Name: 巩膜交联兔模型使用核黄素和紫外辐射的轴性近视防治 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学习使用核黄素和紫外辐射对新西兰兔进行巩膜交联以防治轴性近视的方法。该技术通过靶向巩膜区域照射，为近视治疗研究提供重要的实验模型和临床前数据。

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作者感谢 Dalia Sela 女士和 Emi Sharon 先生在实验室中所做的专业且出色的技术工作。

动物处理遵循ARVO关于在研究中使用动物的决议。研究方案经机构实验动物研究委员会批准（批准号：022-4598-2；021211）。
1. 手术准备 #1
<ol>
	<li>称重并麻醉一只13日龄的新西兰白兔，通过肌肉注射盐酸氯胺酮100 mg/ml（100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪25 mg/ml（12.5 mg/kg）。由于手术过程较长，采用上述剂量。通过检测疼痛反射是否消失来确认麻醉深度是否合适。</li>
	<li>使用无菌棉签，将少量眼用软膏涂抹于非手术眼，以防止角膜干燥。在手术过程中，向手术眼的角膜滴加0.9%生理盐水，以防止角膜干燥。</li>
	<li>在局部麻醉（盐酸奥布卡因0.4%）后，使用超声A型扫描仪对每只眼进行三次眼轴长度测量，并取平均值。将探头垂直置于角膜中央进行测量。</li>
</ol>
2. 手术步骤 #1 - 交联前步骤
<ol>
	<li>在眼科手术显微镜下，使用眼科手术镊和剪刀，用眼科手术镊和剪刀进行360°结膜环形切开。</li>
	<li>使用斜面镊或眼肌钩识别四条眼外直肌，并用2-0编织丝线（无针）缝线将其隔离。 
	注：丝线有助于将眼球向所需方向移动。眼球被四条直肌分为四个象限（四个象限）。
	<ol>
		<li>用皮肤标记笔在每个象限内标记两个区域，分别位于赤道部巩膜和后部巩膜。这些即为照射区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备一支含有0.1%无右旋糖酐的核黄素-5-磷酸的3 ml至5 ml注射器。将注射器连接至26 G泪道插管或25 G锥形水分离器。</li>
	<li>准备照射装置，该装置包括一个连接至斜面朝下的定制光纤的UVA（370 nm）光源。在测量能量功率并完成校准后（见下文注释），将装置设定为57 mW/cm²。 
	注：校准由制造商商业完成。该方法提供的总UVA光剂量为57 J/cm²。（57 mW/cm2作用于0.2 cm2面积上为11.4 mW/0.2 cm2，以11.4 mW/0.2 cm2照射200秒，每个0.2 cm2照射点的累积剂量为2.2 J）</li>
</ol>
3. 手术步骤 #1 —— 交联
<ol>
	<li>通过向所选治疗象限的相反方向牵拉丝线缝线来移动眼球例如，&#160;向上并向鼻侧牵拉以处理下颞象限。使用2-0编织丝线无针缝线分离每一条直肌，并进行眼球运动。</li>
	<li>在照射开始前20秒，将含有0.1%无右旋糖酐的核黄素-5-磷酸的光敏剂溶液涂抹于照射区域。</li>
	<li>使用定制的斜面朝下的光纤，对辐照区域进行200秒的辐照。每个区域的面积为0.2 cm²，半径为4 mm。</li>
	<li>在200秒的照射期间，每20秒将含有0.1%无右旋糖酐的核黄素-5-磷酸的光敏剂溶液涂抹于照射区域。 
	注意：由两名外科医生同时进行照射和滴加核黄素操作。</li>
	<li>对四个眼球象限中的每一个重复步骤 3.1–3.4。</li>
</ol>
4. 手术步骤 #1 —— 交联后步骤
<ol>
	<li>剃除眼部周围的毛发。&#160;使用眼科手术剪修剪睑缘，然后用4-0编织丝线象牙色—3/8圆反向切割—13 mm长度C-3针头轻轻缝合上下眼睑（睑缘缝合术）。手术结束时在睑缘涂抹少量眼膏（氯霉素5%）。</li>
</ol>
5. 手术 #1 - 术后护理
<ol>
	<li>恢复期间将动物置于加热灯下。在动物恢复到能够维持胸卧位之前，不得无人看管。</li>
	<li>将动物放入带有新垫料的清洁笼具中，直至其完全恢复。恢复后，将动物送回动物房。&#160;只有当动物清醒后，方可将其归还给母兔。&#160;</li>
	<li>在最初48小时内，观察动物的一般状况以及是否有疾病或感染迹象。按照第1节所述给予镇痛处理。&#160;若观察到兔子行为异常，应视需要给予镇痛（安乃近滴剂，50 mg/kg，每6小时一次）。</li>
</ol>
6. 手术步骤 #2
<ol>
	<li>首次手术后第55天，通过肌肉注射盐酸氯胺酮（100 mg/ml，100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（25 mg/ml，12.5 mg/kg）对兔子进行称重并实施麻醉。</li>
	<li>在眼科手术显微镜下使用眼科手术剪拆除睑缘缝合。对每只眼睛在表面麻醉（盐酸奥布卡因0.4%）后，使用超声A型扫描仪进行三次眼轴长度测量，并取平均值。将探头垂直置于角膜中央。</li>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/1.5 kg体重）处死兔子。</li>
</ol>

<ol><li>McBrien, N. A., Gentle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+sclera+in+the+development+and+pathological+complications+of+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the sclera in the development and pathological complications of myopia.</a> Prog. Retin. Eye Res. 22, 307-338 (2003).</li>
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<li>Wollensak, G., Spörl, E., Seiler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+%2F+ultraviolet-A-induced+collagen+crosslinking+for+the+treatment+of+keratoconus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Riboflavin / ultraviolet-A-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus.</a> Am. J. Ophthalmol. 135, 620-627 (2003).</li>
<li>Wollensak, G., Spörl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagencrosslinking+of+human+and+porcine+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cataract+Refract.+Surg%22%5BJournal%5D)">Collagencrosslinking of human and porcine sclera.</a> J. Cataract Refract. Surg. 30, 689-695 (2004).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们首次报道了在兔模型中使用核黄素联合UVA照射的交联技术预防轴性近视的体内研究。尽管此类研究可采用多种实验动物，但我们主要基于眼球大小以及需在巩膜表面实施交联操作的需求而选择兔子。
我们发现暴露兔巩膜以及缝合上下眼睑是具有挑战性的操作步骤。我们建议修剪睑缘，并使用本方案中提到的缝线，以确保眼睑在规定时间内牢固闭合，无需进行修正。
需要考虑的一个重要问题是，必须对辐照装置和光纤进行校准，以达到所需的功率能量。
H&amp;#38;E 组织学切片显示，接受交联手术的眼睛视网膜未出现毒性改变。应进一步研究核黄素和UVA照射对视网膜、脉络膜和巩膜的潜在毒性，重点关注照射位置、能量剂量和暴露时间。
本研究存在若干局限性，需加以考虑。仅测量了术前和术后的眼轴长度。眼球的轴长通过A型超声波测量。我们未评估巩膜的生物测量特性、屈光分析或生物力学特性。
综上所...

近视是最常见的屈光性眼病。在美国和欧洲，近视的患病率约为30%，而在亚洲国家，这一比例可高达一般人群的60%1,2。高达50%的近视患者会出现近视进展，通常每两年进展约-0.5屈光度3。近视带来的医疗负担相当沉重，包括配镜、隐形眼镜和屈光手术的费用，以及与青光眼、白内障、视网膜脱离和视力损伤等健康风险增加相关的医疗成本4-6。
在动物近视研究中，通过眼睑缝合7-10、在眼睛和角膜附近放置遮蔽物以及角膜纹身11来诱导视力下降。然而，在这些研究中要产生人工近视，必须在非常年幼的动物上进行遮蔽处理，因为在成年动物标本上开展的任何形觉剥夺实验均未成功。
高度近视的一个重要特征是巩膜发生病理性改变，表现为巩膜进行性变薄，这可能是由于视觉剥夺后正视化反馈机制紊乱12，或由于巩膜的某些代谢异常（如埃勒斯-当洛斯综合征）所致13。最终，这两种机制均会导致巩膜、视网膜和脉络膜的拉伸与变薄，其结构基础是近视性巩膜的异常，例如胶原纤维直径减小14,15以及原纤维形成障碍16。
多项研究表明，胶原交联受损是近视巩膜弱化过程中的一个重要因素17-18. Wollensak 等.19-21 通过应用光敏剂核黄素和紫外线A（UVA，370 nm）照射诱导胶原交联，观察到猪和人巩膜刚度显著增加157% 体外19 兔巩膜刚性增加465% 体内 （杨氏模量）20. 交联对兔巩膜也具有长期效应 体内：3天后刚度增加320.4%，4个月后增加277.6%，8个月后增加502%（杨氏模量）22.
已有文献报道了多种试图抑制近视进展的治疗方法23-26 ，但这些方法的效果仍存在争议。迄今为止，尚未发现有效预防进行性近视的方法。
近视的病因仍存在争议，其治疗也面临挑战。基于这些发现，人们提出假设：巩膜交联可作为基于巩膜治疗近视进展的一种手段。本研究的目的是探讨巩膜胶原交联对视觉轴遮盖诱导的轴性近视发展的影响。

<table><tbody><tr><td>2-0 编织丝线无针缝线&amp;nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>W193</td><td></td></tr><tr><td>4-0 象牙色编织丝线&amp;nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>W816</td><td></td></tr><tr><td>不含右旋糖酐的 0.1% 核黄素-5-磷酸钠 1 mg:1 ml</td><td>Concept for Pharmacy Ltd</td><td>D2-5025</td><td></td></tr><tr><td>UV A (370 nm) 光源&amp;nbsp;</td><td>O/E LAND Inc</td><td>NCSU033B</td><td></td></tr><tr><td>定制斜面朝下的光纤&amp;nbsp;</td><td>Prizmatix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G 泪道插管&amp;nbsp;</td><td>Beaver-visitec International Ltd.&amp;nbsp;</td><td>REF581276</td><td></td></tr><tr><td>25 G 锥形水分离器 [Blumenthal]&amp;nbsp;</td><td>Beaver-visitec International Ltd.&amp;nbsp;</td><td>REF585107</td><td></td></tr><tr><td>13 日龄家兔</td><td>Harlan&amp;nbsp;</td><td>1NZWR40</td><td></td></tr><tr><td>超声生物测量仪</td><td>Allergan-Humphrey</td><td>820-519</td><td></td></tr><tr><td>皮肤标记笔</td><td>Devon</td><td>4237101664X</td><td></td></tr></tbody></table>

使用核黄素和紫外线a辐射进行巩膜交联以预防兔模型中的轴性近视

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

近视个体，尤其是高度近视者，发生白内障、青光眼、视网膜脱离以及脉络膜视网膜异常的风险高于正常人群。此外，病理性近视是导致视力损害和失明的常见不可逆原因1-3。本研究展示了在兔模型中使用核黄素联合UVA辐射进行巩膜交联对轴性近视发展的干预效果。实验采用A型超声测量13日龄新西兰白兔（雄性和雌性）的眼轴长度。随后对眼球行360°结膜环形切开术并实施巩膜交联，之后进行睑缘缝合术。通过缝合13日龄新西兰白兔的右眼眼睑（睑缘缝合术）诱导眼轴延长。将眼球分为四个象限，每个象限设有两个巩膜照射区域，每个区域面积为0.2 cm²，半径为4 mm。在UVA照射前20秒开始滴加0.1%无右旋糖酐核黄素-5-磷酸溶液至照射区域，并在200秒照射期间每20秒重复滴加一次。UVA辐射（370 nm）以57 mW/cm²的强度垂直照射巩膜（总UVA光剂量为57 J/cm²）。于第55天拆除睑缘缝合，随后重复测量眼轴长度。本研究表明，在兔模型中，采用核黄素联合UVA辐射进行巩膜交联可有效预防遮盖诱导的眼轴延长。

图1和图2以图形方式展示了两组动物的眼轴长度测量结果。第1组兔子的右眼接受了巩膜交联和睑缘缝合术，而左眼未进行手术（图1）。第2组兔子的右眼仅接受了结膜切开术和睑缘缝合术，而左眼未进行手术（图2）。
在第1组中，接受巩膜交联和睑缘缝合术的动物，其右眼在眼睑缝合前的平均眼轴长度为10.68 ± 0.74 mm，55天后为14.29 ± 0.3 mm，平均差值为3.61 ± 0.76 mm。未手术/未缝合的左眼相应数值分别为10.70 ± 0.79 mm和15.14 ± 0.32 mm，平均差值为4.44 ± 0.81 mm（图1）。在遮蔽阶段结束时，对缝合眼与未缝合眼的眼轴长度进行比较，结果显示缝合眼的净增长量较小。
<p class="jove_content" fo:keep...

我们展示了核黄素联合UVA对轴向伸长的兔眼进行巩膜交联的效果。通过缝合13日龄新西兰兔（雄性和雌性）的右眼眼睑（睑缘缝合术），诱导其产生轴向伸长。

使用核黄素和紫外线A辐射进行巩膜交联以预防兔模型中的轴性近视

近视个体，尤其是高度近视者，发生白内障、青光眼、视网膜脱离和脉络膜视网膜病变的风险高于正常人群。

本实验的总体目标是观察在兔模型中使用核黄素和UVA辐射进行巩膜交联以诱导轴性近视的效果。该方法有助于解答巩膜交联领域中的关键问题，例如如何将UVA辐射精准导向特定的巩膜区域。该技术的主要优势在于，它结合了UVA辐射、光纤技术和外科手术，能够到达目标巩膜区域。协助手术的将是拉宾医学中心眼科部门的住院医师 Orly Gal-Or。在开始手术前，需确认患者对疼痛反射无反应，并使用无菌棉签将少量眼膏涂抹于非手术眼。随后，对每只眼睛施用局部麻醉剂。将探头垂直置于角膜中央，使用A型超声波扫描仪对眼睛进行三次眼轴长度测量。接下来，在眼科手术显微镜下，使用眼科手术镊子和剪刀行360度结膜环形切开。使用肌钩定位四条眼外直肌。然后，使用两根零号编织丝线无针缝线将肌肉分离，形成四个象限。用皮肤标记笔在每个象限的赤道部巩膜和后部巩膜各标记一个照射区域。接着，用一支3至5毫升的注射器抽取0.1%无右旋糖酐的核黄素5磷酸光敏溶液，并连接26号泪道插管。现在，开启一个带有370纳米UVA光源的照射装置，该光源连接至特制的斜面光纤，将装置设定为57毫瓦每平方厘米。在开始照射前20秒，通过牵拉将要处理象限对侧的丝线缝线来移动眼球，并将光敏剂溶液涂抹于照射区域。随后，使用特制的光纤对选定区域照射200秒，每隔20秒向该区域补充一次光敏剂溶液。四个象限均照射完毕后，用剪刀修剪眼睑边缘。然后，使用四针零号象牙色编织丝线，轻轻缝合上下眼睑。在眼睑边缘涂抹少量眼科软膏，并将兔子置于加热灯下。当动物完全恢复后，将其放入一个带有新垫料的清洁笼子中。在交联处理后的第55天，使用外科眼科剪拆除睑缘缝合。然后，如前所述，对每只眼睛进行三次眼轴长度测量。在进行巩膜交联和睑缘缝合的动物中，与未手术眼相比，眼睑缝合后平均眼轴长度减小。然而，在仅进行结膜切开和睑缘缝合的动物中，实验眼的平均眼轴长度增加。事实上，与仅进行结膜切开的眼相比，接受巩膜交联的眼整体眼轴长度增加较少。尽管未接受手术的眼睛眼轴长度的组间差异无统计学意义。在实施该操作时，重要的是要提前准备好所有必要的设备。该技术建立后，为近视研究领域的科研人员开辟了道路，使其能够探索核黄素和UVA辐射对视网膜、脉络膜和巩膜的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何对特定巩膜感兴趣区域进行可视化，并实施聚焦的UVA辐射治疗。请务必注意，在具有精细眼外直肌的微小眼球上进行手术极具挑战性，应充分认识到掌握该技术需要经历一定的学习曲线。该技术的应用意义在于预防病理性近视的相关并发症。尽管该方法可为预防轴性近视提供见解，但也适用于其他情况，如巩膜变薄区域。

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