Name: 早产儿脑病建模使用产前缺氧缺血大鼠羊膜腔内毒素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解如何使用大鼠模型建立早产儿脑病模型，通过产前缺氧缺血和羊膜腔内毒素诱导模拟胎盘功能不全与绒毛膜羊膜炎。该方法有助于研究围产期脑损伤的发病机制并开发针对性治疗策略。

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作者感谢 Dan Firl、Chris Corbett 和 Jesse Denson 博士。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS R01 NS060765）向 SR 提供资助，新墨西哥大学的 P30 CoBRE 试点项目和儿童健康标志性项目向 LJ 提供资助。

波士顿儿童医院和新墨西哥大学健康科学中心的机构动物照护与使用委员会已批准所有实验程序。
注意：在开始操作前，需将所有外科器械和外科敷料进行密封、灭菌并高压灭菌。此外，准备术后用药的无菌小瓶，包括0.125%布比卡因和0.1 mg/kg丁丙诺啡。同时无菌配制脂多糖（LPS）溶液：将0.04 mg/ml LPS（0111:B4）溶于含稀释伊文思蓝染料的无菌生理盐水中。
1. 麻醉
<ol>
	<li>使用由3%异氟烷、70%氮气和30%氧气组成的混合气体，对妊娠18天（E18）的Sprague Dawley大鼠进行麻醉诱导。</li>
	<li>将大鼠从诱导室中取出，仰卧置于设定为37 °C的无菌手术循环水毯上。通过鼻罩给予麻醉气体，并将异氟烷浓度降至2%。</li>
	<li>轻轻在每只眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。在手术过程中持续监测动物的体温、呼吸频率和心率。母体生理状态应在整个操作过程中保持稳定。</li>
</ol>
2. 手术准备与刷手
<ol>
	<li>使用小型动物剪毛器去除下腹部区域的所有毛发。以矩形模式剃毛，注意避免划伤乳头或产生剃刀疹，以免对日后活产仔鼠哺乳造成刺激。</li>
	<li>用无菌棉签交替涂抹聚维酮碘和70%乙醇对腹部皮肤进行消毒。重复擦洗操作，使聚维酮碘和70%乙醇各自交替使用3次。待其自然干燥。</li>
	<li>通过夹捏脚趾无反射确认麻醉深度。若无反射且无疼痛反应，则将异氟烷浓度降至1%。</li>
	<li>使用无菌手术巾覆盖动物。注意以适当角度放置手术巾，使其最大限度吸收灌洗液，同时不阻碍子宫角的血液供应。</li>
</ol>
3. 腹部剖腹术
<ol>
	<li>使用手术刀在已准备好的腹部皮肤上做一条3 cm的正中切口。用剪刀钝性分离皮肤层与腹筋膜。用镊子和手术剪提起腹筋膜层，切开无血管的腹白线以进入腹膜腔。</li>
	<li>将手术纱布置于切口外部，并用无菌生理盐水润湿。用钝头镊子及对外腹部施加轻压，轻柔地将子宫角从腹膜腔中取出，并置于湿润的纱布上。</li>
	<li>操作时应小心避免与肠管缠绕或接触。使用镊子仅接触各羊膜囊之间的肌性组织，小心排列胚胎。通过钝性分离暴露并游离四条子宫动脉。 
	注意：分离子宫动脉时必须格外小心。周围组织及血管本身极为脆弱。母体血管损伤可能导致出血，严重时可导致胎儿及母体死亡。</li>
</ol>
4. 动脉瘤夹的放置
<ol>
	<li>在每侧子宫动脉上放置一个30 G的动脉瘤夹。确保血流完全停止，包括近端和远端脉搏消失，以及子宫血管（包括各个胎盘）颜色变暗。用纱布覆盖暴露的子宫角及整个手术区域，并以无菌生理盐水进行冲洗。注意每约10分钟补充一次冲洗液，保持手术区域湿润。</li>
	<li>60分钟后，移除纱布并冲洗手术区域。确保子宫角和血管充分湿润，以便顺利取下夹子。使用镊子轻柔地逐一取下每个动脉瘤夹。操作时注意避免对血管造成损伤，并在取下过程中保持组织完整性。</li>
	<li>充分冲洗子宫角及手术区域，注意清除羊膜囊上可能残留的任何纱布纤维。</li>
</ol>
5. 向羊膜囊内注射脂多糖
<ol>
	<li>在每个羊膜囊底部、胎盘板前方，向羊膜腔内注射 100 µl 含伊文思蓝染料稀释液的 LPS（4 µg/囊）。使用钝头镊子固定并旋转每个羊膜囊，使其处于最佳注射位置。稀释的伊文思蓝染料作为一种对比剂，有助于确认注射针头位置正确及注射是否成功。 
	注意：羊膜腔内注射必须仅使用带有 8 mm 31 G 针头的超细 0.3 ml 胰岛素注射器。使用较粗的针头将导致慢性羊水流失、胎儿死亡以及妊娠组织被母体吸收。拔出注射器后若出现少量羊水渗漏，可通过直接压迫羊膜囊来减轻。部分大鼠胎儿可能耐受一定程度的羊水过少。然而，若使用较粗针头穿刺造成急性羊水流失，或意外穿刺导致慢性液体渗漏，则会引起胎儿丢失，严重时甚至导致邻近妊娠的丢失。</li>
	<li>用无菌生理盐水冲洗子宫角 3 次。</li>
</ol>
6. 关闭腹腔切口
<ol>
	<li>使用镊子小心将子宫角放回腹膜腔。确保羊膜囊与正中切口之间留有足够空间，用连续的3-0丝线缝合肌筋膜层边缘。缝合肌肉切口时，应注意羊膜囊的位置，避免将缝线穿入或穿过羊膜囊。</li>
	<li>使用连续的3-0丝线缝合皮肤层，关闭皮肤切口。 
	注意：剖腹手术切口应采用两层连续缝合，以适应妊娠进展过程中皮肤和肌肉的扩张。连续缝合可使伤口张力均匀分布。间断缝合不推荐，因其多个线结可能引起刺激，且大鼠在麻醉恢复后容易啃咬线结。不推荐使用外科缝合钉。外科结的线尾应剪得极短（&#60;3 mm）。</li>
	<li>使用26 G针头在伤口边缘周围皮下注射1 ml 0.125%布比卡因&#160;。在颈背部皮下注射一次0.1 mg/kg的丁丙诺啡。</li>
	<li>关闭异氟烷，根据需要擦干大鼠。将其放入清洁的饲养笼中，并监测其从麻醉中恢复的情况。确保大鼠不发生低体温。</li>
</ol>
7. 术后恢复与护理
<ol>
	<li>在72小时内每8-12小时监测大鼠一次，之后每日监测直至幼鼠出生（约E22或E23）。根据IACUC规定，每8-12小时/72小时或按需给予额外剂量的丁丙诺啡。</li>
	<li>监测大鼠是否出现疼痛、不适、阴道出血或手术部位出血。检查缝线和切口，注意确保大鼠未过早啃咬或拆除缝线。尽管极为罕见，但缝线受损的大鼠存在伤口裂开的风险。 
	注意：偶尔大鼠可能因丁丙诺啡给药的副作用而摄入过量垫料或其他非食物物品，称为异食癖（pica）。尽管非常少见，仍须监测大鼠是否出现异食癖及可能继发的肠梗阻。</li>
</ol>
8. 组织处理与冷冻切片
<ol>
	<li>用于配制苏木精 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E) 出生后脑组织染色：在出生后第2天（P2）将幼鼠从其原笼中取出。使用手术剪将幼鼠断头，并小心地从颅骨中取出脑组织。</li>
	<li>将脑组织放入含有7 ml 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）的15 ml锥形管中进行沉降固定。将脑组织置于4 °C，固定72小时。</li>
	<li>72 小时后，将脑组织转移至含有 30% 蔗糖（w/v）的无菌 PBS 溶液中，置于 4 °C 保存。 
	注意：脑组织一旦沉入蔗糖溶液，即可用于冰冻切片机切片。</li>
	<li>快速冷冻脑组织，并用冷冻切片机的研杵固定，以获取冷冻冠状切片。切割20 µm厚的冷冻冠状切片，并将其贴附于载玻片上。确保切片按顺序连续收集。</li>
	<li>载玻片室温下过夜干燥。将载玻片储存于 -20 °C。</li>
</ol>
9. 苏木精 &amp;#38; 伊红染色
<ol>
	<li>取载玻片固定的冷冻切片，室温下复温。 
	注意：所有溶液均需新鲜配制。</li>
	<li>将载玻片置于50 °C的载玻片加热台上，孵育2小时。</li>
	<li>将载玻片转移至染色架中。用双蒸去离子水（ddH₂O）浸洗载玻片10次。2O</li>
	<li>将切片置于100%苏木精中孵育5分钟。苏木精孵育时间可根据紫色染色程度进行优化。</li>
	<li>将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在洁净的自来水H中静置2O 1 分钟。</li>
	<li>将拭子在酸性酒精（250 ml 70% 乙醇 + 1 ml 浓盐酸）中浸洗 15 次。</li>
	<li>将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在干净的自来水中静置2O 1 分钟。</li>
	<li>在1%碳酸锂中孵育2分钟。</li>
	<li>将试纸条在自来水中浸入4次2O，并在干净的自来水中静置2O 持续 1 分钟。</li>
	<li>在95%乙醇中孵育1分钟。</li>
	<li>在100%伊红中浸染7次。伊红浸染次数可根据染色程度进行调整。&#160;粉红色染色。</li>
	<li>将浸片在95%乙醇中浸入5次。</li>
	<li>将浸片在新鲜更换的95%乙醇中浸入5次。</li>
	<li>将切片在100%乙醇中孵育1分钟。</li>
	<li>在新鲜的100%乙醇中孵育载玻片1分钟。</li>
	<li>将载玻片置于100%二甲苯中孵育15分钟。 
	注意：二甲苯步骤及盖片操作应在通风橱中进行。</li>
	<li>将切片在新鲜的二甲苯中孵育15分钟，期间更换数次。</li>
	<li>用Permount封片，并在通风橱中晾干。</li>
	<li>使用光学显微镜观察图像切片。 &#160;</li>
</ol>

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<li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Ureaplasma+parvum+lipoprotein+multiple+banded+antigen+on+pregnancy+outcome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice.</a> J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

早产儿脑病在动物模型中难以模拟，原因在于其病因的复杂相互作用、神经发育的时间进程、人类大脑网络形成的复杂性、损伤机制的重叠，以及早产儿中枢神经系统损伤所表现出的多种表型。早产儿脑病与特定细胞类型的易损性相关（即 未成熟少突胶质细胞21，以及多种发育调控通路（即 亚板、膜转运蛋白和受体亚基12,13,22然而，当动物模型尽可能地模拟人类疾病状态时，便可取得显著进展。本文中，我们建立了一种产前损伤模型，该模型整合了早产儿中观察到的中枢神经系统（CNS）损伤机制的异质性，从而可对灰质和白质的损伤及恢复进行后续评估。在人类中，上行性细菌感染会削弱羊膜，并诱发胎膜早破。此外，胎盘灌注缺陷会加剧胎盘界面的应激反应，并破坏胎盘稳态。因此，胎盘灌注不足会加重宫内感染所致的中枢神经系统损伤。不可否认，在啮齿类动物中模拟先于绒毛膜羊膜炎发生的上行性细菌感染这一常见临床情况具有挑战性，因其具有双子宫结构。每侧子宫角均有独立的宫颈，且可同时维持多胎妊娠。尽管存在这些挑战，临床前模型已逐步改进，以涵盖母体-胎盘-胎儿单元的多个组成部分并加以整合 在子宫内 不同程度的...

据估计，美国有超过12%的婴儿在妊娠37周前出生1，早产所致的围产期脑损伤（PBI）是导致永久性残疾的重要原因。早产所致的PBI，也称为早产儿脑病（EoP），会影响整个中枢神经系统（CNS）。CNS损伤常始于in utero，并因绒毛膜羊膜炎等产前过程以及缺氧和败血症等产后并发症而加重。由全身性损害引起的PBI会改变神经发育，导致脑性瘫痪、癫痫、认知发育迟缓以及多种影响情绪调节、记忆和执行功能的神经精神障碍1,2。尽管已有大量研究进展，但对于早产引起的CNS损伤在细胞和分子层面的后果如何转化为早产儿多种神经系统后遗症，目前仍了解有限。这一知识空白阻碍了对CNS损伤严重程度的实时诊断以及新兴干预措施的合理剂量制定。此外，针对这一脆弱患者群体的适龄治疗策略仍不明确。
宫内炎症在极早产中非常常见，涉及复杂的胎儿-母体-胎盘炎症级联反应3。宫内感染常为亚临床表现。胎盘中特定的急性炎症病理表现，即组织学绒毛膜羊膜炎，是胎儿炎症反应的主要决定因素，并与早产相关的脑损伤同时发生3-5。事实上，胎儿炎症反应对早产儿的远期预后具有明确的临床意义。出生时小于胎龄（SGA）或曾发生感染的婴儿，尤其容易出现神经功能缺陷3,4。绒毛膜羊膜炎是早产后的常见病理诊断6,7，组织学检查显示，约70%极早产儿的胎盘存在炎症征象4。此外，绒毛膜羊膜炎与2岁时的认知功能障碍相关8。极早产儿胎盘中母体血管灌注不足的证据，也与儿童期脑瘫相关9。绒毛膜羊膜炎与胎盘灌注缺陷的协同作用，在该人群2岁时异常神经发育结局的极高风险中得到了充分证实10,11。
为了模拟与病原体诱导的炎症相关的、人类系统性胎盘灌注缺陷及绒毛膜羊膜炎，我们建立了一种在大鼠中产前短暂全身性缺氧缺血（TSHI）联合羊膜腔内注射脂多糖（LPS）的动物模型。我们的目标是将此前单独使用TSHI模型的大鼠12-16加以改进，引入宫内炎症因素，以促进早产相关中枢神经系统（CNS）损伤的临床前建模。单独TSHI模型已显示出少突胶质细胞系细胞持续性丢失、皮层神经元减少、细胞死亡增加以及促炎性细胞因子水平升高，且随着缺血时间的进行性延长，损伤呈梯度性变化，符合产前脑损伤的特征16。对该模型缺血成分的进一步改良还表明，大鼠在衰老过程中出现记忆编码障碍、短期与长期记忆缺陷以及轻度肌肉骨骼改变17-19。事实上，我们此前已证实，TSHI联合LPS能够重现早产性脑病（EoP）的病理生理学关键特征，包括少突胶质细胞和神经元丢失、轴突损伤、细胞炎症以及功能异常20。

<table><tbody><tr><td>0.9% 生理盐水溶液</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>LPS 011B4</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>伊文思蓝染料</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>Biogel</td><td>40870</td><td></td></tr><tr><td>手术巾</td><td>Cardinal Health</td><td>287000-008</td><td>无菌</td></tr><tr><td>PDI 酒精消毒片</td><td>Fisherbrand</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco 可充电剃毛器</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Refresh Lacri Lube</td><td>00023-0312</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6808</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>F.S.T.</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td>25G 5/8</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>305128</td><td>30G 1</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-114</td><td>小型，6 英寸无菌</td></tr><tr><td>棉纱布海绵</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>INS600109</td><td>12.5 CM STR</td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Kent Scientific Corp.</td><td>INS600120</td><td>30G 压力</td></tr><tr><td>3-0 Perma Hand Silk 缝线</td><td>Ethicon</td><td>1684G</td><td>黑色编织，3-0（2 号），18&quot;，不可吸收，&amp;nbsp; PS-1 24 mm 针，3/8 圆弧</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>328438</td><td>0.3 cc 3 mm 31G</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸锂</td><td>Acros Chemicals</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Leica</td><td>3801521</td><td>Surgipath Gill II 苏木精</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>Surgipath 伊红</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisherbrand</td><td>X3S-4</td><td>组织学级</td></tr><tr><td>Permount 中性树胶</td><td>Fisherbrand</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-548-5P</td><td>Fisher Finest Premium 盖玻片</td></tr></tbody></table>

利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

早产儿脑病（EoP）是一个涵盖与早产相关的中枢神经系统（CNS）异常的术语. 为了更好地推进转化研究目标，并揭示与早产相关的脑损伤的新型治疗策略，早产（EoP）的临床前模型必须包含在人类中观察到的产前全身性损伤的相似机制，并涉及母体-胎盘-胎儿系统的多个组成部分。理想情况下，模型应在成年动物中产生类似范围的功能缺陷，并重现多种病理生理特征。为模拟人类系统性胎盘灌注障碍、胎盘低灌注以及与早产早期病原体诱导炎症相关的绒毛膜羊膜炎，我们建立了一种产前短暂性全身缺氧缺血（TSHI）联合羊膜腔内注射脂多糖（LPS）的动物模型。在妊娠Sprague Dawley大鼠中，于胚胎第18天（E18）通过子宫动脉阻断诱导TSHI，可导致胎盘低灌注程度与胎儿中枢神经系统（CNS）损伤严重程度呈梯度相关。当联合羊膜腔内注射LPS时，胎盘炎症加剧，CNS损伤加重，并伴随白质异常、步态障碍及影像学异常。产前TSHI及TSHI+LPS损伤模型满足EoP模型的多项标准，包括重现宫内损伤、导致神经元、少突胶质细胞和轴突丢失、亚板层丧失，以及在成年动物中出现与极早产儿相似的功能缺陷。此外，该模型可用于解析不同类型损伤所诱导的炎症反应机制。

产前短暂性全身缺氧缺血，羊膜腔内脂多糖注射，早产，胎盘低灌注，绒毛膜羊膜炎，中枢神经系统损伤，白质损伤，功能缺陷，动物模型

在E18进行TSHI+LPS处理后，苏木精-伊红染色显示胎盘（图1）和大脑（图2）均出现显著的组织病理学异常。在E19和E21检查的胎盘表现出明显的水肿，并伴有微出血，以及在整个蜕膜和迷路层出现坏死。同时观察到显著的炎性细胞浸润和血管增多。在P2检查的大脑显示脑室扩大，以及与假手术组相比，白质和皮层下板神经元的丢失。此前我们曾报道，TSHI+LPS可诱导炎症反应，并在年轻成年期导致持续性的白质和轴突异常，同时伴随显著的运动功能障碍20。TSHI+LPS还显著降低了P15时大脑皮层中氯化钾共转运体2（KCC2）蛋白的表达水平——该共转运体在γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性神经传递发育过程中起核心作用（图3，*P &lt;0.05）。这些数据表明，在神经环路成熟的关键出生后阶段，KCC2的发育性上调受到损害，该结果与我们先前关于TSHI单独处理对海马CA3区影响的报道一致13。
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早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内 短暂性全身缺氧-缺血及羊膜内脂多糖（LPS）给药模拟绒毛膜羊膜炎，以及感染性刺激与胎盘灌注不足对中枢神经系统发育的相关影响。

早产儿脑病（EoP）是一个涵盖与早产相关的中枢神经系统（CNS）异常的术语。为了更好地……

该手术方法的总体目标是通过在子宫内诱导短暂性全身缺氧、缺血以及羊膜腔内炎症，建立一种可重复的与极早产相关的脑损伤动物模型，以模拟大鼠的胎盘功能不全和绒毛膜羊膜炎。该方法有助于解答关于围产期脑损伤发病机制的关键问题，这些问题源于宫内过程，进而推动靶向治疗策略的开发。该技术的主要优势在于，它能够引发系统性损伤，模拟由感染以及缺氧、缺血共同导致的宫内损害，从而在成年大鼠中产生功能性神经功能缺损。该模型特别适用于解析与炎症相关的损伤机制。由于可单独或联合应用缺氧、缺血及感染性刺激来模拟损伤，本次演示将由本实验室的技术员 Lindsey Chan 进行。在开始操作前，使用小型动物专用剪刀去除胚胎期动物下腹部区域的所有毛发。将18只怀孕的大鼠以矩形模式排列，注意不要划伤乳头或引起剃须后皮疹。接下来，使用无菌棉签，用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭皮肤三次。待皮肤干燥后，通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度，并对动物进行铺巾。然后使用手术刀在动物腹部做一条三厘米长的正中切口，接着用剪刀将皮肤层与腹膜筋膜进行钝性分离。使用镊子和手术剪，提起腹膜筋膜层，并在无血管的腹白线处做切口。暴露腹膜腔后，将手术纱布置于切口外部，并用无菌生理盐水润湿纱布。然后使用钝头镊子并对外腹部施加轻压，轻柔地将子宫角从腹膜腔中取出，并将其放置在湿润的纱布上。注意避免缠绕或接触肠道，仅利用各个羊膜囊之间的肌层组织来调整胎儿的位置。然后使用钝性分离法暴露并分离出四条子宫动脉。在分离动脉时需注意避免损伤母体血管。在每条血管上放置一个30号大鼠动脉瘤夹。在放置夹子之前，必须确保周围组织已完全清除干净。放置夹子时，先用钝头镊子固定，然后将夹子平行放置。在放置完所有夹子后，观察脉搏是否停止至关重要，以确保完全缺氧缺血。确认近端和远端脉搏均已停止，以及子宫血管（包括各个胎盘内的血管）变暗。然后用纱布覆盖整个手术区域，并用无菌生理盐水冲洗组织。在60分钟后，每10分钟移除纱布并重新冲洗手术区域一次，持续一小时。当子宫角和血管充分湿润后，使用镊子轻轻取下每个动脉瘤夹，注意避免对血管造成损伤，并保持组织完整性。然后彻底冲洗子宫角和术区。最后再检查一次，注意清除羊膜囊上残留的任何纱布纤维。若需用LPS处理胎儿，可用钝头镊子固定并旋转每个羊膜囊，使每个羊膜囊的基部清晰可见。然后，取一支带有8毫米31号超细针头的0.3毫升胰岛素注射器，吸入LPS溶液，并将100微升溶液注射至每个胎盘板前方稍靠前的位置。拔出针头时，应直接对羊膜囊施加压力，以防止任何液体渗漏。在羊膜囊基部插入31号超细针头对于准确递送LPS溶液至关重要，同时可避免羊水外泄。用无菌生理盐水冲洗子宫角三次后，使用镊子将子宫角复位至腹膜腔内。然后使用连续的3-0丝线缝合肌筋膜层边缘，注意不要将缝线穿过或缝入任何囊状结构，随后使用另一根连续的3-0丝线缝合皮肤。接下来，使用26号针头进行皮下注射。在伤口边缘周围注射1毫升0.125%布比卡因。根据需要使用毛巾将大鼠擦干，并在颈背部注射0.1毫克/千克的丁丙诺啡。将动物置于清洁的饲养笼中，持续监测直至完全恢复。在胚胎第18天经历短暂的全身性缺氧缺血及脂多糖（LPS）给药后，如上所述，通过苏木精-伊红（H&E）染色可观察到胎盘和大脑均出现显著的组织病理学异常。实际上，在胚胎第19天和第21天检查的胎盘在蜕膜和迷路层中普遍存在微出血和坏死。此外，还观察到明显的炎性细胞浸润和血管增生。在出生后第2天进一步检查的大脑显示，与假手术组相比，出现脑室扩张以及白质和皮层下板神经元的丢失。短暂性全身缺氧、缺血和脂多糖（LPS）处理还显著降低了出生后第15天皮层中钾-氯共转运蛋白2（potassium chloride cotransporter 2）的表达水平。该氯离子共转运蛋白对出生后皮层GABA能抑制性神经环路的发育至关重要，其表达下调与出生后关键发育期神经环路成熟障碍中观察到的发育性上调受损一致。观看本视频后，您应充分掌握如何在妊娠大鼠中实施该手术，以及如何通过子宫动脉阻断诱导产前短暂性缺氧缺血，并通过羊膜腔内注射脂多糖（lipopolysaccharide）溶液诱导宫内炎症。一旦熟练掌握，该技术可在90分钟内完成。

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

早产儿脑病建模使用产前缺氧缺血大鼠羊膜腔内毒素

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型是研究人类新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的一种成熟模型。本文描述了新生大鼠幼崽中HIE模型的建立方法。...

新生儿缺血性缺氧性脑病的围产期缺血模型

我们建立了脑室周围白质软化症（PVL）的小鼠模型，PVL 是早产儿主要的脑损伤类型，其特征为脑室周围白质损伤。缺氧/缺血伴或不伴全身感染是 PVL 的主要原因。通过单侧颈总动脉结扎联合缺氧暴露，伴或不伴脂多糖注射，可在出生后第6天（P6）小鼠中诱导出类似 PVL...

脑室周围白质软化小鼠模型

本视频展示了在大鼠模型中使用脂多糖（LPS）诱导血脑屏障（BBB）破坏及脑微出血的过程。重点阐述了导致血脑屏障通透性增加及继发性脑组织损伤的免疫反应序列。...

利用脂多糖在大鼠模型中诱导脑微出血

来源：Jantzie, L. L.，等。利用产前缺氧缺血联合宫内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型。J. Vis. Exp.

在产前大鼠中诱导缺氧-缺血与炎症条件以建立脑病模型

围产期窒息后发生的缺氧缺血性脑病可通过动物模型进行研究。本文展示了建立新生仔猪缺氧缺血性脑病模型所需的操作步骤。...

新生仔猪缺氧缺血性脑病模型

通过在大鼠胚胎发育第17天时，将金属微型线圈缠绕于子宫动脉和卵巢动脉周围以造成动脉狭窄，从而诱导轻度子宫内低灌注。该操作可导致产前低灌注及宫内生长受限。...

一种采用微型线圈狭窄法建立的轻度宫内低灌注大鼠模型

该方法描述了在P17雪貂中建立炎症敏感的缺氧缺血性及高氧性脑损伤，以模拟多种晚期早产儿所经历的持续性炎症与氧化性脑损伤之间的复杂相互作用。...

一种炎症敏感化的晚产前缺氧缺血性脑损伤雪貂模型

我们介绍了一种使用新生大鼠幼崽建立的新生儿脑室内出血模型，该模型可模拟人类中观察到的病理特征。...

通过脑室内注射血红蛋白建立新生儿脑室出血模型

早产儿脑出血后脑积水（PHHP）可通过在新生大鼠中联合建立绒毛膜羊膜炎和脑室内出血模型来模拟。这种产前与产后事件的结合能够终生准确再现PHHP的临床特征，包括巨头畸形、脑室扩大和颅内压升高。...

建立早产儿脑出血后脑积水的大鼠模型

大脑中动脉线栓法阻塞是研究小鼠缺血性脑卒中的常用模型。...

小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

了解如何使用大鼠模型建立早产儿脑病模型，通过产前缺氧缺血和羊膜腔内毒素诱导模拟胎盘功能不全与绒毛膜羊膜炎。该方法有助于研究围产期脑损伤的发病机制并开发针对性治疗策略。

利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

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