Name: Caspase-3活性在鼠杏仁核测量用荧光分析法心肌梗死后 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习使用荧光光谱法测量大鼠心肌梗死后杏仁核中Caspase-3活性。该方法可评估心肌缺血对脑区细胞凋亡的影响，为研究心脏事件与认知功能障碍的关系提供可靠技术。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会资助项目的资助。 Kim Gilbert 获魁北克健康研究基金会博士奖学金资助。

动物的饲养和操作严格遵守当地动物护理委员会的规定，并符合加拿大动物护理委员会指南的要求. 大鼠在恒定环境条件下单独饲养（温度 21–22 ºC，湿度 40–50%），并维持 12 小时光照-黑暗循环，光照始于上午 08:00。自由供应饲料颗粒和自来水 随意供应 在整个研究过程中，动物在供应商交付后需经过3天的适应期方可开始实验。本方案常规使用体重在300–800 g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。
1. 心肌梗死手术
<ol>
	<li>使用氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行腹腔注射以诱导麻醉。通过轻捏足掌无反射反应确认麻醉成功。</li>
	<li>剃除手术部位毛发。使用气管插管（16G，1.77英寸导管）对大鼠进行插管，并将动物置于侧卧位。将动物放置在加热垫上，维持体温约37 °C。将气管插管连接至2%异氟烷。</li>
	<li>用氯己定葡萄糖酸盐和异丙醇准备手术部位。手术过程中使用无菌手套和灭菌器械。在麻醉期间，于双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。将动物置于无菌区域，并将器械放置在动物旁边的另一无菌区域上。</li>
	<li>用10号手术刀片切开皮肤。用止血钳剥离肌肉组织。将动物置于俯卧位。用止血钳打开胸壁并放置胸廓牵开器。用止血钳切开心包膜。</li>
	<li>为制造冠状动脉闭塞，将一根长360 mm的4-0丝线缝合线环绕于冠状动脉降支，并穿过相邻的心肌组织。将丝线的两端穿入一段长1.25 cm、14G的塑料管中。</li>
	<li>牵拉丝线缝合线的两端，将导管向下推压紧贴动脉以阻断血流，持续40分钟。使用止血钳夹紧塑料导管，确保阻断牢固。</li>
	<li>40分钟后，松开止血夹以解除阻断，随后移除软管和丝线。 
	注：假手术对照组大鼠接受相同的手术操作，但不进行冠状动脉结扎。</li>
	<li>在关闭胸壁前，将一根软质导管（18G，4.5 cm）穿过胸腔，用5 ml注射器抽出胸腔内的空气，以防止气胸的发生。</li>
	<li>用2-0缝线闭合胸腔，4-0丝线缝合肌肉，3-0丝线缝合皮肤。</li>
	<li>在缝合最后一处皮肤切口前，再次通过先前置于胸腔内的导管，用5 ml注射器抽出胸腔内的空气。</li>
	<li>缝合最后一针皮肤。停止异氟烷通气。</li>
	<li>监测大鼠苏醒情况。在动物未恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得离开动物无人看管。</li>
	<li>每8小时给大鼠注射一次镇痛剂（布托啡诺，0.05 mg/kg，腹腔注射）和抗生素（双氯西林单剂量，0.2 mg/kg，腹腔注射），持续24小时。</li>
	<li>手术后，将大鼠单独饲养至处死时间点 即，心肌梗死后第3天</li>
	<li>梗死面积，主要为坏死区域，以左心室风险区中梗死组织所占比例表示。可通过三苯基四氮唑染色法进行测量。11.</li>
</ol>
2. 杏仁核分离
<ol>
	<li>将动物头部朝前放入锥形袋中，使其鼻部从窄端开口处伸出。固定大鼠以避免任何移动。将其头部适当放置在剪切器的刀片之间，进行断头。</li>
	<li>将大鼠头部置于盛有碎冰的培养皿中。所有组织分离操作均需在碎冰上（4 °C）进行。</li>
	<li>用剪刀剪开颅骨，使用骨钳小心向上牵拉，剥离骨膜，注意避免损伤下方组织。</li>
	<li>将刮勺的平刃置于颅底与脑后腹面之间，沿颅底轻轻向前推动刮勺，使脑组织逐渐与颅骨分离，直至可缓慢将脑取出。弃去颅骨。</li>
	<li>将脑组织背侧朝下放置。辨认下丘脑（位于小脑前方的结构），在下丘脑前端之前和后端之后进行冠状切面切割；若前后部分无需用于其他用途，则予以弃去。</li>
	<li>在双侧颞叶下方、紧邻下丘脑处，可见杏仁核呈小球状结构。</li>
	<li>将脑组织前端平放，背侧朝远离实验操作者方向。</li>
	<li>从脑的左侧或右侧开始。分离两侧半球，再将皮层与相邻的杏仁核分开。切除约 8 mm 的松散皮层组织，以便分离杏仁核。用手术刀切除杏仁核。</li>
	<li>沿贯穿该结构的深色缝线进行切割，将近似均等地分离杏仁核的基底外侧部与内侧中央部。此缝线结构并不总是易于识别。</li>
	<li>将杏仁核亚区分别放入已标记的样品管中，并置于碎冰上保存。</li>
	<li>对另一侧脑半球重复上述解剖步骤。</li>
	<li>将样品管浸入液氮中 1 分钟。随后将样品管保存于 -80 °C 冰箱中，待后续使用。</li>
</ol>
3. Caspase-3 活性
<ol>
	<li>用0.32 M蔗糖、1% Triton-X-100、10 mM Tris-HCl（pH 8）、5 mM乙二胺四乙酸、2 mM二硫苏糖醇、1 mM苯甲基磺酰氟、10 µg/µl亮抑蛋白酶肽、10 µg/µl胃蛋白酶抑制剂A和10 µg/µl抑肽酶配制裂解缓冲液。</li>
	<li>向每个样品（5–10 mg）中加入150 µl裂解缓冲液，置于冰上。在冰上以最大强度（40 W）对每个样品超声处理5秒。将组织在裂解缓冲液中于冰上孵育30分钟。每个样品涡旋振荡5分钟。</li>
	<li>通过将样品交替置于液氮和设定为37 °C的温控加热板上，进行3次冻融循环。在13,000 g（4 °C）下离心组织10分钟。小心移去上清液，并将上清液置于冰上的管中保存。</li>
	<li>使用牛血清白蛋白配制0至10 µg/ml之间的标准蛋白浓度梯度。仅用缓冲液配制空白对照。</li>
	<li>向每个标准品中加入200 µl Bradford试剂。在595 nm波长下测定标准品吸光度。测定蛋白含量时，将5 µl样品上清液加入795 µl蒸馏水中，再加入200 µl Bradford试剂。在595 nm波长下测定每个样品的吸光度，并利用标准曲线定量蛋白浓度。</li>
	<li>用50 mM Tris-HCl（pH 7）、5 mM MgCl2、1 mM乙二醇四乙酸、0.1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐和1 mM二硫苏糖醇配制反应缓冲液。</li>
	<li>向反应缓冲液中加入25 µg蛋白和caspase-3底物，以获得阳性和阴性反应样品。对于阴性样品，加入反应缓冲液、25 µg蛋白、0.4 µl 800 µM Ac-DEVD-CHO和0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC。对于阳性样品，将25 µg蛋白加入反应缓冲液中，并加入0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC。所有阴性和阳性样品均设三个重复。通过加入反应缓冲液将每个样品的终体积补至200 µl。</li>
	<li>制备阴性对照：向188.7 µl反应缓冲液中加入0.5 µl 800 µM Ac-DEVD-CHO、0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC和10 µl裂解缓冲液。制备阳性对照：向189.2 µl反应缓冲液中加入0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC和10 µl裂解缓冲液。</li>
	<li>将样品和对照在避光条件下于37oC孵育3小时。</li>
	<li>向每个样品和对照中加入600 µl 0.4 M甘氨酸和0.4 M NaOH（pH 10）以终止反应。</li>
	<li>使用荧光分光光度法在激发波长365 nm、发射波长465 nm下测定荧光强度。在玻璃比色皿中向反应液中加入2 ml蒸馏水。对每个对照和样品连续读数10秒，每秒采集1个数据点。</li>
	<li>计算各样品的特异性活性：[(阴性样品荧光值减去阳性样品荧光值) × 2.8 ml总体积] 除以 (孵育时间3小时 × 蛋白量25 mg)。</li>
</ol>

<ol><li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+keys+in+the+ignition+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li>
<li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors%3A+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li>
<li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRousseau%2C+G+%22Novel+Strategies+in+Ischemic+Heart+Disease+%22">Novel Strategies in Ischemic Heart Disease </a>. Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li>
<li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li>
<li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li>
<li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li>
<li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li>
<li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1%2C+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid%2C+decreases+post-myocardial+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction%3A+effects+of+sertraline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).</li>
<li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+re-visited%3A+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%3A+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li>
<li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Killing+the+blues%27%3A+a+role+for+cellular+suicide+%28apoptosis%29+in+depression+and+the+antidepressant+response%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+paper+wraps+stone+blunts+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去10年使用该方案的经验中，我们识别出了一些关键的方法学问题。首先，在装有碎冰的培养皿中快速进行脑组织解剖对于保持制备质量至关重要。其次，必须认识到，与心脏（10秒）或肾脏（20秒）等其他组织相比，大脑杏仁核组织的超声处理时间更短。第三，在将底物加入样品前，应仔细充分混匀底物；若混匀步骤不当，我们曾观察到信号出现波动。第四，读取样品时石英比色皿中不得含有气泡，否则可能导致信号异常。
近年来，我们进行了一项改进以提高实验结果的可重复性：增加底物体积，以避免体积低于1 µl。尽管如此，连续实验之间仍可能出现微小差异，因此至少应使用3个对照样品来控制变异。这些对照样品的荧光测量值取平均值，并将该平均值设定为100%。实验样品的荧光测量值则转换为对照样品的百分比形式。
该技术的另一个局限性在于仅使用了部分组织，因此可能低估caspase-3的活性。事实上，在特定细胞中，凋亡的时间窗口较短，在取样时即使邻近区域发生了凋亡，也可能被遗漏1,4,15。相反的情况也有可能发生：在某些组织区域中凋亡可能特别剧烈，从而导致caspase-3活性被高估。我们建议将剩余的组织（如杏仁核）用于其他补充性技术，例如TUNEL检测或Bax/Bcl2比值分析（参见引言部分）。
与蛋白质印迹法相比，荧光分光光度法至少具有两个优势。第一，它可直接生成定量数据。第二，它测量的是酶活性本身，而非可能与酶活性无关的蛋白质或RNA表达水平；已知蛋白质表达水平可能升高，而酶活性并无变化。此外，荧光分光光度法可用于其他组织或不同动物物种，并可通过使用不同的底物调整用于其他半胱天冬酶（caspase）亚型，从而实现安全的比较分析。
综上所述，本文展示了利用荧光分光光度法检测杏仁核中caspase-3活性的方法，提供了心肌梗死3天后边缘系统这一区域发生细胞凋亡的证据。

Caspases（即依赖半胱氨酸的天冬氨酸定向蛋白酶）是一类参与多种稳态过程的酶1。根据其在细胞凋亡或炎症中的作用，Caspases 可 broadly 分为两类。其中，Caspase-1、-4、-5 和 -12 参与炎症反应；而参与细胞凋亡的 Caspases 可进一步分为起始型 Caspases（Caspase-8 和 -9）和效应型 Caspases（Caspase-3、-6 和 -7）。
Caspase 在多种病理过程中发挥重要作用，主要见于细胞凋亡过度的疾病，例如心肌梗死（MI）或脑缺血后所观察到的情况。
在我们实验室所采用的MI后综合征大鼠模型中，已证实caspase-3不仅在心肌组织2中被激活，也在参与情绪和情感调控的边缘系统中被激活3-6。此外，caspase-3在边缘系统的不同区域（如杏仁核和海马）均被激活，且其激活水平在缺血损伤后约3天达到峰值4。有趣的是，caspase-3的活性与MI后的行为功能障碍相关，通过药理学和营养干预手段抑制其活性可减轻这些损伤，提示caspase-3可能与MI后抑郁存在关联7-12。
Caspase-3 的激活可通过多种技术进行检测。Western 印迹法可确定caspase酶的酶学特性，能够检测到活性酶及其前体酶形式。然而，Western 印迹法为半定量方法，微小的变化可能因信噪比较低而难以察觉13。更优的技术是基于caspase-3对底物（DEVD-AMC）的切割作用，释放出荧光化合物，可通过荧光分光光度法进行测定。Caspase-3 的激活是细胞凋亡的一个可靠标志物。由于细胞凋亡发生的时间窗口较短，且邻近细胞可能吞噬凋亡小体或凋亡细胞14，因此凋亡的检测结果可能不稳定。细胞凋亡还可通过其他技术进一步确认，例如末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法，该方法可检测由凋亡信号级联反应引起的DNA片段化6，或通过检测促凋亡/抗凋亡蛋白的比例（如Bax/Bcl2）6来验证。

<table><tbody><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Photon technology Instrument（现为 Horiba）</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>配备 DeltaRAM&amp;nbsp; 随机存取单色器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>小型动物通气</td></tr><tr><td>玻璃比色皿</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>光学玻璃（340–2,500 nm），10 mm 光程</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; 系列</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 caspase-3 活性

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

心肌梗死（MI）在生理和行为层面上具有显著的中期和长期后果，但其潜在机制仍不明确。本实验室建立了一种心肌梗死后综合征的大鼠模型，该模型表现出心脏功能受损、边缘系统神经元丢失、认知障碍以及抑郁样行为表现。在神经元层面，caspase-3 的激活介导了心肌梗死后不同边缘区（如杏仁核）的细胞凋亡，其活性在 MI 后第 3 天达到峰值。认知与行为障碍出现在 MI 后 2 至 3 周，且这些障碍在统计学上与 caspase-3 活性指标相关。本文所述方案用于诱导心肌梗死、采集杏仁核组织，并通过荧光分光光度法测定 caspase-3 活性。为诱导心肌梗死，需对冠状动脉降支进行 40 分钟的结扎闭塞。caspase-3 激活评估方案始于 MI 后第 3 天：处死大鼠后迅速从脑中分离杏仁核组织。样本立即在液氮中速冻，并保存于 -80 °C，直至实际检测。用于评估 caspase-3 激活的技术基于 caspase-3 对底物（DEVD-AMC）的切割作用，该过程释放出一种可被荧光分光光度法检测的荧光化合物。该方法具有定量准确、可重复性高的优点，但所需设备昂贵，且样本定量过程耗时较长。该技术可应用于其他组织，如心脏和肾脏。DEVD-AMC 可替换为其他底物，以检测其他 caspase 的活性。

在缺血/再灌注处理后第3天，从8只假手术（对照）大鼠和8只心肌梗死（MI）大鼠中分离出杏仁核组织。使用一种可被活化型caspase-3切割的荧光底物，通过荧光分光光度法检测该组织中的caspase-3活性。阳性与阴性测量值（见步骤3.11、3.12和3.16）均设三个重复，测量持续10秒，每秒记录1个数据点。计算阳性与阴性对照之间的差值，并将本实验中所有假手术组组织的差值平均值设定为100%。心肌梗死大鼠的结果据此参考值进行归一化处理，图1展示了最终结果：与假手术组相比，心肌梗死大鼠的caspase-3活性显著升高（p &lt;0.05）。
<img alt="Caspase-3 活性柱状图；MI 与假手术组结果对比；细胞凋亡分析；显著差异。" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 心肌梗死大鼠杏仁核中 Caspase-3 活性，以假手术对照组平均活性的百分比表示，对照组设为 100%（每组 8 只大鼠）。* 表示组间差异具有统计学意义（p &lt;0.05）。数据以均值 ± 标准误表示。

心肌梗死（MI）不仅会导致心脏功能受损，还会引发杏仁核的细胞凋亡，杏仁核是参与心肌梗死后行为学改变的脑区。本方案描述了如何诱导心肌梗死、采集杏仁核组织，并检测其中的caspase-3活性——一种细胞凋亡的标志物。

通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 Caspase-3 活性

心肌梗死（MI）在生理和行为层面上具有显著的中期和长期后果，但其涉及的机制仍尚不明确……

本实验的总体目标是利用荧光分光光度法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中caspase-3的活性。该方法可回答行为神经科学领域的一些关键问题，例如心肌梗死对认知功能、心理健康、衰老过程及睡眠的影响。该技术的主要优点在于操作简单、快速且结果可靠。通常，初次接触该方法的人可能会感到困难，因为该操作需要具备外科手术和组织取样的灵巧技能。本次操作演示由本实验室研究助理 Kim Gilbert 进行。根据批准的机构实验动物麻醉方案实施麻醉后，通过观察足趾夹捏反射是否消失来确认麻醉效果是否充分。使用气管插管对大鼠进行插管，并将其置于加热垫上呈仰卧位，以维持体温在37摄氏度。将气管插管连接至麻醉机，持续供给2%异氟烷。随后，使用氯己定葡萄糖酸盐和异丙醇准备手术区域。并在双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。将无菌手术巾覆盖于动物体表，以在手术区域周围创建无菌区域。将所需无菌手术器械置于动物旁的另一无菌区域上。接着，使用10号手术刀片或剪刀切开皮肤。用剪刀或止血钳剥离肌肉组织。然后用剪刀或止血钳打开胸壁，放置胸腔牵开器，并用止血钳切开心包膜。为诱导冠状动脉闭塞，首先将一根长 360 毫米的 4-0 丝线穿过降支冠状动脉及邻近的心肌组织。将丝线的两端穿入一根 14 号、长 1.25 厘米的塑料套管中。牵拉丝线两端，并将套管向下推压至动脉处以实现闭塞。使用止血钳夹紧塑料管以确保阻塞，并维持阻塞状态40分钟。40分钟后，移除止血钳，随后取出软管和丝线缝合线，解除阻塞。用2-0缝线关闭胸腔，并通过胸腔插入一根软质导管，使用10 mL注射器抽出胸腔内的空气，以防止气胸的发生。用4-0丝线缝合肌肉，用3-0丝线缝合皮肤。在缝合最后一针皮肤前，再次使用10毫升注射器和导管抽出胸腔内的空气。皮肤缝合完毕后，停止异氟烷麻醉。将大鼠放入清洁的笼子中，并在麻醉恢复期间进行监测。每八小时重复给予镇痛药物。根据批准的程序对动物实施人道断头后，将大鼠头部置于盛有碎冰的培养皿上。使用剪刀打开颅骨。然后使用咬骨钳向上牵拉，剥离骨束，注意不要损伤下方的组织。接着，将解剖刀的平刃置于颅底与脑后腹面之间，轻轻向前推动刀刃，将脑组织从颅骨中分离，并将其抬起取出。将脑组织置于背侧表面。在小脑前方识别下丘脑，并在下丘脑后端之前和前端之后分别进行冠状切面切割。在颞叶下方紧邻下丘脑处，识别出成对的杏仁核，表现为两个小球状结构。然后将脑组织腹侧朝下，额端平放，背侧远离操作者。接着分离大脑半球，去除覆盖在连续杏仁核上的皮层组织。暴露杏仁核后，用解剖刀将其完整切除。沿贯穿杏仁核的深色缝线剪开，以分离基底外侧部和中央内侧部，随后将两部分分别置于预先标记的离心管中，并立即置于冰上。此步骤需尽快完成，以防止酶类降解。重复上述分离操作处理另一侧半球后，将全部四个离心管浸入液氮中一分钟，随后转移至-80摄氏度超低温冰箱中保存。首先，在冰上向每5至10毫克样品中加入150微升裂解缓冲液。在冰上以最大强度对每个样品超声处理5秒。然后在冰上孵育30分钟。孵育期间，每5分钟涡旋振荡样品5秒。随后，通过将样品交替置于液氮和设定为37°C的恒温加热板上，进行三次冻融循环。最后一次冻融循环结束后，在4°C条件下以1300 × g离心组织样品10分钟。接下来，小心吸取上清液并转移至冰上预冷的新离心管中。根据书面实验方案中的说明定量蛋白质后，将25微克蛋白质加入反应管中，反应管内含有0.8微升10毫摩尔的Ac-DEVD-AMC以及反应缓冲液，最终体积为200微升。对于阴性反应样品，将25微克蛋白质与1微升800微摩尔的Ac-DEVD-CHO以及0.8微升10毫摩尔的Ac-DEVD-AMC混合。将所有样品和对照组在37摄氏度避光孵育三小时。孵育结束后，向每个样品和对照组中加入600微升pH为10的0.4摩尔甘氨酸和0.4摩尔氢氧化钠溶液以终止反应。在玻璃比色皿中，向每份反应体系加入两毫升蒸馏水。通过荧光分光光度法测定荧光强度。对对照组和样品进行10秒读数，每秒读取一次。最后，根据屏幕上显示的公式计算各样品中的特异性活性。该直方图显示了经历心肌梗死的大鼠杏仁核中caspase-3的活性。数据表示为假手术对照组平均活性的百分比，假手术对照组设定为100%。每组包含八只大鼠。星号表示组间差异具有显著性，p值小于0.05。掌握该技术后，除心肌梗死手术与组织取样之间的间隔时间外，整个过程可在七小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何在大鼠中诱导心肌梗死，并利用荧光分光光度法测定大鼠杏仁核中caspase-3的活性。

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Caspase-3活性在鼠杏仁核测量用荧光分析法心肌梗死后

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量化活性 顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3...

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活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

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丘脑前核深部脑刺激后大鼠海马区基因表达变化的分析

学习使用荧光光谱法测量大鼠心肌梗死后杏仁核中Caspase-3活性。该方法可评估心肌缺血对脑区细胞凋亡的影响，为研究心脏事件与认知功能障碍的关系提供可靠技术。

通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 Caspase-3 活性

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