Caspase-3活性在鼠杏仁核测量用荧光分析法心肌梗死后

心肌梗死 （MI） 之后不仅会出现心脏功能受损，还会出现杏仁核细胞凋亡，杏仁核是参与 MI 行为后果的大脑区域。该方案描述了如何诱导 MI、收集杏仁核组织和测量其中的 caspase-3 活性（细胞凋亡的标志物）。

该程序的总体目标是使用荧光分光光度法测量心肌梗死后大鼠杏仁核中的半胱天冬酶-3 活性。这种方法可以回答行为神经科学领域的关键问题，例如心肌梗塞对认知能力、心理健康、衰老过程和睡眠的影响。这种技术的主要优点是简单、快速、可靠。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为它需要手术和组织采样的灵巧性。演示该程序的是我们实验室的研究助理 Kim Gilbert。根据批准的机构方案诱导麻醉后，在没有爪捏反射的情况下确认适当的麻醉。

用气管插管给大鼠插管，并将动物置于加热垫上的腹侧卧位，以将体温维持在 37 摄氏度。将气管插管连接到分配 2% 异氟烷的麻醉机上。接下来，用葡萄糖酸氯己定和异丙醇准备手术部位。

并在双眼涂抹眼药膏以防止干燥。在动物身上放置无菌窗帘，在手术部位周围形成无菌区域。并将所需的无菌手术器械放在动物旁边的另一个无菌区域。

接下来，用 10 号手术刀刀片或剪刀切开皮肤。使用剪刀或止血夹剥落肌肉组织。然后用剪刀或止血夹打开胸壁并定位胸部牵开器，并用止血夹打开心包。

为了诱导冠状动脉闭塞，首先将 360 毫米长的四零丝缝合线绕在冠状动脉降支周围并穿过相邻的心肌组织。将丝线的两端插入 14 号 1.25 厘米长的塑料管中。拉动丝线的两端，将管子向下推向动脉以阻塞动脉。

用止血夹夹住塑料管固定闭塞，并保持闭塞 40 分钟。40 分钟后，通过移除止血夹，然后移除软管和丝缝线来解除阻塞。用两根零缝合线闭合胸部，将一根柔性导管穿过胸腔，并用 10 毫升注射器从胸部抽出空气，以防止气胸。

用四根零丝缝合线缝合肌肉，用三根零丝缝合皮肤。在闭合最后一次皮肤缝合之前，再次使用 10 毫升注射器和导管从胸部抽出空气。完成闭合皮肤，然后停止异氟烷。

将大鼠放在干净的笼子中，并在麻醉恢复期间进行监测。每 8 小时重复给药一次镇痛药。按照批准的程序人道地将动物斩首后，将大鼠的头放在放在碎冰上的盘子上。

用剪刀打开颅骨。然后使用 rongeurs 分离骨轮，而不会通过向上拉来破坏下面的组织。接下来，将刮刀的扁平刀片放在颅骨底部和大脑的后腹面之间，轻轻向前推动刀片，将大脑从颅骨中抬出，从而将大脑从颅骨中分离出来。

将大脑放在其背面。确定小脑前面的下丘脑，并在下丘脑后端前面和前端后面的冠状面上切开大脑。将双侧杏仁核识别为下丘脑旁边的颞叶下方的两个小球体。

然后将大脑的前端平放，背表面远离实验者。接下来，将半球分开，从连续的杏仁核中取出皮层。当杏仁核露出时，用手术刀切掉杏仁核。

沿着穿过杏仁核的深色缝合线切开，将基底外侧和中央内侧部分分开，然后将这两个部分放在冰上单独标记的管中。此步骤必须尽快完成，以防止酶变质。在对另一个半球重复解剖程序后，将所有四个小瓶浸入液氮中 1 分钟，然后储存在负 80 摄氏度的冰箱中。

首先，向每 5 至 10 mg 冰上样品中加入 150 μL 裂解缓冲液。在冰上以最大强度对每个样品进行超声处理 5 秒钟。然后在冰上孵育 30 分钟。

在孵育过程中，每 5 分钟涡旋样品 5 秒钟。然后，通过将样品交替置于液氮中和设置在 37 摄氏度的恒温控制加热板上，进行三个冻融循环。在最后一次冻融循环后，将组织样品在 4 摄氏度下以 1300 Gs 离心 10 分钟。

接下来，小心吸出上清液并转移到冰上的新试管中。根据书面方案中的说明定量蛋白质后，将 25 微克蛋白质加入含有 0.8 微升 10 毫摩尔 Ac-DEVD-AMC 和反应缓冲液的反应管中，最终体积为 200 微升。对于阴性反应样品，将 25 μg 蛋白质与 1 μL 800 μmol Ac-DEVD-CHO 和 0.8 μL 10 millimol Ac-DEVD-AMC 混合。

将所有样品和对照品在 37 °C 下避光孵育 3 小时。孵育时间过后，在每个样品和对照中加入 600 μL 0.4 mol 甘氨酸和 0.4 mol 氢氧化钠，pH 值为 10，终止反应。在玻璃比色皿中的每个反应中加入 2 毫升蒸馏水。

通过荧光分光光度法定量荧光。读取对照和样品 10 秒，每秒读取一次。最后，根据屏幕上显示的公式量化每个样品中的比活性。

该直方图显示了心肌梗死大鼠杏仁核中的 caspase-3 活性。数据表示为假对照中平均活性的百分比设置为 100%每组由 8 只大鼠组成。星号表示组间差异显著，p 值小于 0.05。

一旦掌握，这项技术可以在 7 小时内完成，不包括心肌梗塞手术和组织取样之间的间隔。看完这个视频，你应该对如何诱导大鼠心肌梗死和使用荧光分光光度法测量大鼠杏仁核中的 caspase-3 活性有一个很好的了解。