采用数字液滴PCR技术检测BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋的参考标准细胞系

本实验的总体目标是使用组织制备系统从正式和固定石蜡包埋的参考标准细胞系中分离人基因组 DNA，然后使用数字液滴分析基因组 DNA 中的 bra V 600 E 突变。P-C-R-D-D-P-C-R 可以帮助回答分子肿瘤学中的关键问题，例如 RA 序列突变的存在和丰度以及低模板拷贝数核酸的定量。尽管该方法自标准细胞系以来已在 AEP 中得到验证，但它们也可用于其他生物样品，以确保您优化分离目标 DNA 的条件。

与其他手动作程序相比，该组织制备系统可用于在 4 小时内分离多达 48 个无污染的人基因组 DNA 样品。由于使用磁珠，该系统的制备成本有些高昂。然而，它更安全，生产质量更高，质量更高 展示压力的将是 ssu A 和我们实验室的一名技术人员。

DNA 提取将使用组织制备系统或 TPS 方案在全自动 DNA 分离仪器中进行。首先打开仪器和计算机。打开运行控制软件，将自动加载托盘插入 TPS 甲板加载区域。

接下来，如图所示，将试剂分配到相应的槽中，将四个样品放入样品架中。将裂解缓冲液和洗涤缓冲液倒置 3 到 5 次，然后将它们加载到第 4 列的相应槽中，确保它们正确混合。倒置几次或轻度涡旋后，将 Elucian 缓冲液磁珠和 FFPE 缓冲液加载到第 5 列的小槽中，在指示处留出两个空槽。

将 2 mL 深孔板加载到板托架上。在开始运行之前，UNC 盖上所有试管和试剂槽。确认液体废物瓶中有足够的容量，并且固体废物瓶是空的，并衬有生物危害袋。

确认吸头弹出板位于废液组件的中央。合上前盖，启动软件，打开 NA prep main ML starlet。Do med file.

单击 start。仪器状态将从 Idle （空闲） 切换到 Running （正在运行）。输入此运行的样本数。

为此运行选择所需的方法。输入第一个高容量吸头的位置，选择一个。如果所有样品盘都已满，请输入第一个标准体积吸头的位置，选择一个吸头。

如果所有托盘都已满，仪器将执行自动化步骤，无需用户干预。此处显示了详细的工作流程，以避免污染。遵循标准预防措施，例如戴手套和使用干净的 PCR 头罩。

清洁移液器和低蛋白结合管。将反应混合物组装在 PCR 试管联管中，解冻并平衡反应组分至室温。用于数字液滴、PCR 或 D-D-P-C-R 分析的人基因组 DNA 样品的最低浓度必须为每微升 3.3 纳克。

准备 PCR 反应。将两种 X-D-D-P-C-R 超级混合物 20 x 正向和反向引物和探针与每个纯化的 DNA 样品混合，并用蒸馏水配制至 20 μL。彻底涡旋混合物以确保均匀性，并在分配前短暂离心以收集试管底部的内容物。

按照制造商推荐的方案作液滴发生器。将卡套插入卡套中，卡套上的槽口位于卡套的左上方。将 20 微升含有样品的反应混合物加入中间孔中，将 70 微升发生油加入底部孔中。

将垫圈安装在墨盒顶部。确保垫圈牢固地钩在支架的两端。否则，将无法获得足够的压力来产生液滴。

按下仪器顶部的绿色按钮打开液滴发生器。当支架处于正确位置时插入墨盒。电源指示灯和支架指示灯均为绿色。

再次按下仪器的顶部按钮，关上门并开始产生液滴。液滴指示灯在 10 秒后呈绿色闪烁，表示液滴生成正在进行中。液滴生成完成后，所有三个指示灯都将变为稳定的绿色。

按下按钮打开门，然后从设备上取下支架。从支架上取下一次性垫圈并将其丢弃。请注意，小柱的顶部孔包含液滴，而中下孔几乎是空的，在产生液滴后会有少量残油。

准备进行常规 PCR 扩增。对于每个样品管，将 40 微升液滴内容物从小柱的顶部孔中输出到推荐的 96 孔 PCR 板的单个孔中，如制造商的仪器方案所示，缓慢而轻柔地吸出液滴，以尽量减少转移过程中的液滴剪切。转移液滴后，必须立即密封 PCR 板以避免蒸发。

将封板机温度设置为 180 摄氏度，并将时间设置为 5 秒。点击箭头打开托盘门。将支撑块放在托盘上，使 96 孔面朝上。

将 96 孔板放在支撑块上，并确保所有板孔都与支撑块盖对齐。带有一张铝箔密封的 96 孔板使用与 PCR 板密封机和微滴读数仪中的针兼容的 parable 铝箔板密封。一旦 96 孔板固定在支撑块上并覆盖有可固化的铝箔密封。

触摸密封按钮。托盘将关闭，加热天花板将启动。热封完成后，门将自动打开。

从加热块中取出板，然后取下加热块。通过检查凹陷，确保板中的所有孔都已密封。箔在每个孔上都很容易看到。

密封后，板即可进行热循环。按照方案文本中详述的参数进行常规 PCR 扩增。一旦液滴中核酸靶标的 PCR 扩增完成。

下一步是使用双色检测系统单独分析每个液滴。通常，微滴检测仪设置为检测 FAM 和 VIC 报告基因荧光四分体。单击冲洗系统以灌注微滴检测仪并使其准备好进行 D-D-P-C-R 分析。

将板加载到微滴检测仪中，然后单击 Start（开始）。液滴读取完成后，打开门并从装置中取出微孔板支架。删除。从支架上取下 96 墙板并将其丢弃。

随后使用数据分析软件进行 DNA 突变分析，如方案文本中所述。在该 D-D-P-C-R 分析中，研究了 RAF V 600 E 突变。检测荧光并将其处理成二维散点图显示。

使用定制软件绘制适当的门，并计算每个门内的液滴数量。对于所有样品，由粉红色截止线上方的蓝点表示的液滴均为正值。对于突变的 RAF V 600 E Wild 型胸罩液滴在两个图中都用绿点表示。

底部的灰点被视为荧光背景。然后根据一个学期检测到的野生型 bra 和 brav V 600 E 模板浓度的相对百分比计算总体突变等位基因频率。可以按照这种姿势在 4 小时内进行 HR 和单独分析。

可以进行其他样本，如 A PPT 液体活检，以回答其他问题，例如癌症进展监测 发展后。这项技术为伴随诊断领域的研究人员探索分子肿瘤学领域的各种突变检测铺平了道路。看完这个视频，您应该对如何针对特定点进行组织制备系统和数字液滴 P-C-R-S-A 进行 DNA 突变检测有了很好的了解。