利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

本手术操作的总体目标是通过在子宫内诱导短暂性全身缺氧、缺血以及羊膜腔内炎症，建立一种可重复的与极早产相关的脑损伤动物模型，以模拟大鼠的胎盘功能不全和绒毛膜羊膜炎。该方法有助于解答关于围产期脑损伤发病机制的关键科学问题，这些问题源于宫内病理过程，进而推动靶向治疗策略的开发。该技术的主要优势在于，它能够模拟由感染和缺氧、缺血共同引起的宫内系统性损伤，从而在成年大鼠中产生功能性神经功能缺损。

该模型特别适用于解析与炎症相关的损伤机制。由于缺氧、缺血和感染刺激可单独或联合进行测试，本次演示将由本实验室的技术员 Lindsey Chan 进行。开始实验前，使用小型动物剃毛器去除胚胎期动物下腹部区域的所有毛发。

将18只怀孕的大鼠以矩形模式排列，注意不要划伤乳头或引起剃毛后的皮肤刺激。接着，使用无菌棉签，用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭皮肤三次。待皮肤干燥后，通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度，并对动物进行铺巾。

然后使用手术刀在动物腹部做一条三厘米长的正中切口，接着用剪刀将皮肤层与腹膜筋膜进行钝性分离。使用镊子和手术剪，提起腹膜筋膜层，并在无血管的腹白线处剪开切口。

暴露腹膜腔后，将手术纱布置于切口外部，并用无菌生理盐水润湿纱布。然后使用钝头镊子并对外腹部施加轻压，轻柔地将子宫角从腹膜腔中取出，并将其放置在湿润的纱布上。注意避免子宫角与肠道发生缠绕或接触，仅利用各个羊膜囊之间的肌层组织来调整胎儿的位置。

然后使用钝性分离技术暴露并分离出四条子宫动脉。分离动脉时需注意避免损伤母体血管。在每条血管上放置一个30号大鼠动脉瘤夹。在放置夹子之前，必须确保周围组织已完全清除干净。

放置夹子时，先用钝头镊子固定，然后将它们平行放置。在放置完所有夹子后，观察脉搏是否停止至关重要，以确保完全缺氧缺血。确认近端和远端脉搏均已停止，以及子宫血管（包括各个胎盘内的血管）变暗。

然后用纱布覆盖整个手术区域，并用无菌生理盐水冲洗组织。在60分钟后的每10分钟内，持续一小时，取下纱布并再次冲洗手术区域。当子宫角和血管充分湿润后，使用镊子轻轻移除每个动脉瘤夹，注意避免对血管造成损伤，并保持组织的完整性。

然后彻底冲洗子宫角和术区。最后一次操作时，注意清除羊膜囊上残留的任何纱布纤维。为了对胎儿进行LPS处理，使用钝头镊子固定并旋转每个羊膜囊，使每个羊膜囊的基部清晰可见。

然后，取一支带有8毫米31号超细针头的0.3毫升胰岛素注射器，吸取LPS溶液，将100微升溶液注射至每个胎盘板前方稍靠前的位置。拔出针头时，直接对羊膜囊施加压力，以防止液体渗漏。在羊膜囊基底部插入31号超细针头对于准确递送LPS溶液至关重要，同时可避免羊水外漏。

用无菌生理盐水冲洗子宫角三次后，使用镊子将子宫角复位至腹膜腔内。然后使用连续的3-0丝线缝合肌筋膜层边缘，注意不要将缝线穿过或缝入任何囊状结构，随后用另一根连续的3.0丝线缝合皮肤。接下来，使用26号针头进行皮下注射。

在伤口边缘周围注射1毫升0.125%布比卡因。根据需要使用毛巾将大鼠擦干，并在颈背部注射0.1毫克/千克的丁丙诺啡。将动物置于清洁的饲养笼中，持续监测直至完全恢复。

在胚胎第18天经历短暂的全身性缺氧缺血及LPS给药后，如上所述，苏木精-伊红染色显示胎盘和大脑均出现显著的组织病理学异常。实际上，在胚胎第19天和第21天检查的胎盘在蜕膜和迷路层中普遍存在显微出血和坏死。同时还观察到明显的炎性细胞浸润和血管增生。

在出生后第2天进一步检查的大脑显示出脑室扩张，以及与假手术组相比，白质和皮层下板神经元的丢失。短暂性全身缺氧、缺血和脂多糖（LPS）处理还显著降低了出生后第15天皮层中氯化钾共转运蛋白2（potassium chloride cotransporter 2 protein）的表达水平。该氯离子共转运蛋白对出生后皮层GABA能抑制性神经环路发育至关重要，其表达下调与出生后关键发育期神经环路成熟障碍中观察到的发育性上调受损一致。观看本视频后，您应充分掌握如何在妊娠大鼠中实施该手术，以及如何通过子宫动脉阻断诱导产前短暂性缺氧缺血，并通过羊膜腔内注射脂多糖（lipopolysaccharide）溶液诱导宫内炎症。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在90分钟内完成。