的单个孔，具体操作参见仪器制造商的使用说明。注意：建议使用多通道移液器转移乳化液滴。为尽量减少转移过程中液滴的剪切，建议缓慢轻柔地吸取液滴。</li>
	<li>将液滴转移至PCR板后，立即用铝箔密封，以防蒸发。使用可穿刺的铝箔板封膜，确保其与PCR板封膜仪及液滴读取仪的针头兼容。按照PCR板封膜仪使用说明书中的操作步骤进行封膜。</li>
	<li>将封板仪的温度设置为 180 °C，时间设置为 5 秒。</li>
	<li>触摸箭头以打开托盘门。将支撑块放置在托盘上，使96孔面朝上。将96孔板置于支撑游戏副本上，并确保所有孔板孔位与支撑块对齐。</li>
	<li>用一张可穿刺的箔膜密封96孔板。将96孔板固定在支撑块上并覆盖可穿刺箔膜密封后，按下密封按钮，托盘将自动闭合并开始热封。</li>
	<li>热封完成后，门会自动打开；从加热模块中取出反应板进行热循环，然后移除加热模块。</li>
	<li>确保用封板膜完全密封板上的所有孔，检查每个孔上方的膜是否有明显凹陷。密封完成后，即可进行热循环。</li>
	<li>液滴去除后，按压卡盒架上的卡扣以打开卡盒架。取出空卡盒并丢弃。</li>
	<li>按照文中详述的参数进行常规PCR扩增&#160; 表2.</li>
</ol>
2.3 液滴读取（按照制造商推荐的方案）
注意：在液滴中对核酸靶标进行PCR扩增后，液滴读取仪使用双色检测系统对每个液滴进行单独分析13。我们通常设定检测FAM和VIC报告荧光染料。
<ol>
	<li>点击“冲洗系统”以启动液滴读取仪，并使其准备好进行数字PCR分析。</li>
	<li>将反应板装入液滴读取仪，然后点击“开始”。液滴读取仪会依次吸取每个样本，将液滴单个化，并使其单列通过一个双色检测器。检测器读取液滴信号，以统计阳性与阴性样本的数量。</li>
	<li>当液滴读取完成后，打开门并从仪器中取出板架。从板架中取出96孔PCR板并丢弃。</li>
	<li>为确保正确维护，根据需要更换液滴读取仪用油并清空废液容器。向废液瓶中加入50 ml&#160;的10%次氯酸钠溶液，以防止微生物生长。</li>
</ol>
2.4 DNA突变谱分析（按照生产商推荐的实验方案）
注意：使用数据分析软件对PCR阳性与PCR阴性液滴进行计数，以数字形式对目标 BRAF V600E DNA突变进行绝对定量。
<ol>
	<li>单击“设置”以输入有关样本、检测和实验的信息。</li>
	<li>在“设置”窗口中加载一个酶标板文件（filename.qlp），然后单击“分析”以打开并分析数据。数据分析界面分为三个窗口：结果表、孔位选择器和处理后数据/图形显示。</li>
	<li>在“处理后数据”窗口中，每个靶标的浓度数据会显示在酶标板图的相应孔位中，并在“结果表”中进行列表。单击“浓度”可查看浓度图中的数据可视化结果。</li>
</ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
<li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li>
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<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li>
<li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline%2C+%27definetherain%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virological+methods%22%5BJournal%5D)">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li>
<li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943(2013).</li>
<li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li>
<li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li>
<li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li>
<li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+detection+and+quantification%22%5BJournal%5D)">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li>
<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
<li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li>
<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh、Si Eun Kim 和 Young Deug Kim 是 ABION CRO 的员工。

本文重点介绍了利用数字微滴式PCR（ddPCR）技术及从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系样本中提取DNA，用于特定基因突变检测的适用性。本研究采用TPS自动化DNA提取方法，该方法易于适应、自动化操作，并可同时处理多达48个不同样本，适用于大规模实验且可降低变异程度。本工作中DNA提取的一个局限性在于，每个FFPE样本均具有独特性，在表面污染物、微生物群落和/或人类遗传背景方面彼此存在差异。总体而言，提取所得DNA的质量与产量，以及全基因组DNA扩增的成功率，依赖于提取前、提取过程中及提取后多个参数的影响。这些参数包括组织类型和数量、用于组织保存的固定剂类型、固定时间、石蜡包埋块的保存年限及储存条件，以及待分析DNA片段的长度16。从组织中去除石蜡是成功提取DNA最关键的步骤，未完全溶解的石蜡会导致样本质量下降。在微滴生成过程中，必须注意避免气泡形成——这是成功检测突变的另一个关键步骤。考虑到不同样本群体之间可能存在的样本间差异，以及实验目的的不同，可能需要对实验流程进行某些调整，以获得理想的实验结果。
另一个优势是，本方案中采用自动化系统进行D...

关键调控基因中遗传突变的积累会改变细胞正常的程序，如细胞增殖、分化和存活，从而导致癌症1。RAS-RAF-MAP激酶通路介导细胞对生长信号的响应。致癌性BRAF突变可能源于&#160;BRAF&#160;基因的驱动突变，这可能导致BRAF癌蛋白过度活化2。&#160;&#160;BRAF&#160;基因的突变还会导致通过MEK和ERK的下游信号通路过度活化3，进而引起细胞生长和增殖失控，不再依赖于生长&#160;因子介导的调控4-6。
目前已有多种工具可用于DNA突变谱分析，例如通过微滴式数字PCR（ddPCR）对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的参考标准细胞系中的&#160;BRAF V600E突变进行定量分析。ddPCR是一种基于PCR的绝对定量方法，相较于传统的定量实时PCR（qPCR）具有更高的准确性7,8。ddPCR在检测DNA模板中稀有突变方面也具备更强的分辨能力和准确性，有助于开展更具信息量的癌症研究与诊断9。与传统qPCR相比，ddPCR的其他优势还包括在分析低拷贝数模板时具有更高的灵敏度和精确度10-12。本文展示了一种从FFPE参考标准细胞系中自动提取DNA，并通过ddPCR检测BRAF V600E突变是否存在的一整套实验方案。同时描述了数据分析软件的使用方法以及结果的图形化呈现方式。整个操作流程相对简便，具体耗时主要取决于待分析样本的数量以及可用的传统PCR仪和ddPCR仪的数量。
以下方案描述了使用组织制备系统（Tissue Preparation System, TPS）在全自动仪器上对BRAF V600E阳性福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系（HD598、HD593、HD617、HD273及野生型（WT））进行处理的标准操作流程。随后，采用数字液滴PCR（ddPCR）系统对提取的DNA样本进行BRAF V600E突变检测。在所有样本完成检测并将数据导入数据分析软件后，进行靶向突变分析。根据所研究样本/组别的数量，数据分析可能需要一至数小时。该方法的实验部分要求在将&#160;<a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="从酵母中分离核酸，JoVE科学教育视频，进一步解释RNA相关背景">DNA</a>&#160;和&#160;<a href="http://www.jove.com/science-education/5034/introduction-to-serological-pipettes-and-pipettors" title="血清移液管与移液器简介，JoVE科学教育视频，进一步解释移液操作的背景">移液</a>操作精确地加入96孔板的过程中保持操作准确性，而数据分析则通过软件完成。

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD 仪器</td><td>Siemens</td><td>10701001</td><td>自动化 DNA 提取仪器</td></tr><tr><td>QX200 微滴生成仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 微滴读取仪</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>具备升降温速率调节功能的传统 PCR 仪</td><td></td><td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 板封膜仪</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft 软件</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT 组织处理试剂盒 1 号&amp;nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT 组织处理试剂盒 1 号&amp;nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE 吸头</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 突变分析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td>2X 浓度</td></tr><tr><td>DG8 微滴生成卡盒&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>微滴生成用油</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>密封垫圈</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>微滴读取用油</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

采用数字滴定pcr检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的braf v600e突变

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

数字滴定PCR（ddPCR）是一种高灵敏度的PCR方法，利用水-油乳液系统进行检测。通过使用液滴生成器，将提取的核酸样本分割成约20,000个纳米级的水包油液滴，PCR扩增在各个独立液滴中进行。ddPCR方法可用于检测序列突变、拷贝数变异以及涉及靶向基因的特定结构重排。本文展示了ddPCR作为一种强大技术，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中精确定量罕见的BRAF V600E突变的应用，这对于识别癌症患者具有重要意义。总之，ddPCR技术有望在多种类型的FFPE样本中精确分析不同基因的特定罕见突变。

在我们的数字滴定PCR（ddPCR）分析中，研究了BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系。液滴读取仪连接至运行数据分析软件的笔记本电脑。每个液滴根据其荧光强度被判定为阳性或阴性。制造商提供的软件还允许用户自定义阈值，以确定阳性与阴性液滴之间的界限。通过样本中阳性与阴性液滴的数量，可计算出目标分子的浓度，单位为拷贝数/µl。
通过检测荧光信号并将其处理为二维散点图显示，使用定制软件为每个液滴终点簇绘制适当的门控区域，并统计各门控区域内液滴的数量。如图3A所示，所有样本中位于截断线（粉红色线）以上的蓝色点所代表的液滴（FAM荧光信号）为BRAF V600E突变阳性。在BRAF野生型（NTC；第2泳道）样本中出现的蓝色点可能源于非特异性信号（假阳性）。假阳性信号（BRAF WT）已与其他突变样本进行归一化处理。如图3B所示，野生型BRAF液滴由绿色点表示（VIC荧光信号）。在两个图中，底部的灰色点被...

本视频旨在演示如何进行&#160;从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞系中自动化提取DNA及数字滴定PCR&#160;(ddPCR) 分析用于在临床环境中检测稀有突变。在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中检测突变，证明了 ddPCR 在 FFPE 样本中的临床应用价值。

采用数字滴定PCR检测福尔马林固定石蜡包埋参考标准细胞系中的BRAF V600E突变

ddPCR 是一种高灵敏度的 PCR 方法，利用水-油乳液系统。通过使用液滴生成器，将提取的核酸样本...

本实验的总体目标是利用组织处理系统，从福尔马林固定石蜡包埋的参考标准细胞系中分离人类基因组DNA，随后采用数字液滴PCR（ddPCR）技术分析基因组DNA中的BRAF V600E突变。数字液滴PCR可帮助解答分子肿瘤学中的关键问题，例如检测RA序列突变的存在与否及其丰度，并在模板拷贝数较低的情况下实现核酸的精确定量。尽管本方法以标准细胞系进行演示，但也可应用于其他生物样本，只需确保针对目标DNA的提取条件进行优化即可。该组织制备系统可在四小时内分离出多达48份无污染的人类基因组DNA样品，相较于其他手动操作方法具有明显优势。由于使用了磁珠，该系统的制备成本相对较高。然而，该方法更安全，且能产生高质量的产物。演示操作将由我们实验室的一名技术人员A和一名技术人员完成。将使用组织制备系统（TPS）方案，在全自动DNA分离仪中进行DNA提取。首先打开仪器和计算机，启动运行控制软件，并将自动加载托盘插入TPS平台的加载区域。接下来，按照本图所示，将试剂分别加入对应的槽中，并将四个样本放入样本载体架中。通过倒置3到5次，确保裂解缓冲液和洗涤缓冲液充分混匀，然后将其加入第4列相应的槽中。倒置混匀数次或轻微涡旋后，将洗脱缓冲液、磁珠和FFPE缓冲液加入第5列的小槽中，按指示位置留出两个槽为空。将一个2毫升深孔板放置到板架上。在开始运行前，务必盖紧所有试管和试剂槽的盖子。确认液体废液瓶有足够的容量，并且固体废液瓶为空，且已用生物危害袋衬垫。确认吸头弹出板位于废液组件中央。关闭前面板，启动软件，打开核酸提取主程序 ML starlet，执行 med 文件。单击开始。仪器状态将从空闲变为运行中。输入本次运行的样本数量。选择本次运行所需的移液方法。输入第一个高容量吸头的位置，并选择一个。如果所有托盘均已装满，则输入第一个标准容量吸头的位置，并选择一个。如果所有托盘均已装满，仪器将自动执行后续步骤，无需用户干预。此处展示详细的实验流程，以避免污染。请遵循标准预防措施，例如佩戴手套并在洁净的PCR操作台中进行操作。使用洁净的移液器和低蛋白结合度的离心管。在PCR条形管中配制反应混合液，将反应组分解冻并平衡至室温。用于数字液滴PCR或D-D-P-C-R分析的人基因组DNA样本，其最低浓度必须为3.3 纳克/微升。配制PCR反应体系。将两份X-D-D-P-C-R预混液、20倍浓度的正向引物、反向引物和探针与每份纯化的DNA样本混合，并用蒸馏水定容至20微升。充分涡旋振荡混合液以确保均匀，短暂离心使管内液体全部沉降至管底，然后再进行分装。按照制造商推荐的方案操作液滴生成仪。将试剂盒插入支架中，确保试剂盒上的缺口位于支架的左上方。向中间孔中加入 20 µL 含样品的反应混合液，向底部孔中加入 70 µL 生成油。将垫圈固定在卡盒顶部。确保垫圈两端牢固地钩在支架的两侧，否则无法产生液滴生成所需的足够压力。按下仪器顶部的绿色按钮，打开液滴生成器。当支架处于正确位置时，插入 cartridge。电源和支架指示灯均为绿色。再次按下仪器顶部的按钮以关闭门并启动液滴生成。10秒后，液滴指示灯将闪烁绿色，表示液滴生成正在进行。当液滴生成完成后，三个指示灯均会变为稳定的绿色。按下按钮打开门，从设备中取出支架。取下支架上的一次性垫圈并丢弃。请注意，芯片的上部孔中含有液滴，而中部和下部孔几乎为空，仅在液滴生成后残留少量油。准备进行常规PCR扩增。按照仪器制造商的操作说明，将每个样品管中微滴从 cartridges 的顶部孔转移至推荐的96孔PCR板中的单个孔，每孔转移40微升，吸取微滴时应缓慢轻柔，以尽量减少转移过程中微滴的剪切。微滴转移完成后，必须立即密封PCR板，以防止蒸发。将封板仪的温度设置为 180 摄氏度，时间设置为 5 秒。按箭头打开托盘门。将支撑块放置在托盘上，使 96 孔面朝上。将 96 孔板放置在支撑块上，并确保所有板孔与支撑块盖对齐。使用一张箔膜密封 96 孔板，所用箔膜板密封条需与 PCR 板封膜仪及液滴读取仪中的针头兼容。当 96 孔板固定在支撑块上并用可固化箔膜密封后。按下密封按钮。托盘将关闭并开始加热顶盖。密封完成后，门会自动打开。从加热模块上取下反应板，然后移除加热模块。通过检查每个孔上方的凹陷处，确保反应板的所有孔均已密封。每个孔上方的铝箔密封情况应清晰可见。密封后，将微孔板置于热循环仪中进行扩增。按照方案文本中详述的参数进行常规PCR扩增。待液滴中核酸靶标的PCR扩增完成后。下一步是使用双色检测系统对每个液滴进行单独分析。通常，液滴读取仪会设置为检测FAM和VIC报告荧光染料。单击“冲洗系统”以启动液滴读取仪，并使其准备好进行D-D-P-C-R分析。将反应板放入液滴读取仪中，点击开始。当液滴读取完成后，打开门并从仪器中取出板架。取出96孔板并弃置。随后使用协议文本中所述的数据分析软件进行DNA突变谱分析。在此D-D-P-C-R分析中，研究了RAF V600E突变。荧光信号被检测并处理成二维散点图显示。使用自定义软件绘制适当的门控区域，并统计每个门控区域内液滴的数量。所有样本中位于粉红色截断线以上的蓝色点所代表的液滴为阳性。在两个图中，突变型RAF V600E野生型bra液滴由绿色点表示。底部的灰色点被视为荧光背景。随后根据检测到的野生型 bra 和 brav V600E 模板浓度的相对百分比计算出总的突变等位基因频率。一个学期。在此姿势下，个体分析可在四小时内完成。其他样本，例如 A PPT 液体活检，可用于回答更多问题，如癌症进展监测，在其开发之后。该技术为分子肿瘤学领域的伴随诊断研究人员探索多种突变检测铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何操作组织处理系统及数字微滴 PCR-SA，以实现特定点位的 DNA 突变检测。

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