与FRET流式细胞仪灵敏地检测Proteopathic播种活动
2015年12月8日
蛋白质聚集体或蛋白疗法种子的细胞间转移可能是神经退行性疾病病理进展的基础。在这里，描述了一种新型 FRET 流式细胞术测定法，该测定法能够特异性和灵敏地检测重组或生物样品的接种活性。
该程序的总体目标是检测来自重组或生物来源的 protio Pathic 接种活性，从而能够灵敏地检测蛋白质、聚集体和样品。这种方法可以帮助回答神经退行性疾病领域的关键问题。例如，我们如何定量评估疾病动物模型中治疗干预后接种活性的变化？
该技术的优点包括对低水平蛋白质聚集体的高特异性。其卓越的特异性、易用性和高通量。今天演示此程序的是我自己和合著者 Brandon Holmes。
要制备生物种子材料，首先在一次性乳清船中称量冷冻的脑组织。然后将组织转移到锥形管中，加入冰冷的匀浆缓冲液，使最终溶液为 10% 等待体积，然后将样品转移到冰上的冷藏室中。接下来，将探头 so 指示器调整到适当的设置，并冲洗探头的侧面和底部。
因此，如图所示，将指示剂尖端尖端滴入 3 次，在每种溶液之间擦去探针。探针准备好后，将尖端浸入一个样品的匀浆缓冲液中，然后开始超声处理，总共提供 25 个脉冲。当组织完全处于悬浮状态时，旋转匀浆并将旋囊转移到干净的试管中。
注意不要打扰味觉。虽然还有许多其他均质技术可用，但缓质法更适合从生物标本中分离少量的 protio pathic 种子。机械解离可实现一致和有效的组织分解和随后的种子提取。
然后分装仰卧位并将裂解物储存在负 80 摄氏度。为了在无菌条件下重放生物传感器细胞，用温热的 PBS 冲洗每个细胞系，然后用胰蛋白酶 EDTA 孵育 3 分钟。当细胞分离后，用温热的培养基停止反应，并立即将细胞转移到锥形管中。
离心细胞复苏，将沉淀悬浮在新鲜培养基中。然后对细胞进行计数，并制备每 13 毫升培养基 3， 500， 000 个细胞的预混细胞稀释液。使用多通道移液器，将 130 微升细胞缓慢转移到经组织培养处理的 96 孔板的每个孔中，注意将移液器吸头放在孔的中心，不要接触板的底部。
细胞铺板后，让它们在室温下不受干扰地沉淀 10 分钟，然后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和大于或等于 80% 相对湿度下孵育板过夜。第二天，当生物传感器细胞达到 60% 至 65% 汇合时，将还原血清培养基脂质体试剂和生物种子源混合以制备转导复合物。然后，将 20 微升转导复合物沿每个单独的生物传感器孔的侧面吸取，并将处理过的细胞放回培养箱中再 24 至 48 小时，然后再收获。
未处理的细胞将仅显示漫射荧光。然而，用 tau 种子材料处理的细胞会出现明亮的聚集体 收获细胞一到两天后，用 50 微升 tryin EDTA 替换细胞培养基，停止反应。用 150 微升冷冻培养物、培养基 5 分钟后，立即将细胞转移到 96 孔圆底板中并沉淀细胞，吸出 S 上清液而不干扰沉淀，然后轻柔但彻底地复苏，将细胞悬浮在 50 微升 2% 石环醛中 10 分钟。
然后再次旋转细胞，并尽快将沉淀重悬于 200 μL 冷冻流式细胞术缓冲液中。固定后，将板加载到 Fret兼容的流式细胞仪上，并通过变体图生成侧向散射区与前向散射区。接下来，在细胞系 1 运行的情况下，调整侧向散射和前向散射电压，直到细胞群位于左下象限。
然后使用多边形工具，将细胞群定义为步态 P 1。现在通过变体图制作前向散射高度与前向散射区域，并应用 P one 门。接下来，将单个单元格定义为步态 P 2 并每个单元格生成一个直方图。
对于 C-F-P-Y-F-P 和 fret 滤波器，将门 P 应用于 2 到 3 个不同的直方图，分别用于 C-F-P-Y-F-P 和 fret 滤波器进行补偿。将 30 μL 细胞系 1 悬液加标到 200 μL 细胞系 2 悬液中。然后单击仪器设置图标，然后单击补偿选项卡并选中矩阵以打开补偿表。
通过变量图生成品丝面积与 CFP 面积，并应用门 P 2。然后在细胞系 1 和细胞系 2 运行的情况下，单击象限图标并绘制象限，使荧光阴性和阳性群体被下部两个象限隔开。现在创建一个统计表，显示 LL 3 和 LR 3 门的 fret 的中值荧光强度或 MFI，并在补偿矩阵中调整 fret 参数，直到 fret 信号的 MFI 在 LL 3 和 LR 3 之间大致相等。
接下来，通过带有象限的变量图制作 YFP 面积与 CFP 面积。调整补偿矩阵中的 YFP 参数，直到 YFP 信号的 MFI 在象限之间大致相等。与之前显示的类似 用于 fret 流式细胞术。
初级荧光溢出发生在发射到 FRET 检测通道的 CFP 中，当所有门都设置完并且 CFP 信号已补偿时，可以使用单色阳性对照池通过荧光补偿进行校正。突出显示感兴趣的孔并运行板的其余部分以分析数据。首先，使用与设置流分析相同的参数定义单元格和单个单元格。
接下来，使用细胞系 3，通过变体图将 YFP 单阳性细胞绘制成 YFP 与 YFP 的品格。绘制一个多边形门，沿 fret 阳性细胞群的斜率运行并远离 fret 细胞群的斜率，以定义假 fret 步态，从而排除 YFP 溢出到 fret 滤波器中。将假品步态应用于所有样品后，通过可变图将空脂质体处理的 C-F-P-Y-F-P 细胞绘制到 CFP 与 CFP 的品格上，并沿向上和向左延伸的种群斜率引入多边形 ga远离种群。
任何转移到该门的事件都被认为是 Frace 阳性，细胞的百分比将与处理期间使用的种子滴度相关。最后，记录感兴趣的分析参数，包括 fret 阳性细胞的百分比和 fret 阳性细胞的中位荧光强度。然后测量阳性百分比和 MFI 的乘积，以手动计算积分品格密度。
在没有 tau 聚集体或种子的情况下，tau 保持可溶性单体状态，表现为一致的弥散和 fret 负荧光信号。将 tau 种子引入生物传感器细胞后，内源性 tau 转化为聚集和 Frace 阳性状态 Fare 定量。流式细胞术分析证实，重组 tau 的飞摩尔浓度足以进行检测。这里。
来自不同年龄处死的 tau 蛋白病小鼠的脑干组织作为代表性的大脑区域，表明早在 1.5 个月大时就一致地检测到动物的播种活动。在该实验中，来自阿尔茨海默病受试者的大脑同质表现出强大的接种活性，而年龄匹配的对照和亨廷顿病受试者没有表现出对用 tau、CFP 和 tau 转导的未经处理的原代神经元培养物的 tau 聚集体的测定特异性。YFP 慢病毒构建体在用重组 tau 种子处理后表现出弥漫性荧光信号。
然而，即使在没有脂质体介导的转导的情况下，内源性 tau 也会形成可通过 Fret流式细胞术检测到的大聚集体。当种子源与抑制 tau 摄取的药物（如肝素）预孵育并在没有脂质体的情况下进行处理时，重组 fis 和 tau 病小鼠脑样品中包含的接种活性可以被阻断。一旦掌握。
这项技术可以在三天内完成，每天只需一到两个小时的工作台工作。尝试此过程时，请务必记住，某些步骤需要内部优化。例如，在确定来自各种生物来源的 protio pathic 种子的有效滴度时。
观看此视频后，您应该对如何设置、运行和分析 fret 流式细胞术实验有很好的了解，以便检测来自重组和生物来源的 protio pathic 接种活性。
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概述
本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测法，旨在对来自重组或生物样本的蛋白病变传播活性进行敏感检测。该方法旨在通过评估蛋白聚集体来加深我们对神经退行性疾病进展的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经退行性疾病
- 蛋白聚集
- 细胞间转移机制
背景
- 蛋白聚集体被认为与神经退行性疾病的进展有关。
- 理解传播活性对于开发治疗干预措施至关重要。
- 现有方法可能缺乏对低水平聚集体的敏感性或特异性。
- FRET流式细胞术为检测提供了一种有前景的替代方法。
研究目的
- 开发一种用于检测蛋白病变传播活性的敏感检测法。
- 评估治疗干预后传播活性的变化。
- 提供一种高通量方法来评估蛋白聚集体。
使用的方法
- FRET流式细胞术检测法开发。
- 使用重组和生物样本进行测试。
- 对传播活性进行定量评估。
- 与现有方法比较特异性和敏感性。
主要结果
- 该检测法对低水平蛋白聚集体表现出高特异性。
- 它成功检测了各种样本类型中的传播活性。
- 结果表明该方法有可能在动物模型中评估治疗效果。
- 该方法易于使用，适合高通量应用。
结论
- 新型FRET流式细胞术检测法对于检测蛋白病变传播是有效的。
- 该方法可以显著推动神经退行性疾病研究。
- 未来的研究可能利用这一技术来探索治疗干预措施。
常见问题
Executive Industry Relevance
Ultra-sensitive detection of proteopathic seeding activity is critical for de-risking neurodegenerative disease targets and quantifying mechanistic propagation in early discovery. The FRET flow cytometry assay enables quantitative, high-throughput evaluation of protein aggregation, supporting predictive confidence in target validation and translational biomarker development. This capability strengthens portfolio triage and informs advancement decisions for disease-modifying therapeutics in neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of proteopathic seed propagation mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by distinguishing tau-specific seeding from non-specific aggregation.
- Facilitates predictive confidence in therapeutic hypothesis testing and mechanistic de-risking.
- Provides a platform for evaluating intervention effects on seeding activity in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible biosensor cell lines for standardized aggregation assays.
- Enables high-throughput, quantitative readouts of seeding activity across diverse sample types.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
- Ensures robust detection thresholds and dynamic range for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by detecting seeding activity in human and animal brain homogenates.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of disease-relevant aggregation mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative seeding metrics.
- Supports mechanistic de-risking for lead identification and preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET flow cytometry assay integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling seamless hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies proteopathic seeding to clarify disease mechanisms and validate targets.
- Screening: Provides standardized, reproducible assay platforms for compound and intervention evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative outputs such as percent FRET positivity and integrated FRET density for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by supporting biomarker alignment in human and animal samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, scalable assay for diverse protein aggregation disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes aggregation detection with high sensitivity, reproducibility, and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of disease-modifying therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, FRET analytics, and biosensor cell line handling.
- Demands access to FRET-compatible flow cytometers and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating, compensation, and quantitative analysis parameters.
- May require adaptation for different proteopathic seeds or primary neuronal cultures.
- Optimization of seed titers and sample preparation is essential for consistent results.
