微灌流技术用于研究大鼠肠系膜微血管通透性的调控机制

以下实验的总体目标是在可控的实验条件下，实现对大鼠肠系膜中微血管壁液压传导率或水渗透性的重复测量。通过插管微血管，可设定管腔内的胶体渗透压和静水压，并精确控制灌注液的化学成分。接着，阻塞血管，并在灌注液中悬浮红细胞，这些红细胞可作为流动示踪剂，在管腔内移动，用以指示跨血管的液体交换情况。

然后记录标记红细胞向阻塞部位或远离阻塞部位的运动位置和速度。最后，解除阻塞，可重复进行额外测量，或对血管重新插管，并在改变实验条件后重复测量。

最终，通过在对照条件和测试条件下对水传导率进行配对测量，可最直接地研究调控微血管通透性的各种因素。改良兰迪斯技术在研究毛细血管通透性调控方面的一个优势在于灌流步骤。微灌流使得微血管壁通透性能够在灌流液成分、交换表面积以及微血管压力均得到直接控制的条件下进行测定。

该方法可用于研究具有完整器官代表性的微血管中通透性调控的细胞与分子机制，并可将结果与培养的内皮单层细胞进行比较，后者常被用于深入探究分子机制的细节。本次演示本实验方案的是我们的实验室主管乔伊斯·克拉克（Joyce Clark）。在担任实验室主管期间，她对本实验方案的诸多改进做出了重要贡献。

首先，使用电子拉制仪将数根洁净的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成锥形的两半，每根毛细管尖端长度约为1厘米，使用气动驱动的研磨轮和浸在水中的0.5微米粒径砂纸，并将微移液管固定器设置为与水平面成30度角进行研磨，制备微移液管。根据文本方案清洗并干燥微移液管后，选择开口长度约为50微米、斜面长度与宽度比在3.1至3.5之间的微移液管。其尖端应具有明显的锥形结构，有助于穿透肠系膜中坚韧的胶原纤维。

制作限制器时，将一根无斜面的拉制玻璃毛细管短暂地靠近微小火焰，以形成钝端。重复此操作以制备多个限制器，并将其存放于无尘盒中。随后制作微堵塞器：将一根无斜面的拉制毛细管在微小火焰下倾斜持握，使用管接头或断裂的微量移液器，在距离尖端约四毫米处将其轻轻弯曲，弯曲角度接近120度。

关于玻璃管尖端，需要注意的是既不能在火焰中封口，也不能将其折断。将大鼠麻醉后，按照文本方案中的说明放置肠系膜组织和肠道，然后将动物载物台置于显微镜载物台上，使肠系膜可通过目镜观察到。连接重力滴注的哺乳动物林格氏液管路，以持续灌流组织表面。

然后使用纱布垫固定肠道位置，帮助保持湿润并吸除表面多余的林格液，调节灌流速度并吸出流出液，以维持一层恒定的灌流液。识别目标小静脉微血管，这些是位于汇合血流下游、且在真毛细血管远端一到两个分支处的无分支节段。选择一段血流迅速且血管壁上无白细胞黏附的无分支血管。将待测微血管置于显微镜视野中央，并将固定器移至选定的插管部位附近。

为填充微量移液器，根据文本方案将灌注液吸入并冲洗红细胞进入已准备好的注射器，确保管路中无气泡。将管路推进微量移液器的粗端，直至抵住锥形区域。轻轻快速推动注射器活塞，使微量移液器尖端充满液体。

当吸满时，尖端会出现细小的液流或液滴。撤出导管时，轻轻推动推杆以充满微量移液器杆部。接着，轻轻弹击杆部以除去其中的小气泡。

然后将微量移液器插入带有侧孔的移液器架中，侧孔可使其与水压计保持持续的液体连通。确保固定架（连接至液压驱动装置和显微操作器）处于轻微的水平角度，以避免微量移液器锥形末端边缘触碰到肠组织或托盘。使用注射器或充满水的橡胶吸头，通过调节水压计水柱中液面高度，使施加在微量移液器内液体上的静水压约为高于肠系膜 40 厘米水柱。

在将装液的微移液管置于显微镜下之前，轻轻将固定器压在微血管附近的组织上，施加足够的压力以夹住组织，然后将固定器略微向后拉动，沿微血管方向拉伸组织，使肠系膜胶原纤维的应力方向与血管一致。将微移液管与血管对齐，并通过目镜将其缓慢下移至视野中。将移液管尖端置于选定套管位置的上游稍远处，再将其轻轻下放至组织上，使其部分阻碍血管内的血流，但不完全阻断血流。

使用液压驱动装置，通过缓慢推动移液管尖端进入血管腔来插管，注意不要将尖端推过血管的另一侧。当微移液管进入血管腔时，灌注液会迅速将血液冲洗出血管腔并进入循环系统。通过调节压力计降低灌注压力，直至红细胞在血管腔内轻微振荡。

这用于确定平衡压力，即测量微血管段远端的静水微血管压力或PC。为进行微阻塞，需保持血管灌注压力高于此平衡压力。利用视频和音频，将阻断器放置在灌注血管上方、靠近显微镜视野下缘的位置。

口述记录在 I 型红细胞中观察到的阻断部位位置。阻断部位位于第 57 位，将阻断器的尖端置于微血管上方。使用显微操作仪的精细 Z 轴控制，轻轻降低阻断器，直至血管内的血流被完全阻断。

使用音频记录压力计的压力。压力为50。然后闭塞3到10秒，随后释放。

为了恢复自由灌流，将阻塞位点沿血管向移液管尖端方向每次移动5到10微米，在每个位置进行不超过3到5次的阻塞，以防止阻塞部位的血管壁受损。根据文本方案分析数据。该时间过程测量水力电导率或LP的变化。在大鼠的微血管中，成功插管并使用四种灌流液进行灌注。

在恒定压力下，利用水力传导率（LP）的大小来测量微血管的变化。在以1% BSA作为对照与以10摩尔的炎症因子缓激肽（Brady Kinin，简称BK）进行灌注时的管壁通透性对比表明，如图所示，BK引起LP短暂升高，随后在10至15分钟内恢复至对照水平。

用1% BSA重新建立基线水平后，加入10纳摩尔的缓激肽（BK），同时再灌注1微摩尔的pH敏感型磷酸盐或S1P。结果表明，S1P显著减弱了对BK的反应。在某些实验设计中，估算大分子的溶质反射系数以及lp值均十分重要。

通过在每条单个微血管上测量多个压力下的 JV，可最佳实现此目的。本实验估算了 PERFUSE 八中 5% 白蛋白的有效胶体渗透压和 LP，当时微血管周围组织中无白蛋白。在三种不同压力下测量了 JV 与 S 的比值，并在此处绘制成图。

液压传导率（LP）是液体滤过速率（JV）与有效滤过压（S）之比关系的斜率，其在压力轴上的截距即为血管壁两侧的有效胶体渗透压差。当结合其他技术（如免疫荧光标记与共聚焦显微镜，甚至透射电子显微镜）使用时，微血管灌流技术可对已知通透性的血管进行微血管内皮结构与功能的有力分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在受控实验条件下，对大鼠肠系膜微血管的液压传导率或水通透性进行重复测量。

您可以在目前可用的大鼠模型中使用这种方法，但我特别感兴趣的是，它或许能够应用于即将通过CRISPR Cas9技术问世的新型基因修饰大鼠，我希望这种方法能以此方式得到拓展。