Name: 微灌技术在调查微血管渗透性的大鼠肠系膜条例 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学习使用改良Landis技术测量大鼠肠系膜微血管水力传导率的方法。该技术通过控制灌注压力和红细胞标记物，实现微血管渗透性的重复测量，为研究血管通透性的细胞和分子机制提供精确数据。

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本工作由美国国立卫生研究院基金项目 HL44485 和 HL28607 资助。

伦理声明：所有实验程序均经机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 微移液管、固定器和阻断器的初步制备
<ol>
	<li>使用电子拉制仪将数根洁净的硼硅酸盐玻璃毛细管拉成两半，调整拉制仪参数，使拉制后毛细管拉伸部分长度约为 1 cm，且两半大致对称。确保拉制后的锥形部分尺寸与图1一致。将两半均用于制作微移液管、固定器和阻断器。
	<ol>
		<li>使用气动驱动的研磨轮30，配合浸水的 0.5 µm 研磨纸对微移液管进行斜面打磨。调整微移液管夹持器的角度，使其与水平方向成约 30 度。</li>
		<li>通过抽吸使洁净的丙酮从尖端流经杆部，彻底清洗并干燥微移液管。使用带有鳄鱼夹式微移液管夹持器和目镜测微尺的小型直立显微镜，配备 4× 和 40× 物镜，检查微移液管（图1A）。</li>
		<li>选择尖端开口长约 50 µm、斜面长度与宽度比在 3.1 至 3.5 之间、且具有锐利锥形尖端的微移液管，此类尖端有助于穿透肠系膜中坚韧的胶原纤维。</li>
		<li>将 15–20 根尺寸略有差异的微移液管存放于无尘盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用步骤 1.1 中制备的拉制毛细管制作固定器。将拉制后的玻璃毛细管短暂靠近微火焰，形成钝端（图1B）。制备数根并存放于无尘盒中。</li>
	<li>使用步骤 1.1 中制备的拉制毛细管制作微阻断器。将拉制毛细管置于微火焰下，用导管适配器（例如，23G）在距尖端约 4 mm 处轻轻弯曲细尖，使其与杆部形成接近 120 度的夹角（图1C）。制备多根并妥善保存。</li>
</ol>
2. 动物准备与手术
<ol>
	<li>通过皮下注射戊巴比妥钠（80-100 mg/kg，Sigma-Aldrich，P3761）对雄性（350-450 g）或雌性Sprague-Dawley大鼠（200-300 g）进行麻醉；避免使用腹腔注射，以保护肠系膜。</li>
	<li>在整个手术过程和实验操作期间，根据需要通过补充注射（30 mg/kg）维持麻醉深度。通过夹趾反应或角膜反射判断麻醉深度。实验结束后，在麻醉状态下通过过量戊巴比妥或经心内注射饱和氯化钾处死大鼠。</li>
</ol>
3. 准备用作流体标记物的溶液和红细胞
<ol>
	<li>准备用于灌流液和对照灌流液的哺乳动物林格氏液（通常为含有 10 mg/ml 无脂肪酸牛血清白蛋白 BSA 的哺乳动物林格氏液&#160;）。
	<ol>
		<li>使用 0.2 µm 注射器滤器过滤灌流液，以去除可能堵塞微电极尖端的微小颗粒；将滤液收集至小型洁净容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过使用含 0.05 ml 肝素（1,000 U/ml）的小型注射器从麻醉大鼠尾静脉抽取约 0.2 ml 血液来制备红细胞，并转移至含有约 14 mL 哺乳动物林格氏液&#160;的 15 ml 离心管中。
	<ol>
		<li>离心以轻柔沉淀红细胞（约最大 200 × g，7 分钟）。吸除上清液，并将红细胞重新悬浮于林格氏液中。</li>
		<li>离心并去除上清液三次后，将压积红细胞留在管底以供后续使用。需注意，此步骤可使最终灌流液中的血小板含量降至正常水平的 0.1% 以下31。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将组织放置在动物托盘上
<ol>
	<li>剃除麻醉大鼠从脐部至剑突下方的腹部毛发。确保剃毛区域延伸至右侧（大鼠置于右侧时），以防毛发形成灯芯效应将灌流液从组织槽中吸出。使用湿润的纱布垫或纸巾清除剪下的毛发。
	<ol>
		<li>用钝齿镊夹住皮肤，使用坚固的剪刀沿中线做一2-3 cm长的皮肤切口。随后用精细剪刀（虹膜剪）沿白线做类似切口，用齿镊提起腹壁，避免损伤肠道。</li>
		<li>将动物侧置于动物托盘上，用浸有林格液的棉签（木棒）和钝齿镊子轻轻将肠道从腹腔中拉出。将肠道放置于组织小室中，使肠系膜自然垂过支柱，以便通过显微镜观察，注意避免镊子或棉签接触肠系膜（以防损伤微血管）。 
		注意：动物托盘（图2A）可由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成，需包含一个组织槽（深度约3 mm）和一个光学透明的支柱（例如，抛光石英柱，直径约2 cm，高5 mm），以及用于维持动物体温的加热垫。柱体厚度不得超过物镜的工作距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物载物台置于显微镜载物台上，使肠系膜通过目镜可见。</li>
	<li>将重力滴注管路置于肠系膜上方，持续灌流温度维持在35–37 °C的哺乳动物林格液。使用纱布垫固定肠道位置，帮助保持湿润，并吸除多余的林格液&#160;从表面移除。调节流速并吸出流出液，以保持灌流液层厚度一致。</li>
	<li>识别目标微静脉血管，即汇流下游、位于真毛细血管远端一到两个分支处的无分支节段。选择一段无分支的血管（理想长度为600至1,000 µm），血流较快，且血管壁上无白细胞黏附。</li>
	<li>将测试微血管置于显微镜视野中央，并将固定器移至选定插管部位附近的位置。</li>
</ol>
5. 填充微量移液器并安装至移液器架
<ol>
	<li>插管前立即用灌流液重悬红细胞。在洁净的硼硅酸盐试管中，将7 µl压积红细胞加入0.5 ml灌流液中。注意：可使用1–3%的红细胞压积，但保持一致的红细胞压积有助于确保红细胞释放的任何物质在灌流液中的浓度一致。</li>
	<li>将1 ml注射器连接23G管路接头和PE 50导管（长度5–15 cm）。将灌流液与红细胞的混合液吸入注射器中。倒置注射器以充分混匀，并排出导管和接头中的所有气泡。为提高效率，可在实验开始前将导管连接至多个注射器，并将其存放于无尘盒或塑料袋中。</li>
	<li>将导管向前推进至微管的粗端，直至接触锥形区域，以填充微管。轻轻快速推动注射器活塞，使微管尖端充满液体。注意：尖端应可见微小液流或液滴，以确认已完全填充。</li>
	<li>在缓慢推动活塞的同时撤回导管，以填充微管杆部较宽的部分。通过轻弹微管杆部小心去除宽部中的小气泡。注意：类似操作流程已有图示说明32。</li>
	<li>将微管插入带有侧端口的微管固定器中，该端口可实现与水压计的持续液体连接。确保固定器（连接至用于精确控制微管推进的液压驱动装置）与水平面呈轻微角度（15–25°），以避免微管锥形边缘接触肠组织或托盘。</li>
	<li>将液压驱动装置安装在可移动的显微操作器上，该操作器具备x、y和z方向驱动功能，以便精确对准测试血管（图2）。</li>
	<li>通过注射器或注水橡胶球调节施加于微管内液体的静水压，使压力计水柱液面高度比肠系膜位置高出约40 cmH2O。</li>
	<li>填充微管后应尽快进行微血管插管；红细胞会逐渐沉降至微管底部，因此约40分钟后进入血管的红细胞将显著减少。</li>
</ol>
6. 微套管插入与微血管压力测量
<ol>
	<li>在将装液的微移液管置于显微镜下之前，轻轻将固定器压在靠近微血管的组织上，施加足够的力以夹住组织。向后拉动固定器，轻微拉伸与微血管方向一致的组织，使肠系膜胶原纤维的应力与血管方向对齐。
	<ol>
		<li>将微移液管与血管对齐，并通过目镜将其缓慢下移至视野中。将移液管尖端置于选定插管位置的上游稍远处，然后将其轻轻压在组织上，使其部分阻碍血管内的血流，但不完全阻断血流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用液压驱动装置缓慢将移液管尖端插入血管腔内，完成血管插管。注意不要穿透血管的底部。
	 
	注意：当微移液管进入血管腔时，灌流液会迅速将血管内的血液冲洗出管腔，灌流液自由流入测试微血管远端的动物循环系统，从而取代下游血管中部分正常的血液灌注。</li>
	<li>通过调节压力计降低灌注压力，直至血液（以动物的红细胞为标志）被重新吸入已灌注的血管段；此时红细胞在血管腔内轻微振荡，该压力即为平衡压力，可测定微血管段远端的静水压（Pc）。在所有高于此平衡压力的条件下，均应维持血管的灌注状态。</li>
</ol>
7. 微闭塞与数据采集
<ol>
	<li>可选步骤：在使用微阻断器阻断血管之前，先将其压入肠系膜中远离任何血管的非使用区域组织内，使尖端附着一层细小的组织垫，以在重复进行微阻断时保护实验血管。</li>
	<li>将阻断器放置在显微镜视野下边缘附近已灌注血管的上方。</li>
	<li>用视频和音频记录以下内容：
	<ol>
		<li>口头记录阻断位置以及目镜测微尺上所见的屏幕下边缘位置。</li>
		<li>将阻断器尖端置于微血管正上方，使用显微操作仪的精细Z轴控制装置轻轻下压阻断器，直至血管内血流被阻断。在音频中记录压力计压力（Pc）。通常阻断持续3-10秒，然后释放，恢复自由灌注。根据时间（在某一位置首次阻断后&#62;5分钟）、阻断次数（3-5次）等因素，沿血管向上游方向逐次移动阻断位置，每次移动5-10 µm，以防止阻断部位血管壁受损。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析与Lp（水渗透性）的测定
<ol>
	<li>视频播放过程中，利用载物台测微尺的图像及图像上已知的位置，确定标记红细胞到阻塞部位的初始距离（ℓ0）；根据记录图像中连续几帧画面内标记细胞的位置变化，测定其初始速度（dℓ/dt），时间范围为3–10秒；根据阻塞期间采集的图像测定血管半径（r）（图3）。</li>
	<li>将每次阻塞的Jv/S计算为（dℓ/dt）×(1/ℓ0)×(r/2)；在恒定压力下，将Lp计算为（Jv/S）除以驱动压力（微血管压力－有效胶体渗透压；参见讨论部分）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Lp 计算的详细说明。尽管血管壁液体交换发生在血管自由灌流过程中，但由于其交换量通常小于血管灌流速率的 0.01%，在自由灌流期间难以直接测量。然而，当通过阻断微血管暂时停止灌流时，可测量跨血管流动（即，滤过），此时腔内标记红细胞发生移动，标记红细胞与阻塞部位之间的液柱缩短，如图3所示。根据实验方案的复杂程度和持续时间，需要一段无分支的血管，长度为 600 至 1,000 µm。
当血管未被阻塞且压力计压力驱动液体流经微血管时，移液管尖端的压力降较大，因此自由灌流期间微血管内的压力通常仅比下游压力高几厘米水柱（cmH2O）。相反，在阻塞期间，由于液体缓慢进入血管腔以补充经血管壁滤出的液体，移液管尖端的压力降非常小。因此，在阻塞期间，血管腔内的静水压（Pc）等于压力计设定的压力。肠系膜组织中的胶体渗透压可忽略不计，因此在阻塞后立即测量标记红细胞的跨血管液体运动，此时静水压已知，且血管腔内的胶体渗透压等于灌注液中设定...

在血管系统中进行微灌流，是指通过微移液管将成分已知的人工灌流液以可控流速引入直径通常小于40 µm的血管内。被灌流的血管仍保留在其正常的组织环境中，并在插管前持续由动物自身的血液进行灌注。当与多种视频成像或荧光测定技术结合使用时，在体微灌流技术能够在已知驱动这些流动的作用力条件下，直接评估微血管壁的通透性特性，并测量水和溶质跨微血管壁的流动。此外，通过精确控制组织中微血管周围液体（灌流液和上灌流液）的成分，可使构成微血管壁的内皮细胞暴露于多种实验条件（如激动剂、改变的灌流条件、用于检测细胞内成分和信号传导的荧光指示剂）下，并维持精确设定的时间（数秒至数小时），从而研究微血管通透性与物质交换的调控机制。同时，还可以在通透性被直接测定的同一微血管中，对调控屏障功能的关键细胞分子结构进行超微结构或细胞化学分析。该方法因此在培养的内皮细胞单层中研究细胞与分子机制改变内皮屏障功能，以及在完整微血管中开展研究之间建立了桥梁。有关进一步评述，请参见以下文献1-6。
微灌流技术的一个局限性在于，它只能用于那些较薄、透明且具有足够结构完整性的微血管床，以便用玻璃微移液管进行插管。早期研究采用青蛙的肠系膜和薄的胸皮肌微血管7,8，但迄今为止在哺乳动物模型中最常用的制备方法是大鼠肠系膜9-15。大多数研究集中于在1-4小时的时间段内观察血管通透性的急性变化，但最近的一些研究已扩展到初次灌流后24-72小时对单个血管进行测量12,16。近年来发展的CRISPR技术有望提供更多可用于研究血管通透性调控的基因修饰大鼠模型17，这将使本文所述方法能够应用于这些重要新型大鼠模型肠系膜微静脉血管中。
该方法需要配备倒置显微镜，显微镜载物台上需定制一个足够大的平台，以同时容纳动物标本和至少三个显微操作器，用于将微工具定位至灌注血管附近，并将灌注微移液管与血管腔对齐。例如，可使用一块约1厘米厚、带有防锈涂层的钢板制作一个适用于显微镜x-y方向移动载物台的定制平台（尺寸约为90 × 60厘米）。该平台连接至工程用分度台，或由两个呈直角安装的燕尾滑轨组成，并通过聚四氟乙烯支柱或滚珠传送装置支撑，以实现水平面内的移动。典型的实验装置（见图2）与用于多种活体微循环实验的显微镜及微定位设备有许多共通之处，例如用于测量单根血管血流和红细胞压积、血液灌注微血管局部供氧、血管平滑肌张力调节，以及全身循环注射荧光示踪剂后其在局部微血管中的积聚等实验18-26。
该技术的核心是测量通过微血管壁特定表面积（S）的体积流量（Jv）。通过本文所述的改良Landis技术实现该测量时，使用一台简单的倒置显微镜即可。将小型摄像机安装在成像端口上，视频信号经添加时间基准后显示在视频监视器上，并以数字形式记录在计算机中，或以数字或模拟信号记录在视频录像机上。一旦完成微血管插管，可通过整体移动载物台和操纵器来改变摄像机可见的微血管部位，而不会破坏插管状态。
跨血管流动的测量还可与更精细的研究相结合，使用配备适当滤光片的复杂荧光显微镜，例如用于测定溶质通透性、细胞质钙或其他细胞机制的荧光比率监测，以及共聚焦成像6,12,13,27。所有微灌注方法的一个关键优势在于能够在同一血管上，在可控的驱动力（如静水压和胶体渗透压）变化条件下，或在诱导血管对炎症条件反应改变的情况下，进行重复测量。最常见的实验设计是在同一血管上进行成对比较，即首先使用充满对照灌注液和红细胞悬液的微移液管灌注，以建立基础通透状态下的水力传导率（Lp）测定值，随后更换为另一支含有待测试剂的灌注液微移液管进行第二次测定。在用对照移液管重新灌注后，可重复该循环，实现多次插管操作。
本方案展示了对大鼠肠系膜小静脉进行插管和微灌流，以记录水通过微血管壁的流动，并测量血管壁的Lp值，后者是反映水和溶质穿过完整内皮屏障共同通路渗透性的一个有用指标。该方法被称为改良Landis技术，因为它保留了原始Landis技术的基本原理，即在阻断灌流后利用红细胞相对移动来评估血管内外液体交换28；但与未插管、以血液灌流的微血管相比，微灌流后可调控的实验条件范围（例如，微血管壁两侧的静水压和白蛋白胶体渗透压差）要大得多8,29。

<table><tbody><tr><td>显微镜、载物台和样品台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜（金相型），带三目镜筒用于视频：示例</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>尽量将目镜的位置调至高于载物台——在操作时，您需要在绕过中间的显微操作器并伸手到达载物台顶部的同时，通过目镜进行观察</td></tr><tr><td>倒置显微镜（金相型），带三目镜筒用于视频：示例</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>尽量将目镜的位置调至高于载物台——在操作时，您需要在绕过中间的显微操作器并伸手到达载物台顶部的同时，通过目镜进行观察。</td></tr><tr><td>小直径长工作距离物镜：示例</td><td>尼康</td><td>尼康 E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>载物台——1/2英寸或1厘米厚钢板</td><td>焊接车间</td><td></td><td>这应较重，以减少振动</td></tr><tr><td>Unislide x-y 平台：燕尾滑轨</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>视频</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD摄像机：示例</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN（已不再提供）</td><td>无需染色</td></tr><tr><td>带音频的通用视频采集系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>视频播放系统（完全静止帧、单帧播放）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型麦克风</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器，持针器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪，XYZ（3）</td><td>之前的/Stoelting（已不再提供）</td><td></td><td>寻找精细的Z轴调节，并在粗调驱动中提供更大的行程范围，以方便定位</td></tr><tr><td>单向液压探针驱动器</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>需要购买手动驱动装置或电子驱动装置</td></tr><tr><td>手动滚筒驱动&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>或液压驱动，三通</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610（单通道）或 MX630（三通道）</td><td>非常适合手臂较短者，水填充式，约每两年需寄回补充填充</td></tr><tr><td>连接器/杆/支架</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5、MXB 等</td><td></td></tr><tr><td>手摇钻夹头</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>用于固定限制器</td></tr><tr><td>移液器架</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>水压计 ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于动物显微镜载物台的透明有机玻璃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4英寸抛光石英圆盘，高约1/4英寸</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>定制</td><td>&amp;nbsp;（或抛光的有机玻璃、玻璃）；确保其高度小于物镜的工作距离</td></tr><tr><td>Plexiglas 胶水（Weld-on 4：注意 致癌物）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织固定用医用粘合剂</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>通用硅橡胶加热垫，5&quot; L × 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>显微镜载物台加热器——需配电源线和控制器——可提供240V版本</td></tr><tr><td>Kapton 加热器及套件用电源线适配器，6 英尺，120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B 可变电压控制器，10 A；输入 120 V，输出 0–140 V</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>移液器制造</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>垂直式移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 镍铬丝灯丝</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm外径薄壁毛细管</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>移液器研磨器、气石和解剖显微镜——参见文中参考文献</td><td></td><td></td><td>或从 Sutter Instruments 或 World Precision Instruments 购买套装</td></tr><tr><td>RX珩磨机，System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II 机器</td><td>气石的替代品，可与倾斜安装的解剖显微镜配合使用</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 带陶瓷磨削盘</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>使用 &quot;如前所述&quot; 或附上研磨膜</td></tr><tr><td>0.3 或 0.5 微米的抛光膜片</td><td>3M</td><td>货号 051144 80827</td><td>268X 帝国研磨膜片，带背胶——可从亚马逊购买</td></tr></tbody></table>

微灌流技术用于研究大鼠肠系膜微血管通透性的调控机制

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

对单个灌注微血管进行通透性测定的实验，为研究培养的内皮细胞单层中调控血管通透性的分子与细胞机制，以及整体微血管床的功能交换特性之间提供了桥梁。本文描述了一种用于插管并灌注大鼠肠系膜小静脉微血管，并测定其管壁液压传导率的方法。所需主要设备包括一台带有大型改装载物台的活体显微镜，该载物台可支撑微操作器以定位三种不同的微工具：（1）斜面玻璃微移液管，用于插管并灌注微血管；（2）玻璃微阻断器，用于瞬时阻断灌注，从而在已知静水压力下测量跨血管的水流动；（3）钝头玻璃棒，用于在插管部位稳定肠系膜组织。改进的Landis微阻断技术利用人工灌注液中悬浮的红细胞作为跨血管液体运动的标记物，同时可在实验条件改变时重复测量这些流动，并精确控制微血管两侧的静水压和胶体渗透压差。在严格控制的条件下，首先使用对照灌注液测量液压传导率，随后对同一微血管重新插管并更换测试灌注液，从而实现对微血管反应的配对比较。尽管曾尝试将该方法扩展至具有遗传修饰（预期可改变血管通透性）的小鼠肠系膜微血管，但由于小鼠肠系膜中缺乏长而直且无分支的微血管，该尝试受到严重限制；然而，近年来利用CRISPR/Cas9技术构建的具有类似遗传修饰的大鼠模型的出现，有望为应用本文所述方法开辟新的研究领域。

图4展示了在大鼠小静脉微血管中连续灌注四种灌流液后，Lp随时间变化过程的测量结果33。在恒定压力下计算得到的Lp值被用作微血管壁通透性变化的指标：首先在对照状态下使用含1%牛血清白蛋白的灌流液进行测量，随后通过第二个微移液管引入含10 nM缓激肽（Bk）的炎症刺激剂。缓激肽引起Lp短暂升高，随后在接下来的10–15分钟内逐渐恢复至对照水平。之后，微血管再用对照灌流液灌注30分钟，以重建稳定的基线。当使用第四个微移液管将相同浓度的Bk与1 µM鞘氨醇-1-磷酸（S1P）共同灌注至微血管时，Bk引起的反应显著减弱。同时灌注Bk和S1P所导致的抑制程度，与其他实验中在暴露于Bk前最多20分钟预先加入S1P的结果相似。这些结果表明，能够在单个血管上多次测量Lp的强大优势，并显示了诸如S1P这类物质在炎症刺激存在下稳定血管壁的作用，其效应可在数秒量级的时间尺度上被解析。在另外的血管中，采用相似方案但不添加S1P进行对照研究，以证明Bk反应的减弱并非由过敏反应所致。
<p class="jove_c...

改良的Landis技术能够利用微灌注技术，在对照和实验条件下，对正常大鼠和基因修饰大鼠肠系膜中单个微血管的水力电导率进行配对测量。该方法为评估在生理条件下调控微血管通透性和跨血管交换的机制提供了一种便捷的手段。

用于测量单个灌注微血管通透性特性的实验，为分子与细胞水平的研究之间架起了桥梁……

以下实验的总体目标是在可控的实验条件下，实现对大鼠肠系膜中微血管壁液压传导率或水渗透性的重复测量。通过插管微血管，可设定管腔内的胶体渗透压和静水压，并精确控制灌注液的化学成分。接着，阻塞血管，并在灌注液中悬浮红细胞，这些红细胞可作为流动示踪剂，在管腔内移动，用以指示跨血管的液体交换情况。然后记录标记红细胞向阻塞部位或远离阻塞部位的运动位置和速度。最后，解除阻塞，可重复进行额外测量，或对血管重新插管，并在改变实验条件后重复测量。最终，通过在对照条件和测试条件下对水传导率进行配对测量，可最直接地研究调控微血管通透性的各种因素。改良兰迪斯技术在研究毛细血管通透性调控方面的一个优势在于灌流步骤。微灌流使得微血管壁通透性能够在灌流液成分、交换表面积以及微血管压力均得到直接控制的条件下进行测定。该方法可用于研究具有完整器官代表性的微血管中通透性调控的细胞与分子机制，并可将结果与培养的内皮单层细胞进行比较，后者常被用于深入探究分子机制的细节。本次演示本实验方案的是我们的实验室主管乔伊斯·克拉克（Joyce Clark）。在担任实验室主管期间，她对本实验方案的诸多改进做出了重要贡献。首先，使用电子拉制仪将数根洁净的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成锥形的两半，每根毛细管尖端长度约为1厘米，使用气动驱动的研磨轮和浸在水中的0.5微米粒径砂纸，并将微移液管固定器设置为与水平面成30度角进行研磨，制备微移液管。根据文本方案清洗并干燥微移液管后，选择开口长度约为50微米、斜面长度与宽度比在3.1至3.5之间的微移液管。其尖端应具有明显的锥形结构，有助于穿透肠系膜中坚韧的胶原纤维。制作限制器时，将一根无斜面的拉制玻璃毛细管短暂地靠近微小火焰，以形成钝端。重复此操作以制备多个限制器，并将其存放于无尘盒中。随后制作微堵塞器：将一根无斜面的拉制毛细管在微小火焰下倾斜持握，使用管接头或断裂的微量移液器，在距离尖端约四毫米处将其轻轻弯曲，弯曲角度接近120度。关于玻璃管尖端，需要注意的是既不能在火焰中封口，也不能将其折断。将大鼠麻醉后，按照文本方案中的说明放置肠系膜组织和肠道，然后将动物载物台置于显微镜载物台上，使肠系膜可通过目镜观察到。连接重力滴注的哺乳动物林格氏液管路，以持续灌流组织表面。然后使用纱布垫固定肠道位置，帮助保持湿润并吸除表面多余的林格液，调节灌流速度并吸出流出液，以维持一层恒定的灌流液。识别目标小静脉微血管，这些是位于汇合血流下游、且在真毛细血管远端一到两个分支处的无分支节段。选择一段血流迅速且血管壁上无白细胞黏附的无分支血管。将待测微血管置于显微镜视野中央，并将固定器移至选定的插管部位附近。为填充微量移液器，根据文本方案将灌注液吸入并冲洗红细胞进入已准备好的注射器，确保管路中无气泡。将管路推进微量移液器的粗端，直至抵住锥形区域。轻轻快速推动注射器活塞，使微量移液器尖端充满液体。当吸满时，尖端会出现细小的液流或液滴。撤出导管时，轻轻推动推杆以充满微量移液器杆部。接着，轻轻弹击杆部以除去其中的小气泡。然后将微量移液器插入带有侧孔的移液器架中，侧孔可使其与水压计保持持续的液体连通。确保固定架（连接至液压驱动装置和显微操作器）处于轻微的水平角度，以避免微量移液器锥形末端边缘触碰到肠组织或托盘。使用注射器或充满水的橡胶吸头，通过调节水压计水柱中液面高度，使施加在微量移液器内液体上的静水压约为高于肠系膜 40 厘米水柱。在将装液的微移液管置于显微镜下之前，轻轻将固定器压在微血管附近的组织上，施加足够的压力以夹住组织，然后将固定器略微向后拉动，沿微血管方向拉伸组织，使肠系膜胶原纤维的应力方向与血管一致。将微移液管与血管对齐，并通过目镜将其缓慢下移至视野中。将移液管尖端置于选定套管位置的上游稍远处，再将其轻轻下放至组织上，使其部分阻碍血管内的血流，但不完全阻断血流。使用液压驱动装置，通过缓慢推动移液管尖端进入血管腔来插管，注意不要将尖端推过血管的另一侧。当微移液管进入血管腔时，灌注液会迅速将血液冲洗出血管腔并进入循环系统。通过调节压力计降低灌注压力，直至红细胞在血管腔内轻微振荡。这用于确定平衡压力，即测量微血管段远端的静水微血管压力或PC。为进行微阻塞，需保持血管灌注压力高于此平衡压力。利用视频和音频，将阻断器放置在灌注血管上方、靠近显微镜视野下缘的位置。口述记录在 I 型红细胞中观察到的阻断部位位置。阻断部位位于第 57 位，将阻断器的尖端置于微血管上方。使用显微操作仪的精细 Z 轴控制，轻轻降低阻断器，直至血管内的血流被完全阻断。使用音频记录压力计的压力。压力为50。然后闭塞3到10秒，随后释放。为了恢复自由灌流，将阻塞位点沿血管向移液管尖端方向每次移动5到10微米，在每个位置进行不超过3到5次的阻塞，以防止阻塞部位的血管壁受损。根据文本方案分析数据。该时间过程测量水力电导率或LP的变化。在大鼠的微血管中，成功插管并使用四种灌流液进行灌注。在恒定压力下，利用水力传导率（LP）的大小来测量微血管的变化。在以1% BSA作为对照与以10摩尔的炎症因子缓激肽（Brady Kinin，简称BK）进行灌注时的管壁通透性对比表明，如图所示，BK引起LP短暂升高，随后在10至15分钟内恢复至对照水平。用1% BSA重新建立基线水平后，加入10纳摩尔的缓激肽（BK），同时再灌注1微摩尔的pH敏感型磷酸盐或S1P。结果表明，S1P显著减弱了对BK的反应。在某些实验设计中，估算大分子的溶质反射系数以及lp值均十分重要。通过在每条单个微血管上测量多个压力下的 JV，可最佳实现此目的。本实验估算了 PERFUSE 八中 5% 白蛋白的有效胶体渗透压和 LP，当时微血管周围组织中无白蛋白。在三种不同压力下测量了 JV 与 S 的比值，并在此处绘制成图。液压传导率（LP）是液体滤过速率（JV）与有效滤过压（S）之比关系的斜率，其在压力轴上的截距即为血管壁两侧的有效胶体渗透压差。当结合其他技术（如免疫荧光标记与共聚焦显微镜，甚至透射电子显微镜）使用时，微血管灌流技术可对已知通透性的血管进行微血管内皮结构与功能的有力分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在受控实验条件下，对大鼠肠系膜微血管的液压传导率或水通透性进行重复测量。您可以在目前可用的大鼠模型中使用这种方法，但我特别感兴趣的是，它或许能够应用于即将通过CRISPR Cas9技术问世的新型基因修饰大鼠，我希望这种方法能以此方式得到拓展。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微灌技术在调查微血管渗透性的大鼠肠系膜条例

用于研究以下两方面的正常成年哺乳动物血管化组织：该组织不具有生理性血管生成，且未接受过外科干预；（i）在腹腔内给予试验物质后，血管生成的启动与发展过程；（ii）在系统性给予选定试验物质后，对血管生成的调控作用。...

大鼠肠系膜血管生成实验

本文介绍了一种用于刺激大鼠肠系膜血管生成的简单模型。该模型可在相对较短的时间内显著促进毛细血管出芽、增加血管面积和血管密度，且所用组织可实现整个微血管网络的正面对观察，观察精度可达单细胞水平。...

大鼠肠系膜外翻：研究血管生成过程中细胞动态变化的模型

压力肌动描记法用于评估小动脉在加压时产生持续性收缩的血管活性。本文提供了一项详细方案，用于评估从大鼠分离的小肠系膜动脉节段的血管活性，以及管腔内压力对血管直径的影响。...

利用压力肌动图评估肠系膜阻力动脉的肌源性反应和血管活性

离体血液灌注肺制备方法使得肺表面微血管网络的可视化成为可能。本文介绍了一种利用实时荧光成像技术定量分析离体肺中单个微血管通透性的方法。...

在离体血液灌注大鼠肺模型中定量单个微血管通透性

这种简化的小鼠肠系膜静脉活体显微成像方法可用于多种炎症模型，以观察白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。...

小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮及血小板-白细胞相互作用的活体显微成像

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一个 离体 延时成像培养大鼠肠系膜微血管网络的方法

利用大鼠离体阻力动脉视频显微技术评估血管调控机制

在本实验方案中，通过向测试动物模型的面静脉注射不同分子量的荧光示踪剂，评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。 体内...

体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

本方案介绍了一种通过活体显微镜诱导肠系膜缺血-再灌注损伤并可视化观察肠系膜微静脉中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。通过阻断肠系膜上动脉血流1小时后进行再灌注，可直接定量分析白细胞黏附和NETosis过程。...

通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

本视频展示了胎儿胸腺的解剖与摘除，以及经2-dGuo处理的胸腺体外培养的制备过程。...

2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

学习使用改良Landis技术测量大鼠肠系膜微血管水力传导率的方法。该技术通过控制灌注压力和红细胞标记物，实现微血管渗透性的重复测量，为研究血管通透性的细胞和分子机制提供精确数据。

微灌流技术用于研究大鼠肠系膜微血管通透性的调控机制

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