通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 Caspase-3 活性

本实验的总体目标是利用荧光分光光度法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中caspase-3的活性。该方法可回答行为神经科学领域的一些关键问题，例如心肌梗死对认知功能、心理健康、衰老过程及睡眠的影响。该技术的主要优点在于操作简单、快速且结果可靠。

通常，初次接触该方法的人可能会感到困难，因为该操作需要具备外科手术和组织取样的灵巧技能。本次操作演示由本实验室研究助理 Kim Gilbert 进行。根据批准的机构实验动物麻醉方案实施麻醉后，通过观察足趾夹捏反射是否消失来确认麻醉效果是否充分。

使用气管插管对大鼠进行插管，并将其置于加热垫上呈仰卧位，以维持体温在37摄氏度。将气管插管连接至麻醉机，持续供给2%异氟烷。随后，使用氯己定葡萄糖酸盐和异丙醇准备手术区域。

并在双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。将无菌手术巾覆盖于动物体表，以在手术区域周围创建无菌区域。将所需无菌手术器械置于动物旁的另一无菌区域上。

接着，使用10号手术刀片或剪刀切开皮肤。用剪刀或止血钳剥离肌肉组织。然后用剪刀或止血钳打开胸壁，放置胸腔牵开器，并用止血钳切开心包膜。

为诱导冠状动脉闭塞，首先将一根长 360 毫米的 4-0 丝线穿过降支冠状动脉及邻近的心肌组织。将丝线的两端穿入一根 14 号、长 1.25 厘米的塑料套管中。牵拉丝线两端，并将套管向下推压至动脉处以实现闭塞。

使用止血钳夹紧塑料管以确保阻塞，并维持阻塞状态40分钟。40分钟后，移除止血钳，随后取出软管和丝线缝合线，解除阻塞。用2-0缝线关闭胸腔，并通过胸腔插入一根软质导管，使用10 mL注射器抽出胸腔内的空气，以防止气胸的发生。

用4-0丝线缝合肌肉，用3-0丝线缝合皮肤。在缝合最后一针皮肤前，再次使用10毫升注射器和导管抽出胸腔内的空气。皮肤缝合完毕后，停止异氟烷麻醉。

将大鼠放入清洁的笼子中，并在麻醉恢复期间进行监测。每八小时重复给予镇痛药物。根据批准的程序对动物实施人道断头后，将大鼠头部置于盛有碎冰的培养皿上。

使用剪刀打开颅骨。然后使用咬骨钳向上牵拉，剥离骨束，注意不要损伤下方的组织。接着，将解剖刀的平刃置于颅底与脑后腹面之间，轻轻向前推动刀刃，将脑组织从颅骨中分离，并将其抬起取出。

将脑组织置于背侧表面。在小脑前方识别下丘脑，并在下丘脑后端之前和前端之后分别进行冠状切面切割。在颞叶下方紧邻下丘脑处，识别出成对的杏仁核，表现为两个小球状结构。

然后将脑组织腹侧朝下，额端平放，背侧远离操作者。接着分离大脑半球，去除覆盖在连续杏仁核上的皮层组织。暴露杏仁核后，用解剖刀将其完整切除。

沿贯穿杏仁核的深色缝线剪开，以分离基底外侧部和中央内侧部，随后将两部分分别置于预先标记的离心管中，并立即置于冰上。此步骤需尽快完成，以防止酶类降解。重复上述分离操作处理另一侧半球后，将全部四个离心管浸入液氮中一分钟，随后转移至-80摄氏度超低温冰箱中保存。

首先，在冰上向每5至10毫克样品中加入150微升裂解缓冲液。在冰上以最大强度对每个样品超声处理5秒。然后在冰上孵育30分钟。

孵育期间，每5分钟涡旋振荡样品5秒。随后，通过将样品交替置于液氮和设定为37°C的恒温加热板上，进行三次冻融循环。最后一次冻融循环结束后，在4°C条件下以1300 × g离心组织样品10分钟。

接下来，小心吸取上清液并转移至冰上预冷的新离心管中。根据书面实验方案中的说明定量蛋白质后，将25微克蛋白质加入反应管中，反应管内含有0.8微升10毫摩尔的Ac-DEVD-AMC以及反应缓冲液，最终体积为200微升。对于阴性反应样品，将25微克蛋白质与1微升800微摩尔的Ac-DEVD-CHO以及0.8微升10毫摩尔的Ac-DEVD-AMC混合。

将所有样品和对照组在37摄氏度避光孵育三小时。孵育结束后，向每个样品和对照组中加入600微升pH为10的0.4摩尔甘氨酸和0.4摩尔氢氧化钠溶液以终止反应。在玻璃比色皿中，向每份反应体系加入两毫升蒸馏水。

通过荧光分光光度法测定荧光强度。对对照组和样品进行10秒读数，每秒读取一次。最后，根据屏幕上显示的公式计算各样品中的特异性活性。

该直方图显示了经历心肌梗死的大鼠杏仁核中caspase-3的活性。数据表示为假手术对照组平均活性的百分比，假手术对照组设定为100%。每组包含八只大鼠。星号表示组间差异具有显著性，p值小于0.05。

掌握该技术后，除心肌梗死手术与组织取样之间的间隔时间外，整个过程可在七小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在大鼠中诱导心肌梗死，并利用荧光分光光度法测定大鼠杏仁核中caspase-3的活性。