利用Gaussia荧光素酶SERCaMP监测内质网钙稳态

以下实验的总体目标是利用一种分泌型报告蛋白，随时间监测内质网钙离子稳态失调的情况。该方法通过病毒载体介导的转基因技术靶向特定组织（本实验中为肝脏）实现。在此示例中，使用Gai荧光素酶生物钟报告基因，随后采集血液等生物液体，以测定从组织中释放的报告蛋白量；然后向血浆样本中加入荧光素酶底物，并通过检测发光信号来判断内质网钙离子的耗竭程度。

结果显示内质网钙离子稳态失调，表现为血浆中C型环磷酸腺苷（cAMP）水平升高。通过反复采集少量生物液体样本，可对内质网钙离子稳态进行长期监测。与现有的低亲和力钙离子染料或基因编码钙离子指示剂等方法相比，该技术的主要优势在于可通过微创手段实现活体内长时间的内质网钙离子稳态监测。该技术具有两条潜在的治疗途径。

第一种方法是筛选能够维持或恢复内质网钙稳态至正常生理状态的药物。第二种方法是改造治疗性蛋白，使其成为在内质网钙耗竭时可响应性分泌的治疗性AMPs。尽管该方法可为肝脏内质网钙失调提供研究线索。

该方法也可应用于其他器官系统，如脑、心脏、肌肉或胰腺。根据文本方案，对一条Sprague-Dawley大鼠实施麻醉后，涂抹眼用软膏，并进行尾部夹捏以确认麻醉效果；然后剃除自肋骨下方至腹部中段区域的毛发，并使用碘伏和70%乙醇交替擦拭手术区域三次。随后将大鼠置于无菌手术区域上，呈仰卧位，覆盖无菌手术单，并将AAV病毒载体稀释至用户优化的浓度。

在此情况下，我们使用了每毫升 7.6 × 10⁹ 个病毒基因组，通过翻转试管进行混合。然后用移液器吸取 105 µL 稀释后的 AAV，加入无菌培养皿中，并使用 30 号针头将病毒吸入注射器。用手术刀标记目标切口位置，以暴露肝脏进行注射。

在肋骨下方做一个长约2至3厘米的横向切口。钝性分离以分开结缔组织与皮下组织。切开腹肌，暴露肝脏右内侧叶。

接下来，将动物置于手术显微镜下，并调整位置以使肝脏右内侧叶位于视野中。然后使用注射器，将病毒总注射体积的三分之一分三个位点注入右内侧叶的实质组织中，每次注射后将针头在组织内停留5至10秒，以确保完全递送注射液量。缝合腹肌和切口，并使用棉签涂抹新孢霉素（Neosporin）。将大鼠置于恢复室中，直至其恢复意识并能够维持直立姿势，再将其放回单独饲养的笼具中。

注射后四到七天。通过标记并预先称重来准备采血管。然后向每根试管中加入50微升浓度为每毫升1000单位的肝素。

按照文本方案对大鼠进行麻醉后，实施尾部夹捏以确认麻醉效果，并使用无菌剪刀。从尾尖末端处剪去约一到两毫米。将超过100微升的血液逐滴收集至预装肝素的试管中，以防止出血。

使用湿润的棉签将 STIC 粉末涂抹于尾部。使用乙醇垫擦拭剪刀，并在每次采集之间进行珠灭菌。将血液样本管储存于 4°C 环境中。

若需采集后续样本，需称量采集管的重量，并调整肝素用量，使血液与肝素的比例达到2:1。此步骤可使每份样本中的肝素含量标准化。将采集管在2000 × g、4°C条件下离心5分钟。

将血浆上清液转移至新的离心管中，可在4摄氏度保存最多72小时，或在负80摄氏度长期保存，用于后续的荧光素酶检测，并以thaa garin作为阳性对照。用乙醇稀释至终浓度为2.5毫克/毫升。然后以每千克1毫克的剂量，于下腹部腹腔注射。

按照上述方法，在注射后24小时采集第一份血液样本。为检测发光信号，根据说明书配制塞伦嗪工作底物，并在室温下避光孵育30分钟。

同时，将所有样品置于冰上解冻，并使用能够监测生物发光且配备底物注射器的酶标仪，将10 µL血浆转移至不透光的微孔板中。用底物预冲洗管路。向一个孔中注入100 µL底物。

以中等速度振荡五秒，并对体外样品测量发光量。对于读取步骤，体外样品积分时间为0.5秒，体内样品积分时间为五秒，以评估内质网钙稳态。采用Gluc SAR Camp方法时，可包含多个对照，例如本例中使用的组成型分泌型报告基因Gluc Noag。

在实验条件下，若GLUC SAR camp和Gluc noag的细胞外水平均升高，则被视为不确定结果。然而，若仅观察到gluc SAR camp分泌增加而无gluc noag反应，则支持该过程依赖于内质网钙离子释放事件。可利用针对内质网钙库的药理学调节剂，以确认内质网钙离子在新实验范式中对SAR camp释放的贡献作用。

例如，如本实验所示，丹曲洛林（dantrolene）是一种 INE 受体拮抗剂，可稳定内质网钙离子水平，从而抑制在硫代精氨酸刺激下 SAR 环磷酸腺苷（camp）的释放。在使用基于葡萄糖的 SAR camp 进行体外研究时，最好通过时间过程来评估处理所诱导的反应。通过追踪同一微孔板内相对于对照组的相对反应变化，不建议直接比较多个微孔板之间的原始数值，因为底物的降解可能导致原始值发生变化。在体内研究中，应针对每只动物独立评估数据，并以每只动物自身处理前的状态作为对照。

这是为了消除个体动物之间转基因递送和表达的差异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用SIRCAM技术研究肝病啮齿类动物模型中内质网的钙离子调节。请注意，操作病毒载体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取适当个人防护装备等安全预防措施。