Name: 与FRET流式细胞仪灵敏地检测Proteopathic播种活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学习使用FRET流式细胞仪检测蛋白质病播种活性，该方法可高灵敏度识别低水平蛋白聚集体，适用于神经退行性疾病研究及治疗干预评估，具有高通量和易操作的优势。

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本工作由Tau协会（M.I.D.）资助；美国国立卫生研究院基金1R01NS071835（M.I.D.）、美国国防部基金PT110816（授予M.I.D.）、1F32NS087805（授予J.L.F.）以及1F31NS079039（授予B.B.H.）。

注意：本方案重点介绍使用FRET流式细胞术检测小鼠生物样本中的种子活性。该方法同样适用于重组纤维和人类生物样本。小鼠安乐死及脑组织采集均按照经IACUC批准的程序进行。
1. 脑组织提取
<ol>
	<li>使用异氟烷（2%）深度麻醉小鼠后，用含0.03%肝素的冰冻PBS灌注小鼠，并按照Gage et al.18中描述的细节取出脑组织。</li>
	<li>将取出的组织置于冻存管中，通过液氮速冻。或者，也可在干冰上冷冻组织。一旦组织完全冻结，可转移至-80 °C长期保存（如需要）。 
	注意：本方案适用于全脑匀浆或显微解剖的脑区。有关详细的显微解剖方案，请参见Hagihara et al.19。</li>
</ol>
2. 生物种子材料的制备
<ol>
	<li>通过将蛋白酶抑制剂（无EDTA）溶解于1×TBS中（每10 ml加入1片）来配制匀浆缓冲液。剧烈涡旋混匀，并置于冰上保存。必须使用无EDTA的蛋白酶抑制剂，以维持生物传感器细胞的活力。</li>
	<li>在一次性称量舟中称取冷冻脑组织，转移至5 ml锥形管中。加入预冷的匀浆缓冲液，使终浓度为10%（质量/体积）。暂时置于冰上保存。组织质量及后续所用匀浆缓冲液体积将根据脑组织大小和/或使用区域的不同而有所变化。此处，0.2 g重的成年小鼠半脑组织悬浮于2 ml缓冲液中，形成10% w/v的溶液。</li>
	<li>将样品转移至冷室中，并调节探头式超声破碎仪至适当参数。使用Omni Ruptor超声仪（如图所示）时，将功率设为20%，相当于约75 W。采用脉冲模式进行超声处理，以防止样品在破碎过程中过热。将脉冲时间设为30%，相当于约500毫秒。</li>
	<li>用清水、异丙醇和再次用清水冲洗探头尖端，并在每次更换溶液之间用实验室擦拭纸擦干探头。务必使用擦拭纸彻底清洁探头的侧面和底部。</li>
	<li>每次处理一个样品，将探头浸入匀浆缓冲液中，启动超声仪。按照上述设定的功率和脉冲参数，共进行25次脉冲处理。确保组织完全悬浮。此步骤中需注意避免产生泡沫。 
	注意：若出现以下情况，样品易产生泡沫：a）总体积过小，或 b）匀浆液温度升高。使用本仪器时，超声体积不应低于250 µl。为确保样品保持低温，此步骤中可将离心管置于冰上。</li>
	<li>用擦拭纸清除探头上残留的裂解物后，将探头在盛有洁净水的烧杯中进行10次空载脉冲。随后依次用水、异丙醇和水再次冲洗探头的侧面和底部（同步骤2.4），每次冲洗后均用擦拭纸擦干。为避免交叉污染，样品间必须彻底清洗探头。 
	注意：对于tau蛋白聚集体，我们未发现需要更严格的清洗方法来防止样品间污染。然而，其他类型的淀粉样蛋白可能需要额外的清洗措施，相关方法已在文献中广泛描述20,21。</li>
	<li>将匀浆液置于冰上保存，直至所有样品处理完毕。</li>
	<li>在4 °C条件下，以21,300 × g离心15分钟。</li>
	<li>小心将上清液转移至洁净离心管中，避免扰动沉淀。弃去沉淀。将上清液分装后，于-80 °C保存以备后续使用。应避免匀浆液反复冻融，因其会降低种子效应效率。</li>
</ol>
3. 生物传感器细胞的重铺板
注意：本实验需使用四种细胞系：HEK 293T（细胞系 #1）、RD-P301S-CFP（细胞系 #2）、RD-P301S-YFP（细胞系 #3）和 RD-P301S-CFP/YFP（细胞系 #4）。各细胞系在实验中的作用请参见表 1。
<ol>
	<li>在无菌环境中吸除培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞后吸除。加入 3 ml 胰蛋白酶-EDTA（0.05%）消化细胞 3 分钟，加入 9 ml 预热的完全培养基（DMEM，10% FBS，1% 青霉素-链霉素，1% GlutaMax）终止消化，立即将细胞转移至锥形管中。</li>
	<li>在室温下以 1,000 x g 离心细胞 5 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于预温的培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定每种细胞系的细胞密度。细胞密度会因收获时的汇合度以及重悬体积的不同而有所差异。将从直径10 cm培养皿中收获的、处于90%汇合度的细胞重悬于10 ml培养基中，此时细胞密度约为1×10⁶ 个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞与培养基混合制成总混合液，使96孔板的每孔含有35,000个细胞，培养基体积为130 µl（例如。，为配制100孔的主混合液，将350万个细胞重悬于13 ml培养基中。根据具体的实验设计和时间安排调整细胞数量。在铺板后约18小时进行细胞处理时，每孔加入35,000个细胞至96孔板中。</li>
	<li>使用多通道移液器，将130 µl主混合细胞悬液缓慢移入平底、经组织培养处理的96孔板的每个孔中。接种时，将移液器吸头置于孔中央，避免接触孔底。 
	注意：尽管可以调整铺板格式，但建议每块板中细胞系1-3各设4个孔（n = 4）。板上其余孔（n = 84）保留用于细胞系#4（生物传感器细胞）。</li>
	<li>静置培养板10分钟，使细胞自然沉降&#160;在室温下孵育。于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。2，且相对湿度≥80%。</li>
</ol>
4. 处理细胞
注意：次日，当tau生物传感器细胞融合度达到60-65%时，按如下方法制备种子转导复合物：
<ol>
	<li>在一个离心管中，将转染试剂（如Lipofectamine）与低血清培养基（如Opti-MEM）混合，配制总混液。每孔加入1.25 µl转染试剂和8.75 µl低血清培养基。轻轻振荡离心管以混匀，短暂离心，室温孵育5分钟。</li>
	<li>在另一支离心管中，将种子材料（第2.9步裂解液的等分试样）与减血清培养基混合。 
	注意：接种材料的体积应根据具体实验而定。选择接种体积时，需考虑以下因素：样品中种子的丰度及其潜在毒性。粗制匀浆物可能对细胞具有毒性，因此应使用能观察到目标效应的最低体积。既往实验中每孔裂解物体积为1–5 µl，相当于总蛋白量5–20 µg。确保每孔总体积（接种物 + 低血清培养基）为10 µl。</li>
	<li>将4.1和4.2中所述两个试管的内容合并，轻轻振荡混匀，短暂离心（1,000 × g，5秒），室温孵育至少20分钟，最长不超过2小时。</li>
	<li>轻轻将20 µl转导复合物沿每个生物传感器孔的孔壁加入。若可能，设置三个技术重复。将处理后的细胞放回培养箱中孵育24–48小时。孵育条件与步骤3.6中所述相同。 
	注意：本实验设置的适当阴性对照条件为用空脂质体处理的生物传感器细胞（即，脂质体试剂 + 低血清培养基），因为磷脂的施加相对于未暴露于脂质体试剂的生物传感器细胞会引起荧光谱图的轻微偏移。</li>
</ol>
5. 用于FRET流式细胞术的细胞收获
注意：在收获细胞之前——通常为处理后24-48小时——可使用标准倒置荧光显微镜的GFP滤光片对铺板活性进行初步观察。未加入种子材料处理的细胞（即，空白脂质体）将显示弥散性荧光，而经种子材料处理的细胞则会显示强烈的点状和网状胞内包涵体（图1A-B).
<ol>
	<li>使用多通道移液器吸取所有细胞培养基（150 µl）。加入 50 µl 胰蛋白酶消化液，消化 5 分钟，然后加入 150 µl 冰冷的培养基终止消化。此步骤中无需在胰蛋白酶消化前用 PBS 清洗，以免导致细胞脱落和后续细胞损失。在流式细胞术分析中，通过设门策略排除污染的死细胞和碎片。</li>
	<li>终止消化后立即转移细胞至 96 孔圆底板，于室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除并弃去上清液，注意避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用 50 µl 2% 多聚甲醛轻柔但充分地重悬细胞沉淀，孵育 10 分钟。也可选择不固定而直接使用活细胞检测，但固定处理可获得更清晰且更一致的结果。</li>
	<li>于室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。小心吸除并弃去多聚甲醛溶液，注意避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用 200 µl 冰冷的流式细胞术缓冲液（HBSS，1% FBS，1 mM EDTA）轻柔但充分地重悬细胞沉淀，并尽快上机检测，以避免细胞聚集。</li>
</ol>
6. FRET 流式细胞术
注意：使用配备适用于 FRET 的激光线和滤光片组的流式细胞仪，例如 MACSQuant VYB（表2）。在本节的每一步中，使用软件的 96 孔板模板点击目标孔，然后点击“播放”以开始样品进样和流式检测。通过点击“新建分析窗口”图标来创建图谱或统计表格。通过点击 X 轴或 Y 轴标题并选择相应的滤光片，更改双变量图中坐标轴的参数。如需调整细胞群或荧光信号，可增加或降低相应滤光片对应的电压。使用该仪器时，运行速度应保持在每秒 &#60;1,000 个事件，以确保准确的单细胞监测。
<ol>
	<li>制作一个侧向散射面积（SSC-A）与前向散射面积（FSC-A）的双变量图，运行细胞系#1，调节SSC和FSC电压，使细胞群位于左下象限。点击多边形工具，圈定细胞群（门P1）。所有设门参数参见图2。</li>
	<li>制作一个FSC-H（高度）与FSC-A的双变量图，通过点击图上方的“live”并选择P1，将门P1应用于该图。运行细胞系#1，点击多边形工具，圈定单细胞群体（门P2）。</li>
	<li>制作3个直方图，分别对应感兴趣的三种滤光片：CFP、YFP和FRET。通过点击各图上方的“live”并选择P2，将门P2应用于所有这些图。运行细胞系#1，调节电压，使CFP、YFP和FRET直方图中细胞群体的中位值均位于0至1之间。测量CFP和FRET时，使用405 nm激光激发细胞，并分别用450/50 nm和525/50 nm滤光片采集荧光信号；测量YFP时，使用488 nm激光激发细胞，并用525/50 nm滤光片采集荧光信号。激光与滤光片设置详见表2。</li>
	<li>对CFP在FRET和YFP通道中的荧光溢出进行补偿。 
	注：补偿是指校正荧光溢出的过程。当一种荧光染料的发射光被检测到设计用于检测另一种荧光染料信号的滤光片通道中时，即发生荧光溢出。通过适当的补偿，可从FRET和YFP通道中去除CFP的溢出荧光信号。 
	注：补偿需要同时存在荧光阳性和阴性细胞。因此，在对CFP阳性细胞（细胞系#2）进行补偿时，必须在上机前将阴性细胞（细胞系#1）加入样本中。
	<ol>
		<li>在进行补偿前，立即将单孔中的30 µl细胞系#1悬液加入200 µl细胞系#2悬液中。</li>
		<li>点击“仪器设置”图标，然后选择“补偿”选项卡，勾选“矩阵”以打开补偿矩阵表。</li>
		<li>制作FRET-A vs CFP-A双变量图，并如步骤6.3所述应用门P2。运行细胞系#1和#2混合样本，点击“象限”图标，绘制象限，使荧光阴性和阳性细胞群分别位于下方两个象限（门LL3和LR3）。</li>
		<li>创建一个统计表，显示LL3和LR3门中FRET的中位荧光强度（MFI）。调节补偿矩阵中的FRET参数，直至LL3和LR3的FRET MFI相等。完成此步骤后，未染色细胞与CFP阳性细胞的FRET信号MFI相同，表明CFP在FRET通道中无荧光溢出。</li>
		<li>制作YFP-A vs CFP-A双变量图，并如步骤6.3所述应用门P2。绘制象限（LL4和LR4），方法与步骤6.4.3类似。</li>
		<li>创建一个统计表，显示LL4和LR4门中YFP的MFI。调节补偿矩阵中的YFP参数，直至LL4和LR4的YFP MFI相等。完成此步骤后，未染色细胞与CFP阳性细胞的YFP信号MFI相同，表明CFP在YFP通道中无荧光溢出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成设门和补偿后，选中目标孔位，运行剩余的孔板样本。</li>
	<li>所有样本运行完毕后，点击“文件”，然后选择“复制”，进入“数据文件”选项卡，选中实验文件夹，点击“复制”以导出数据文件。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：通过点击 X 轴或 Y 轴上的标题并选择相应的筛选条件，可更改单个双变量图的坐标轴参数。
<ol>
	<li>在流式细胞仪分析程序中打开 FCS 文件。</li>
	<li>根据散射特性，使用多边形门控在经空脂质体处理的细胞中定义细胞群体（SSC vs FSC）和单细胞群体（FSC-H vs FSC-A），方法与第 6 节所述类似。</li>
	<li>如果在设置过程中已对 CFP 进行了补偿，则不再进一步调整 CFP。</li>
	<li>创建 FRET vs YFP 双变量图。使用细胞系 #3，通过绘制沿 FRET 阳性细胞群斜率分布的多边形门控来定义假 FRET 门控。该门控排除在 FRET 滤光片中发出信号的 YFP 单阳性细胞，绘制方式类似于 Banning et al.22 之前展示的方法。</li>
	<li>通过将经空脂质体处理的 CFP/YFP 细胞绘制在 FRET vs CFP 双变量图上定义 FRET 门控。沿群体向上并向左延伸的方向绘制一个多边形门控，该门控应排除大多数细胞（约 99%），使得背景 FRET 细胞比例 ≥1%。任何进入该门控的事件均被视为 FRET 阳性。 
	注意：上述每个单独门控在构建后续门控前均需应用于所有样本。分析完成后共定义四个独立门控（细胞群体；单细胞；假 FRET；FRET）。</li>
	<li>记录感兴趣的分析参数，包括：FRET 阳性百分比及 FRET 阳性细胞的 MFI。通过测量阳性百分比与 MFI 的乘积，手动计算整合 FRET 密度。 
	注意：若将整合 FRET 密度作为结果指标，则需将背景 FRET（如步骤 7.5 所定义）和 MFI 设定为大于或等于 1，以避免计算出的乘积小于其两个独立因子。</li>
</ol>

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</ol>

该检测方法已授权给强生制药公司。

此处描述的FRET流式细胞术系统是一种用于快速、定量评估tau蛋白种子活性的强大工具。该方法仅需基本的细胞培养经验以及对FRET和流式细胞术的熟练掌握。其他种子活性检测方法，例如硫黄素T（Thioflavin T）——其在结合β片层结构时荧光增强——操作繁琐，且需要纯化的重组蛋白底物。此外， 体外 用于tau蛋白的接种检测仅具有半定量性，且通常对亚纳摩尔浓度水平的接种物质不敏感23,24然而，FRET 流式细胞术能够对重组或生物样本中的种子活性提供定量且极为敏感的检测。此外，对该方法进行适当改进后，还可用于研究多种蛋白质聚集类疾病。
尽管本文所述方案主要针对tau蛋白的种子效应，但只需进行简单修改，用户即可利用该方法监测其他类型蛋白病理性种子的成种活性。如Holmes和Furman所示 等，构建稳定表达携带疾病相关A53T突变的α-突触核蛋白的单克隆细胞系，并将其与CFP或YFP荧光蛋白融合标记，从而实现了对全长α-突触核蛋白重组纤维种子活性的高灵敏度检测16类似的实验已使用亨廷顿蛋白生物传感器细胞进行...

细胞内 tau 淀粉样蛋白的积聚是阿尔茨海默病等 tau 蛋白病的特征。在疾病早期，病变通常局限于大脑的特定区域；但随着疾病进展，病变会沿着特定的神经网络不可避免地扩散1-5。越来越多的证据表明，毒性蛋白聚集体的跨细胞传播是这一病理过程的基础（详见综述6-10）。在此模型中，致病性蛋白种子（e.g.，tau）从供体细胞释放并进入邻近细胞，通过模板化的构象改变使正常 tau 蛋白转变为错误折叠的形式11-15。本文所述的检测方法旨在高灵敏度地检测此类种子活性，适用于重组蛋白和生物样本，并可定量检测极微量的致病性种子活性16。
稳定表达包含与疾病相关的 P301S 突变的 Tau 重复结构域（RD）并分别与 CFP 或 YFP 融合的 HEK 293T 细胞（下文简称为 tau-RD-CFP/YFP 细胞），可作为检测种子活性的稳定生物传感器。在无蛋白病变种子存在时，细胞中的 Tau 以可溶性单体形式存在，无明显的背景 FRET 信号。然而，当细胞通过自发摄取或脂质体介导的转导方式摄入 Tau 种子后，会导致 RD-CFP 与 RD-YFP 发生聚集，从而产生可通过流式细胞术在单细胞水平检测的 FRET 信号。
该检测的多个组分经过优化设计，以提高灵敏度并降低变异性。选用具有1:1 RD-CFP/YFP表达比例的单克隆细胞系，因其可提供最佳的信号-噪声比。为增强灵敏度，采用磷脂将种子直接导入细胞内（尽管在研究摄取的生物学机制时，此步骤可省略）。最后，流式细胞术可在群体水平和单细胞水平上监测FRET，这是其他蛋白质聚集检测方法所不具备的优势。最终的检测指标——整合FRET密度，具有高度定量性，既考虑了发生聚集的细胞数量，也反映了每个细胞内聚集的程度。所有这些优化参数共同提升了检测的灵敏度，并确保了实验结果的可重复性。
该系统最近被用于一项针对转基因P301S tau蛋白病小鼠的综合性研究17 评估了tau蛋白种子活性在时间上的起始与进展，相对于其他常用tau病理学标志物的情况例如，MC1，AT8，PG5 和硫黄素S）。到目前为止，种子活性是所评估的tau蛋白病变最早且最可靠的标志物，比组织学检测至少提前6周出现。种子活性在1.5个月时即已出现，并随年龄增长而逐步增强，提示蛋白病变性种子在神经退行性变的起始和/或进展中具有因果作用。16.
精确量化生物样本中微量的种子物质水平，有助于监测疾病早期进展的研究。通过缩短试验周期并允许使用更年轻的动物，该方法可提高临床前动物试验的效率和准确性。例如，在前述的P301S小鼠模型中，候选化合物可在4至6周龄时给药（即在种子活性出现之前或刚出现时），并在给药后2至4周内监测其疗效。该检测方法应能准确量化种子活性的任何降低。FRET流式细胞术具有 体外 筛选应用同样适用。例如，抗tau试剂（例如抗体，小分子 等等。）可利用重组tau聚集体或脑源性裂解物作为种子来源，在培养体系中快速检测其阻断种子诱导的能力（图5采用该方案，一旦制备好种子材料，实验仅需三天即可完成，包括数据分析。这种对蛋白质病理性种子活性的快速定量方法，有助于推动多项神经退行性疾病的研究所

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（无EDTA）</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor 超声波均质器</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>超声波均质器微头</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>降噪耳罩</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>USA Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 试剂储液槽</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner 摆动桶转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB 流式细胞仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 样品架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo 分析软件</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 移液器吸头</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 血清移液管</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

利用fret流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

越来越多的证据表明，毒性蛋白聚集体（即蛋白病变种子）的跨细胞传播是多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病及相关tau蛋白病）病理发生与进展的机制。Tau种子在疾病进展中可能发挥的关键作用，强烈提示需要一种灵敏的检测方法，以快速检测生物样本中的种子活性。
通过结合荧光共振能量转移（FRET）的特异性、流式细胞术的高灵敏度以及单克隆细胞系的稳定性，研究人员开发出一种超灵敏的接种检测方法，可用于检测来自重组样本或生物样本（包括人和小鼠脑匀浆）中的蛋白种子。该检测方法采用稳定表达聚集倾向性tau蛋白重复结构域（RD）的单克隆HEK 293T细胞，该结构域携带与疾病相关的P301S突变，并与CFP或YFP融合表达，当蛋白发生聚集时可产生FRET信号。致病性tau蛋白种子（而非其他蛋白）被生物传感器细胞摄取后，会诱导RD-CFP与RD-YFP发生聚集，而流式细胞术可高灵敏度、定量地监测这种聚集引发的FRET信号。该方法可检测飞摩尔浓度（以单体当量计）的重组tau蛋白种子，动态范围跨越三个数量级，并适用于tau蛋白病变转基因小鼠及人类tau蛋白病变患者的脑匀浆样本。经过轻微修改后，该方法还可用于检测其他致病性蛋白种子（如α-突触核蛋白）的接种活性，并兼容原代神经元培养体系。FRET流式细胞术因其操作简便、灵敏度高且应用广泛，适用于研究多种蛋白质聚集相关疾病。

FRET 流式细胞术能够对重组或生物样品中的种子活性进行灵敏、定量且快速的检测。该检测方法操作简便：将表达 tau-RD-CFP/YFP 的单克隆来源稳定细胞系用种子材料转导后，孵育 24–48 小时，随后进行流式细胞术分析（图 1A）。在无种子存在时，生物传感器细胞中的 tau 蛋白保持可溶性单体状态（图 1B）；而在种子存在的情况下，生物传感器细胞则会将 tau 蛋白转化为聚集状态（图 1C），从而产生可在单细胞水平上通过流式细胞术检测到的 FRET 信号。定量评估结果显示，生物传感器细胞可响应飞摩尔浓度的种子材料，且种子活性可在三个数量级范围内被有效测定（图 1D）。
设定门控参数以确保能够检测到真实的FRET信号，即使在种子浓度较低的情况下也是如此。首先，使用标准门控方法分离出细胞群体（图2A）和单细胞（图2B）。由于405 nm激光可直接激活YFP，从而产生假FRET信号...

蛋白质聚集体（即蛋白毒性种子）在细胞间的转移可能介导了神经退行性疾病病理过程的进展。本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测方法，可实现对重组或生物样品中种子活性的特异且灵敏的检测。

利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

越来越多的证据支持毒性蛋白聚集体（即蛋白病种子）通过跨细胞传播，作为疾病起始和...

本实验的总体目标是从重组或生物来源中检测促淀粉样蛋白种子活性，从而实现对蛋白质、聚集体及样品中种子活性的高灵敏度检测。该方法有助于解答神经退行性疾病领域中的一些关键问题。例如，在疾病动物模型中，我们如何定量评估治疗干预后种子活性的变化？该技术的优点包括对低水平蛋白质聚集体具有高特异性。其卓越的特异性、操作简便性以及高通量特性。今天将由我本人以及共同作者 Brandon Holmes 一起演示该实验流程。准备生物种子材料时，首先用一次性称量舟称取冷冻脑组织。然后将组织转移至一个锥形管中，加入预冷的匀浆缓冲液，使最终溶液浓度为10%（w/v），并将样品置于冰上，转移至冷室中。接着，将探头调节至适当设置，并用缓冲液冲洗探头的侧面和底部。按照指示将探针在溶液中浸入三次，每次之间擦拭探针。当探针准备就绪后，将探针尖端浸入一个样本的匀浆缓冲液中，开始超声处理，共施加25次脉冲。当组织完全悬浮后，离心匀浆液，并将上清液转移至洁净的离心管中。注意不要扰动腭部。尽管目前有多种其他均质化技术可用，但 probation 方法在从生物样本中分离少量朊病毒种子方面更具优势。这种机械解离能够对组织进行稳定且高效的破碎，从而实现后续的种子提取。然后分装上清液，并将裂解物置于-80摄氏度保存。在无菌条件下重新培养生物传感器细胞时，用预热的PBS洗涤每种细胞系，随后加入胰蛋白酶EDTA孵育3分钟。当细胞脱落时，用预热的培养基终止反应，并立即将细胞转移至锥形管中。将细胞重悬后离心，用新鲜培养基重悬沉淀。然后计数细胞，并配制每13毫升培养基含3,500,000个细胞的主细胞稀释液。使用多通道移液器，缓慢将130微升细胞悬液加入平底组织培养处理的96孔板的每个孔中，注意将移液器吸头置于孔中央，避免接触孔底。细胞接种后，于室温静置10分钟，使其沉降，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳及相对湿度大于等于80%的培养箱中过夜培养。次日当生物传感器细胞融合度达到60%至65%时，将减血清培养基、脂质体试剂和生物种子来源混合，制备转导复合物。然后用移液器沿每个生物传感器孔的孔壁缓慢加入20微升转导复合物，将处理后的细胞重新放回培养箱继续培养24至48小时，之后进行收获。未经处理的细胞仅显示弥散性荧光。然而，经 tau 种子材料处理的细胞将在一至两天后出现明亮的聚集物。收集细胞时，将细胞培养基替换为 50 µL 的胰蛋白酶-EDTA 溶液以终止反应。孵育 5 分钟后，加入 150 µL 冷却的培养基，立即将细胞转移至 96 孔圆底板中，离心形成细胞沉淀，小心吸除上清液而不扰动沉淀，随后在 50 µL 的 2% 多聚甲醛中轻柔而充分地重悬细胞，固定 10 分钟。然后再次离心细胞，并尽快将沉淀重悬于 200 µL 预冷的流式细胞术缓冲液中。固定后，将孔板装载到兼容 FRET 的流式细胞仪上，生成侧向散射面

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科研

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Bioengineering

生物工程

与FRET流式细胞仪灵敏地检测Proteopathic播种活动

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本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

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