Name: 监测内质网钙稳态使用 Gaussia荧光素酶SERCaMP (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解使用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态的方法。该技术通过病毒载体介导的转基因在肝脏组织中实现，可实时追踪ER钙失调，为疾病研究提供微创检测手段。

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本工作得到了国家药物滥用研究所院内研究计划的支持。我们感谢 Doug Howard、Chris Richie、Lowella Fortuno 和 Josh Hinkle 在本方法开发过程中所做出的贡献。

1. 体外&#160;实验：检测稳定转染的SH-SY5Y细胞系中SERCaMP的释放
<ol>
	<li>将SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL（SERCaMP）细胞接种于经组织培养处理的培养板中，密度为150,000&#160;每平方厘米细胞数2 表面积。例如，对于96孔板，每孔接种50,000个细胞（图1A在DMEM（高糖，GlutaMAX，丙酮酸钠）培养基中培养SH-SY5Y细胞，添加10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素。
	<ol>
		<li>传代细胞最多15次（图1B未测试更高代次的细胞。</li>
		<li>将细胞放回37 °C、5.5% CO₂的加湿培养箱中2 并孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验处理前，通过将5 µl培养上清液转移至不透光的96孔板中，为每个孔收集基线样本。收集前，轻轻敲击板的各个侧面并轻轻摇晃，以避免梯度效应。用自粘封板膜密封不透光板，并在4 °C下保存，直至进行酶学检测。 
	注意：分泌型GLuc-SERCaMP在细胞培养基中非常稳定。我们此前报道，在37 °C孵育72小时后，GLuc活性仅损失约5–10%（在SH-SY5Y细胞上孵育）。12.</li>
	<li>根据实验需求处理细胞，以检测内质网钙离子耗竭（例如 环境、药物、遗传操作）。避免长时间暴露于常温环境（即离开受控培养箱），因为大气中的CO₂会导致pH值迅速变化2向培养基中加入 HEPES 至终浓度为 20 mM，以稳定 pH14，如果需要长时间操作。使用含 HEPES 的培养基时应避免光照15.
	<ol>
		<li>阳性对照：在SH-SY5Y细胞实验中，使用100 nM毒胡萝卜素（thapsigargin, Tg）或50 µM环匹阿酸（cyclopiazonic acid, CPA）处理细胞4–6小时。其他细胞系达到最大反应可能需要更长的孵育时间或不同的化合物浓度。</li>
		<li>阴性对照：收集亲本SH-SY5Y细胞的培养基。根据我们的经验，该检测的背景发光值低于稳定表达SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP细胞基础分泌水平的0.05%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤1.2所述，在预定时间点收集并储存5 µl的条件培养基样品。</li>
	<li>按照第5节所述测定培养基中的酶活性。</li>
	<li>通过免疫印迹或发光检测分析细胞内GLuc。
	<ol>
		<li>用于免疫印迹：在含有50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.25% 脱氧胆酸钠、1 mM EDTA、1% NP40及蛋白酶抑制剂的改良RIPA缓冲液中裂解细胞。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至0.20 µm PVDF膜。将膜与GLuc抗体（1:2,000稀释）在4 °C孵育过夜。根据所选检测试剂的用户自定义方案进行二抗孵育及膜洗涤步骤。</li>
		<li>用于发光检测（图2）：在冰上进行以下步骤：
		<ol>
			<li>从组织培养板的各孔中移除所有培养基，并用 200 µl 冷的 PBS 洗涤。</li>
			<li>每孔加入75 µl裂解缓冲液，内含50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1% NP40及蛋白酶抑制剂。</li>
			<li>在4 °C下，将培养板置于摇床（120 rpm）上旋转孵育20分钟。</li>
			<li>使用多通道移液器轻轻吹打裂解液，避免产生气泡。取 5 µl 裂解液转移至不透光板中，按照第 5 节所述方法检测发光信号。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外&#160;实验：利用SERCaMP对永生化细胞进行瞬时转染
注意：我们观察到瞬时转染操作可能诱导细胞应激，从而减弱后续的 GLuc-SERCaMP 反应。以下方法的建立旨在尽量减少转染对 SH-SY5Y 细胞的影响。对于其他细胞系，可能需要对此方案（包括转染试剂的选择）进行优化。在条件允许的情况下，建议分别采用第 1 节和第 3 节中所述的稳定细胞系或病毒转导方法。
<ol>
	<li>将SH-SY5Y细胞以每100 mm培养皿4 × 106个细胞的密度接种。此培养皿中的细胞在转染后足以重新接种约300个孔（96孔板格式）。</li>
	<li>使用Xfect转染试剂进行细胞转染，每皿加入20 µg质粒DNA（编码GLuc-SERCaMP）和6 µl Xfect试剂。根据培养容器的大小按比例调整DNA和Xfect试剂的用量。</li>
	<li>将细胞放回培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>用胰酶消化细胞，并以每孔60,000个细胞的密度重新接种至96孔板。随后按照第1节中所述步骤进行操作。</li>
</ol>
3. 体外&#160;实验：病毒载体介导的 GLuc-SERCaMP 表达
注意：腺相关病毒（AAV）载体的包装16和纯化12以及慢病毒的制备13已有文献报道。
<ol>
	<li>使用以下引物和探针通过定量PCR测定GLuc-SERCaMP AAV的滴度：上游引物，5′-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3′；下游引物，5′-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3′；探针（5′-6-FAM/3′-BHQ-1标记），5′-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3′。
	<ol>
		<li>通过使用微量离心柱纯化含有 GLuc 的质粒并将其线性化，制备标准曲线例如 Machery-Nagel NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒）。通过琼脂糖凝胶电泳并使用质量标记物作为参照，对 DNA 进行定量。用 PBS 将 DNA 从 100 pg/ml 至 10 fg/ml 梯度稀释成 1:10 系列稀释液。根据质粒的分子量，计算各浓度下 GLuc 质粒 DNA 的拷贝数/ml。</li>
		<li>将AAV储存液用PBS稀释（适当的稀释倍数取决于病毒制备的参数，需通过实验确定）。</li>
		<li>在实时荧光定量PCR系统中进行PCR反应，反应条件如下：95 °C预变性5 min，随后进行41个循环的94 °C变性20 sec和60 °C退火延伸1 min。根据标准曲线计算每毫升样品中的拷贝数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用p24 Lenti-X快速滴度试剂盒对慢病毒进行滴度测定。将慢病毒分装样品置于冰上解冻，并用SH-SY5Y培养基稀释p24对照蛋白。
	<ol>
		<li>将慢病毒稀释至其浓度落在标准曲线范围内（例如 1:20,000 或 1:100,000）。所需稀释倍数取决于慢病毒制备参数，必须通过实验确定。后续所有步骤请遵循试剂生产商的说明书。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至96孔板中。对于SH-SY5Y细胞，可参照第1节所述的接种步骤进行。对于大鼠原代皮层神经元，应按照先前所述方法分离细胞，并接种于适当包被的培养板上。16将大鼠原代皮层神经元维持在添加了1× B27和500 µM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基中，每隔一天进行一次半量换液。&#160;</li>
	<li>用病毒转导细胞。病毒转导的目的是实现低水平表达，因为 Gaussia 荧光素酶提供强健的信号。
	<ol>
		<li>AAV 转导 SH-SY5Y 细胞：接种后次日进行转导。将 AAV 稀释至 6.0 x 107 vg/µl，溶于AAV稀释缓冲液（PBS + 0.5 mM MgCl₂）中2。加入5 µl稀释后的AAV（3.0 × 108 每孔96孔板约6,000个vg（病毒基因组）图3A).&#160;使用10%漂白剂灭活病毒载体废弃物。</li>
		<li>大鼠原代皮层神经元的AAV转导：接种后6-8天进行转导。将AAV稀释至4.0 × 106 vg/µl 的 AAV 稀释缓冲液中。加入 5 µl 稀释后的 AAV（2.0 × 107 每孔加入约350的MOI值病毒颗粒，置于96孔板中（图3B）。其他细胞类型的最适MOI值需通过实验确定。使用10%漂白液处理失活病毒载体废弃物。</li>
		<li>慢病毒转导SH-SY5Y细胞：接种后第二天进行转导。将慢病毒用Hank's平衡盐溶液稀释至p24浓度为20 pg/µl（通过滴度检测试剂盒测定）。向每孔含有100 µl培养液体积的96孔板中加入5 µl稀释后的病毒（含100 pg p24，相当于1,250,000个慢病毒颗粒，或约1,250个感染单位IFUs）。对于其他规格的培养容器，按比例调整用量。使用10%次氯酸钠溶液处理病毒废弃物以灭活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在转导后48小时（SH-SY5Y细胞）或5-7天（大鼠原代皮层神经元）收集处理前的培养基样本，并开始实验处理。</li>
</ol>
4. 在体 内 SERCaMP 检测
注意：在进行之前&#160;任何动物实验操作均须通过所在机构的审批并获得相应许可。所有可存活手术均须在无菌条件下进行，并给予充分的麻醉。下述所有操作步骤均已获得批准，并符合美国国立卫生研究院动物照护与使用委员会（NIH ACUC）的指导方针。
<ol>
	<li>高压灭菌手术器械&#160;手术开始前（121 °C，30 分钟灭菌，20 分钟干燥）。所有器械均需清洁&#160;在所有操作后立即使用超声波清洗器清洗，并在高压灭菌前完成。在生存手术期间维持无菌条件。对于需要多只动物的手术，擦拭手术器械&#160;用70%酒精、超声处理及珠子灭菌法在大鼠之间进行消毒。所需仪器请参见材料列表。</li>
	<li>准备大鼠以进行手术。本实验使用雄性Sprague-Dawley大鼠（180–200 g）。
	<ol>
		<li>使用异氟烷气体麻醉大鼠3分钟（以1,000 cc/min流速输送4-5%异氟烷），随后腹腔注射赛拉嗪（8 mg/kg）和氯胺酮（80 mg/kg）。涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。当大鼠深麻醉状态确立，表现为尾部或足部受夹捏时无回缩反射，即可开始手术。</li>
		<li>剃除肋骨下方区域（下胸部区域）至腹部中段区域的毛发。用70%酒精和碘伏溶液交替对术区进行三次擦洗。将大鼠置于无菌手术区域的仰卧位，并铺上无菌手术巾。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 AAV-GLuc-SERCaMP 稀释至 7.6 x 109 vg/ml（终浓度）。通过倒置试管充分混匀。 
	注意：病毒浓度范围可能有所不同（图4).
	<ol>
		<li>将105 µl稀释后的AAV用移液器加入无菌培养皿中。使用30号针头将病毒液吸入注射器内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行手术暴露肝脏，并注射 AAV-GLuc-SERCaMP。
	<ol>
		<li>在腹部切口前，将0.25%布比卡因应用于切口区域。&#160; 使用手术刀在肋骨下方约2-3厘米处做一水平切口。钝性分离以分开结缔组织与皮下组织。</li>
		<li>剪开腹肌，暴露肝脏右内侧叶。 
		注意：可根据最终应用额外注射其他脑叶。</li>
		<li>将动物置于手术显微镜下，调整位置以使肝脏右内侧叶位于视野中。向内侧叶实质内注射病毒，共3个不同位点，每个位点约33 µl。 
		注意：注射后将针头留在组织中5-10秒，以确保完全输送注射体积。</li>
		<li>分别缝合腹肌和皮肤，并使用棉签涂抹新孢霉素。将大鼠置于恢复室，直至其恢复意识并能维持直立姿势。在大鼠未完全恢复意识、无法维持胸腹位之前，不得无人看管。 &#160; 单独饲养，直至切口愈合且缝线已拆除（7-14天）。 &#160; 
		注意：根据美国国立卫生研究院（NIH）术后指南，需保存手术记录。&#160; 在笼卡上标注操作步骤、日期、实验编号、体重及手术日期。术后3天内需监测并记录动物的疼痛/不适、粪便排出、活动情况以及食物和水的消耗量。术后镇痛通过在饮水中添加对乙酰氨基酚（450 mg/100 cc）实现，尽管我们通常未观察到手术后出现明显的疼痛或不适症状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射后4-7天开始尾部采血。准备采血管，标记并预先称重。每管加入50 µl肝素（1,000 U/ml）。</li>
	<li>将大鼠放入异氟烷麻醉舱中3分钟（以1,000 cc/min流速输送4-5%异氟烷）。从麻醉舱中取出大鼠并置于鼻罩中（以500 cc/min流速输送2-3%异氟烷）。当大鼠深度麻醉，表现为尾部夹捏后无回缩反射时，即可开始采血。
	<ol>
		<li>使用无菌剪刀剪取尾尖（1-2 mm），并将血液逐滴滴入预装肝素的试管中。采集血液直至体积超过血液与肝素比例2:1以上（&#62;100 µl 血液/50 µl 肝素）。血液采集量可根据实验设计进行调整。使用蘸湿的棉签涂抹止血粉于尾部以止血。</li>
		<li>若需采集后续样本，将采血管置于 4 °C 保存。每次采集之间，用乙醇棉片擦拭剪刀，并进行珠灭菌。</li>
		<li>称重收集管，并加入肝素调节至2:1比例（血液:肝素）。此步骤可使每份样品中的肝素含量标准化表1).</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 2,000 x g 离心 5 分钟。将上清液（血浆）转移至新管中，并于 -80 °C 保存，直至进行荧光素酶检测（第 5 节）。 
		注意：样品在酶活性测定前于 4 °C 保存最多 72 小时，对发光信号的影响极小（图 5A）。血浆样本经历多达3次冻融循环对发光信号无影响（图5B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>毒胡萝卜素给药（阳性对照）：
	<ol>
		<li>用乙醇稀释毒胡萝卜素，配制成终浓度为 2.5 mg/ml 的溶液。以 1 mg/kg 剂量经腹腔注射至下腹部。 
		注意：毒胡萝卜素可增强凝血酶诱导的血小板凝固17 并且会使尾部采血更加困难。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高塞亚荧光素酶检测
	<ol>
		<li>将血浆样本在冰上解冻。 
		注意：对于纵向研究，所有时间点的样本应在同一天解冻并进行发光检测（使用单次配制的底物）。</li>
		<li>将10 µl血浆转移至不透光壁板中，按照第5节所述方法测定酶活性。每份血浆样本进行3-4次技术重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死 
	注意：SERCaMP 技术的优势在于能够对内质网钙离子进行纵向监测。根据实验参数和终点分析需求，应采用适合终点分析的方法处死动物，并遵循机构动物护理与使用委员会（ACUC）的指导原则。</li>
</ol>
5. 发光检测
<ol>
	<li>通过将化合物溶解于酸化甲醇（3 ml甲醇中加入30 µl 10 N HCl）中，配制腔肠素（coelenterazine, CTZ）储备液&#160;甲醇）至20 mM。分装成单次使用量，于-80 °C保存。</li>
	<li>在检测当天配制工作底物。
	<ol>
		<li>对于 体外 检测时，将腔肠素用 PBS 稀释至 8 µM， 例如 将10 µl的20 mM CTZ储备液加入25 ml中&#160;PBS 的图6A、B).</li>
		<li>对于 体内 将腔肠素用 PBS、500 mM 抗坏血酸、5 mM NaCl 稀释至 100 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将制备好的CTZ在室温下孵育至少30分钟，然后再开始检测。 
	注意：此步骤通常包含在Gaussia荧光素酶检测中，因为有文献报道在配制底物后的前30分钟内底物会迅速降解。但在我们的实验体系中未观察到该现象（图6C）；然而，我们通常会包含孵育步骤，因为我们发现该步骤对检测无任何负面影响。</li>
	<li>使用培养板&#160;能够监测生物发光并配备底物注射器的读板仪。用底物预冲洗管路。 
	注意：初始底物在使用过程中可能发生降解。为避免早期样本的读数偏低，建议在检测实验样本前先注入20-30个空孔（将空板加载到读板仪中）进行测量。</li>
	<li>向孔中加入100 µl底物，中速振荡5秒，然后测量发光信号。对于Biotek Synergy II酶标仪，积分时间为0.5秒体外 样品）和 5 秒（体内 样本）以进行读数步骤。优化酶标仪参数以获得最佳检测性能。 
	注意： Gaussia 荧光素酶表现出闪光型动力学特征，信号衰减迅速（与其他荧光素酶观察到的辉光型动力学相比）。GLuc 的闪光型动力学受细胞培养基中血清的影响。图7A)，强调了在不同样本间控制培养基成分的重要性。由于加入底物后发光信号迅速衰减（闪光动力学），加样与检测步骤之间的时间间隔必须在所有样本中保持一致。酶标仪应设置为向孔中注入底物，等待固定时间（例如 我们采用5秒的振荡步骤），然后读取该孔。若在读数前将底物加入整块板的所有孔中，除非能够同时向所有孔添加底物，否则会带来显著挑战。如果无自动加样器，可在加入底物后与测量前将板孵育10分钟，从而部分规避这一问题（避开衰减曲线的陡峭部分）图7B).</li>
	<li>对板上的每个孔重复注射、等待时间和读数步骤。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案强调了 体外 和 体内 GLuc-SERCaMP 在监测内质网钙耗竭方面的实用性。尽管生成 SERCaMP 的蛋白质修饰似乎可推广至其他报告蛋白12，我们选择 Gaussia 与其他荧光素酶相比，该荧光素酶具有更强的生物发光信号（强200-1,000倍）18. 我们在原代大鼠皮层神经元、SH-SY5Y细胞和大鼠肝脏中，使用100倍剂量范围的GLuc-SERCaMP病毒处理后，均检测到毒胡萝卜素诱导的GLuc-SERCaMP释放图3和图4）。我们先前描述了表达GLuc-ASARTDL的稳定转染细胞系的构建，并证明在5 × 10⁵个细胞群体中仅需20个细胞即可检测到信号4 未标记的细胞可报告由毒胡萝卜素诱导的反应12在此，我们显示该稳定细胞系在传代至最多15代（已分析的最高代数）时仍能持续报告Tg诱导的反应，表明随着时间推移，报告分子的持续表达并不影响其在内质网钙耗竭时被释放的能力。图1我们的数据表明，GLuc-SERCaMP ...

内质网（ER）具有多种细胞功能，包括蛋白质折叠、蛋白质分泌、脂质稳态以及细胞内信号传导1。维持内质网正常功能的核心是保持其腔内钙离子浓度约为细胞质中钙离子浓度的5,000倍2-4。这一高耗能过程由肌浆/内质网钙离子ATP酶（SERCA）调控，该酶是一种将钙离子泵入内质网的转运蛋白。钙离子从内质网外流主要通过兰尼碱受体（RyR）和三磷酸肌醇受体（IP3R）介导。由于许多内质网功能依赖于钙离子，钙库的紊乱可导致内质网应激，并最终引发细胞死亡。
内质网钙离子稳态失调已在心肌病、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病中被观察到5。由于这些疾病具有渐进性特点，阐明发病机制与内质网钙库改变之间的因果关系一直具有挑战性。多种技术已推动了我们对内质网钙动态变化的理解，包括钙离子染料和基因编码的钙指示蛋白（GECIs）。低亲和力钙染料在结合Ca2+后荧光增强，可被加载到细胞中用于检测钙离子浓度较高的亚细胞区域6。GECIs（如D1ER和CatchER）可实现对钙波动的监测，并更精确地控制其在亚细胞结构中的定位7-9。最近，另一类被称为细胞器靶向钙指示蛋白（calcium-measuring organelle-entrapped protein indicators, CEPIA）的GECIs已被报道10。第三种方法结合了遗传学与小分子化学技术，即靶向酯酶染料加载法（targeted-esterase dye loading, TED），该方法利用靶向内质网的基因编码羧酸酯酶与基于酯键的钙染料相结合来实现染料的特异性定位11。
尽管上述方法具有各自固有的优势和局限性，但它们能够通过荧光的急性测量为内质网钙动态提供有价值的见解。然而，这些方法并不适用于研究疾病进展通常所需的长期纵向研究。为了建立一种可长期监测钙动态的方法，我们鉴定并开发了一种蛋白质修饰，以创建分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMPs）12。
SERCaMP 通过提供一种微创方法以反复检测内质网钙库，克服了其他方法存在的多项局限。我们此前已证实，C端肽段ASARTDL（丙氨酸-丝氨酸-丙氨酸-精氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-亮氨酸）足以促进蛋白质在内质网中的滞留；然而，在导致内质网钙水平降低的条件下，该肽段序列不再能够维持蛋白质在内质网的定位，蛋白质因而被分泌至胞外13SERCaMP 技术的基础是将 ASARTDL 附加到分泌蛋白的羧基末端例如 Gaussia 荧光素酶（luciferase，或 GLuc），使其在内质网钙耗竭时被分泌，从而构建出一种强大的内质网钙失调报告系统12通过转基因方法表达GLuc-SERCaMP，可利用细胞培养上清和血浆等生物液体检测GLuc活性变化，从而反映内质网钙稳态的改变。该方法适用于对内质网钙库进行性变化的长期纵向研究 体外 和 体内以下方案是使用基于GLuc的SERCaMP研究内质网钙稳态的通用操作流程，但也可作为其他报告基因型SERCaMP的实验参考指南。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40 溶液&amp;nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>用于细胞内 GLuc 检测</td></tr><tr><td>1 ml 鲁尔锁注射器</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 微升滤芯吸头</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 外科缝线</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>粘性微孔板密封膜</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>麻醉自动流量系统</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>动物恢复舱</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>碘伏溶液</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>牛生长血清</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>腔肠素，天然型</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>切割针 3/8 圆弧缝线</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>数字超声清洗机</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖，含 GlutaMAX 和丙酮酸</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNA 分子量标准</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶（重组蛋白）</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶抗体（用于 WB、ICC 或 IHC）</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2,000（WB）</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>GLuc 检测板（96 孔，不透明）</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop 止血粉</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R 离心机</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>新孢林（Neosporin）</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>尼康体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X 快速滴度试剂盒</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR 膜密封片</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh 活性炭过滤罐</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，#10</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD 大鼠 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Rats</td><td>订购体重为 150-200 g 的大鼠&amp;nbsp;，到货后 5 天进行手术</td></tr><tr><td>小型动物耳标</td><td>National Band and Tag Co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术单</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 酶标仪</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 通用 PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素（Thapsigargin）</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>对人体健康有害</td></tr><tr><td>Virapower 慢病毒包装混合物</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect 转染试剂</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine）</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

利用gaussia荧光素酶sercamp监测内质网钙稳态

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

内质网（ER）含有细胞内最高浓度的钙离子，其浓度约为细胞质水平的5000倍。严格调控内质网中的钙离子水平对于蛋白质折叠、修饰和转运至关重要。内质网钙稳态的紊乱可导致未折叠蛋白反应（unfolded protein response）的激活，这是一种三通路的内质网应激反应机制，并可能参与多种疾病的发病过程。原则上，在疾病发生和发展过程中监测内质网钙离子变化具有重要意义，但在实际操作中仍具挑战性。目前用于监测内质网钙离子的方法，如钙依赖性荧光染料和荧光蛋白，已在细胞水平上揭示了内质网钙离子动态变化的机制，然而这些工具并不适用于活体（in vivo）研究。本实验室已证实，对Gaussia荧光素酶羧基末端进行修饰后，可使其在内质网钙离子耗竭时被分泌出来。本文描述了利用基于荧光素酶的分泌型内质网钙离子监测蛋白（SERCaMP）进行体外（in vitro）和活体（in vivo）研究的方法。本视频重点展示了肝脏注射、GLuc-SERCaMP的药理学调控、血液采集与处理，以及用于长期监测内质网钙离子的检测参数。

GLuc-SERCaMP 方法可通过采集细胞外液来评估内质网钙离子稳态。在实验设计中可包含多个对照以增强结果的解读。首先，使用一种组成型分泌的报告分子（例如 无C末端ASARTDL标签的GLuc（即“GLuc-No Tag”）可用于评估实验处理对分泌途径（全细胞分泌）及外源基因表达的影响。例如，若GLuc-SERCaMP和GLuc-No Tag的胞外水平均升高，则结果被视为不明确。相反，若GLuc-SERCaMP的分泌增加，而GLuc-No Tag无相应变化，则支持该事件依赖于内质网钙离子。图8）。可通过检测细胞内GLuc来进一步评估内质网钙耗竭所引发的GLuc-SERCaMP分泌情况，但该方法仅适用于单个时间点，因检测需进行细胞裂解。随着GLuc-SERCaMP持续分泌，细胞内GLuc-SERCaMP水平将随内质网钙耗竭而下降，而细胞外与细胞内比值（针对每个孔单独计算）则会上升（图2B细胞外：细胞内比例可用于校正转基因表达水平的变化。
药理学调节剂可用于调控内质网钙库，以验证在新范式中内质网钙对...

内质网钙稳态在多种病理状态下受到破坏。一种分泌型内质网钙监测蛋白（SERCaMP）报告系统可用于检测内质网钙库的异常变化。本方案描述了使用该报告系统的具体方法。 高塞氏菌 利用荧光素酶SERCaMP检测内质网钙离子稳态 体外 和 体内.

利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

内质网（ER）含有细胞内最高浓度的钙离子，其浓度约为细胞质钙离子浓度的5,000倍……

以下实验的总体目标是利用一种分泌型报告蛋白，随时间监测内质网钙离子稳态失调的情况。该方法通过病毒载体介导的转基因技术靶向特定组织（本实验中为肝脏）实现。在此示例中，使用Gai荧光素酶生物钟报告基因，随后采集血液等生物液体，以测定从组织中释放的报告蛋白量；然后向血浆样本中加入荧光素酶底物，并通过检测发光信号来判断内质网钙离子的耗竭程度。结果显示内质网钙离子稳态失调，表现为血浆中C型环磷酸腺苷（cAMP）水平升高。通过反复采集少量生物液体样本，可对内质网钙离子稳态进行长期监测。与现有的低亲和力钙离子染料或基因编码钙离子指示剂等方法相比，该技术的主要优势在于可通过微创手段实现活体内长时间的内质网钙离子稳态监测。该技术具有两条潜在的治疗途径。第一种方法是筛选能够维持或恢复内质网钙稳态至正常生理状态的药物。第二种方法是改造治疗性蛋白，使其成为在内质网钙耗竭时可响应性分泌的治疗性AMPs。尽管该方法可为肝脏内质网钙失调提供研究线索。该方法也可应用于其他器官系统，如脑、心脏、肌肉或胰腺。根据文本方案，对一条Sprague-Dawley大鼠实施麻醉后，涂抹眼用软膏，并进行尾部夹捏以确认麻醉效果；然后剃除自肋骨下方至腹部中段区域的毛发，并使用碘伏和70%乙醇交替擦拭手术区域三次。随后将大鼠置于无菌手术区域上，呈仰卧位，覆盖无菌手术单，并将AAV病毒载体稀释至用户优化的浓度。在此情况下，我们使用了每毫升 7.6 × 10⁹ 个病毒基因组，通过翻转试管进行混合。然后用移液器吸取 105 µL 稀释后的 AAV，加入无菌培养皿中，并使用 30 号针头将病毒吸入注射器。用手术刀标记目标切口位置，以暴露肝脏进行注射。在肋骨下方做一个长约2至3厘米的横向切口。钝性分离以分开结缔组织与皮下组织。切开腹肌，暴露肝脏右内侧叶。接下来，将动物置于手术显微镜下，并调整位置以使肝脏右内侧叶位于视野中。然后使用注射器，将病毒总注射体积的三分之一分三个位点注入右内侧叶的实质组织中，每次注射后将针头在组织内停留5至10秒，以确保完全递送注射液量。缝合腹肌和切口，并使用棉签涂抹新孢霉素（Neosporin）。将大鼠置于恢复室中，直至其恢复意识并能够维持直立姿势，再将其放回单独饲养的笼具中。注射后四到七天。通过标记并预先称重来准备采血管。然后向每根试管中加入50微升浓度为每毫升1000单位的肝素。按照文本方案对大鼠进行麻醉后，实施尾部夹捏以确认麻醉效果，并使用无菌剪刀。从尾尖末端处剪去约一到两毫米。将超过100微升的血液逐滴收集至预装肝素的试管中，以防止出血。使用湿润的棉签将 STIC 粉末涂抹于尾部。使用乙醇垫擦拭剪刀，并在每次采集之间进行珠灭菌。将血液样本管储存于 4°C 环境中。若需采集后续样本，需称量采集管的重量，并调整肝素用量，使血液与肝素的比例达到2:1。此步骤可使每份样本中的肝素含量标准化。将采

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

监测内质网钙稳态使用<em&gt; Gaussia</em&gt;荧光素酶SERCaMP

本方案描述了一种通过荧光成像实时测量线粒体钙流的方法。该方法利用一种基于环状重排黄色荧光蛋白（YFP）的双激发比率型钙离子探针（ratiometric...

利用基因编码钙传感器监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。...

活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

来源：Bannai, H., et. al., 利用膜靶向Ca2+指示剂解析培养细胞中的局部Ca2+信号。 J. Vis. Exp.

星形胶质细胞区室特异性动态的自发钙成像

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术通过荧光成像支持对细胞内钙库动态的分析。该方法基于将重组的羧酸酯酶靶向至内质网（ER），在内质网腔内增强合成的低亲和力Ca2+指示染料的局部去屏蔽效果。...

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

我们介绍了靶向基因编码钙离子指示剂（GECI）CatchER 的应用方案+ 用于通过实时荧光显微镜监测 HEK293 细胞和骨骼肌 C2C12 细胞内质网/肌浆网（ER/SR）中快速钙瞬变的方案。一种用于 原位 Kd...

使用靶向 Ca2+ 传感器 CatchER+ 监测内质网/肌浆网钙释放

本方案概述了一种用于分析由半翅目昆虫（如蚜虫）取食所引发的植物钙信号的简单方法。 拟南芥 用GFP钙生物传感器GCaMP3转染，可实现实时 体内...

实时 在体 内 记录 拟南芥 利用荧光生物传感器检测昆虫取食过程中的钙信号

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

本方案描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析策略。...

利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

我们建立了一种分裂荧光素酶重组检测方法，用于在活细胞中监测内质网与线粒体之间的接触。利用该方法，我们描述了一种在化学处理条件下，对HEK293T细胞中这些细胞器间偶联水平进行定量测量的实验方案。...

利用分裂荧光素酶重组检测法测量活细胞中内质网-线粒体接触

了解使用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态的方法。该技术通过病毒载体介导的转基因在肝脏组织中实现，可实时追踪ER钙失调，为疾病研究提供微创检测手段。

利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

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