Name: VDJ-SEQ:重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析，以揭示的B细胞淋巴瘤克隆演变模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: 学习使用VDJ-SEQ深度测序技术分析B细胞淋巴瘤的免疫球蛋白重链基因重排，揭示复发肿瘤的克隆演化模式。该方法为理解肿瘤异质性和治疗策略提供重要依据。

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作者谨感谢Rita Shaknovich博士以及Elemento实验室、Melnick实验室和Tam实验室成员的深入讨论。我们还要感谢威尔康奈尔医学院基因组资源核心设施完成VDJ测序工作。YJ获得了美国血液学会（ASH）学者奖的支持。WT和OE获得了威尔康奈尔癌症中心试点项目基金的支持。OE还获得了美国国家科学基金会（NSF）职业奖、斯塔癌症联合会以及希尔施尔信托基金的支持。我们还要感谢Katherine Benesch（法律博士，公共卫生硕士）对本项目的大力支持。

1. VDJ 扩增
1.1）从肿瘤样本中提取DNA
<ol>
	<li>从冷冻的O.C.T.包埋正常或恶性组织的薄切片（10–20 µm）中提取DNA。
	<ol>
		<li>在15 ml离心管中，将恒冷切片机切取的10–30片包埋组织薄切片加入4 ml核酸裂解缓冲液（0.0075 M Tris HCl，pH 8.2；0.3 M NaCl；0.002 M Na2EDTA），并加入蛋白酶K（终浓度0.5 mg/ml）和0.625% SDS，在37 °C水浴中过夜消化。</li>
		<li>向消化液中加入1 ml饱和NaCl溶液（5 M），剧烈振荡15秒。</li>
		<li>在室温下以1,100 × g离心15分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的15 ml离心管中，加入两倍体积的100%乙醇。</li>
		<li>通过反复倒置试管6–8次混匀，然后在4 °C下以5,000 × g离心60分钟，以收集沉淀的DNA。</li>
		<li>用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，每次在室温下以5,000 × g离心15分钟，收集沉淀。</li>
		<li>将DNA溶解于100–400 µl TE缓冲液中，在摇床上室温过夜。DNA得率为5至200 µg（终浓度为50–500 ng/µl），具体取决于组织大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的正常或恶性组织薄切片（10–20 µm）中提取DNA。
	<ol>
		<li>在1.5 ml微量离心管中，用1 ml二甲苯在室温下孵育石蜡切片两次，每次10分钟，以脱蜡。在室温下以13,000 × g离心5分钟，收集组织沉淀。</li>
		<li>在室温下用1 ml 100%乙醇孵育切片两次，每次10分钟，以去除残留的二甲苯。每次孵育后在室温下以13,000 × g离心5分钟，收集组织沉淀。此时石蜡已完全溶解，仅剩组织切片。</li>
		<li>在室温下将切片空气干燥10–15分钟。</li>
		<li>用1× PCR缓冲液（用无核酸酶水将10× PCR缓冲液稀释而成）配制0.5 mg/ml的蛋白酶K溶液。将蛋白酶K溶液以终体积50–100 µl加入样品中，在37 °C过夜孵育。</li>
		<li>将样品在95 °C加热10分钟以灭活蛋白酶K。 
		注意：此步骤后，样品中的DNA已溶解于PCR缓冲液中，可直接用于步骤1.2和1.3。DNA得率为0.5至20 µg（终浓度为10–200 ng/µl），具体取决于组织大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
1.2）DNA 质量评估
<ol>
	<li>将0.25 µl Taq DNA聚合酶与45 µl商用ladder试剂盒中的混合液在PCR管中混合。</li>
	<li>将5 µl来自1.1.1.7或1.1.2.5制备的DNA加入PCR管中，用移液器上下吹打至少5次，充分混匀。</li>
	<li>使用以下条件扩增DNA：95 °C 预变性7 min；随后进行35个循环，每个循环包括95 °C 变性45 sec、60 °C 退火45 sec、72 °C 延伸90 sec；然后72 °C 最终延伸10 min，最后置于15 °C 保存。</li>
	<li>用TBE（Tris/硼酸/EDTA）配制2%琼脂糖凝胶。</li>
	<li>将20 µl PCR反应产物与4 µl 6x上样缓冲液混合，加样至2%琼脂糖凝胶中。</li>
	<li>用0.5 µg/ml溴化乙锭溶液染色琼脂糖凝胶，并使用凝胶成像系统检测PCR产物。注意：若样本产生大小分别为100、200、300、400和600 bp的5条PCR产物，则继续用于生成VDJ扩增子。 
	警告：溴化乙锭是一种强效诱变剂。请佩戴防护装备，极其小心地操作。 即 手套，并根据机构指南处置于特定容器中。</li>
</ol>
1.3）VDJ PCR
1.3.1）从框架区1（IgVHFR1）扩增重组的IgH VDJ片段
<ol>
	<li>在PCR管中混合45 µl商品化体细胞IGH突变检测试剂盒（凝胶检测型）中标记为“Mix 2”的主混合液、0.25 µl Taq DNA聚合酶以及5 µl来自1.1.1.7或1.1.2.5步骤制备的样本DNA。</li>
	<li>使用以下条件扩增DNA：95 °C预变性7 min；随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性45 sec、60 °C退火45 sec、72 °C延伸90 sec；最后72 °C终延伸10 min，然后置于15 °C保存。</li>
	<li>通过电泳在2%琼脂糖凝胶中分离全部PCR产物。</li>
	<li>用含0.5 µg/ml溴化乙锭溶液染色琼脂糖凝胶，并使用凝胶成像系统检测PCR产物。预期获得大小在310–380 bp范围内的单克隆扩增片段。</li>
	<li>切下含有310–380 bp单克隆扩增片段的凝胶区域。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用标准凝胶回收试剂盒从切下的凝胶中纯化DNA。注意：对于能够获得FR1片段的样本，无需再扩增IgVHFR2和IgVHFR3片段。</li>
</ol>
1.3.2）从框架区2（IgVHFR2）扩增重组的IgH VDJ片段
<ol>
	<li>在PCR管中加入45 µl商品化IGH基因克隆性检测试剂盒（凝胶检测型）中标记为“Tube B”的管内的主混合液、0.25 µl Taq DNA聚合酶，以及5 µl来自1.1.1.7或1.1.2.5步骤制备的样本DNA。</li>
	<li>使用以下条件扩增DNA：95 °C预变性7分钟；随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性45秒、60 °C退火45秒、72 °C延伸90秒；最后72 °C终延伸10分钟，然后置于15 °C保存。</li>
	<li>通过电泳将全部PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行分离。</li>
	<li>使用0.5 µg/ml溴化乙锭染色观察PCR产物。可在250–295 bp大小范围内观察到单克隆扩增片段。</li>
	<li>切下含有250–295 bp单克隆扩增片段的凝胶区域。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用标准凝胶回收试剂盒从切下的凝胶中纯化DNA。</li>
</ol>
1.4）优化 VDJ PCR
<ol>
	<li>使用以下改良的PCR条件，利用次优DNA扩增IgVHFR1和IgVHFR2：95 °C 预变性7分钟，40个循环（95 °C 变性60秒，60 °C 退火60秒，72 °C 延伸90秒），最后在72 °C 延伸10分钟。</li>
</ol>
2. VDJ 扩增子文库制备与测序
2.1）文库构建
2.1.1）末端修复
<ol>
	<li>将1.3中的VDJ PCR产物转移至PCR管中，并加入DNA样本制备试剂盒中的重悬缓冲液，使总体积达到60 µl。</li>
	<li>加入40 µl DNA样本制备试剂盒中的末端修复混合液，并充分混匀。</li>
	<li>将反应体系置于预热至30 °C的PCR仪中（PCR仪盖预热至100 °C），在30 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>在1.5 ml离心管中先混合136 µl磁珠和24 µl PCR级水，然后将2.1.1.3步骤中的全部末端修复反应产物转移至该1.5 ml离心管中，并与磁珠溶液充分混匀。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。吸除上清液，并在保持离心管处于磁力架上的同时，用80%新配制的乙醇洗涤磁珠两次。</li>
	<li>彻底吸除乙醇溶液，将磁珠在室温下空气干燥15分钟。</li>
	<li>将离心管从磁力架上取下，用17.5 µl重悬缓冲液重悬磁珠。</li>
	<li>将离心管再次放回磁力架上静置2分钟，使磁珠与重悬缓冲液分离。将重悬缓冲液（此时末端修复产物已溶于重悬缓冲液中）转移至新的PCR管中。</li>
</ol>
2.1.2）A尾添加
<ol>
	<li>向含有末端修复产物的PCR管中加入12.5 µl A尾添加混合液，并充分混匀。</li>
	<li>将PCR管置于预热至37 °C的PCR仪中（PCR仪盖预热至100 °C），在37 °C下孵育30分钟。</li>
</ol>
2.1.3）接头连接
<ol>
	<li>向A尾反应中加入2.5 µl重悬缓冲液、2.5 µl连接混合液和2.5 µl DNA接头索引。</li>
	<li>将反应体系在预热至30 °C的PCR仪（盖子预热至100 °C）中30 °C孵育30 min。</li>
	<li>向每个反应体系中加入5 µl终止连接缓冲液，并充分混匀。</li>
	<li>加入42.5 µl充分混匀的磁珠，按照步骤2.1.1.5至2.1.1.8进行反应纯化。加入50 µl重悬缓冲液以洗脱接头连接产物。</li>
	<li>使用50 µl充分混匀的AMPure XP磁珠对接头连接产物进行第二次纯化，并将产物洗脱至25 µl重悬缓冲液中，转移至新的PCR管。</li>
</ol>
2.1.4）扩增DNA片段
<ol>
	<li>向含有接头连接产物的PCR管中加入5 µl PCR引物混合液和25 µl PCR预混液，并充分混匀。</li>
	<li>在预先编程的热循环仪中进行扩增，反应条件如下：98 °C 预变性30秒；进行10个循环，每个循环为98 °C 变性10秒、60 °C 退火30秒、72 °C 延伸30秒；然后72 °C 延伸5分钟，最后在10 °C 保存。</li>
	<li>使用50 µl充分混匀的磁珠纯化反应产物，并用30 µl重悬缓冲液洗脱最终产物。</li>
</ol>
2.1.5）文库验证
<ol>
	<li>按照制造商的操作说明，使用荧光计对最终产物进行定量。最终文库浓度在 2.5 至 20 ng/µl 之间。</li>
	<li>按照制造商的操作说明，使用配备高灵敏度 DNA 芯片的分析仪器评估最终产物的质量。预期在 IGVHFR1、IGVHFR2 或 IGVHFR3 中出现一条大小符合预期的单一条带。文库产物的预期大小等于原始 VDJ 扩增子大小加上接头大小（约 125 bp）。</li>
</ol>
2.2）VDJ-PCR 文库合并与测序
<ol>
	<li>使用以下公式计算每个文库组分的摩尔浓度：nM = [(ng/1,000)/bp*660] × 109，其中 ng 为在步骤 2.1.5.1 中测定的 VDJ-PCR 文库浓度，bp 为在步骤 2.1.5.2 中测定的 VDJ-PCR 文库主峰大小。</li>
	<li>用无 DNase 水将文库稀释至 2 nM（总体积 10 µl）。</li>
	<li>将稀释后的 2 nM 文库各 10 µl 混合至一个 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>向该 1.5 ml 离心管中加入等体积的 PhiX spike-in 对照。</li>
	<li>以 7 pM 的浓度将混合文库上样至流动池。</li>
	<li>按照制造商的操作说明，使用双端 150 周期测序仪对文库进行测序。</li>
</ol>
3. 数据分析
注意：本节所用生物信息学脚本的摘要可作为补充代码文件获取。
3.1）序列比对与质量控制
<ol>
	<li>使用基于 NCBI 提供的“blastn”的改进型核苷酸 blast 算法，将成对末端测序读段比对至从 IMGT 网站下载的人类 IGH V、D 和 J 区域数据库11，比对参数设置为：空位开启罚分 2，空位延伸罚分 1，词长 7，e 值阈值 10-4。若读段对未能同时比对到 IGH V 区和 J 区，则予以剔除。</li>
	<li>统计剩余读段对中具有 IGH V 和 J 区比对结果的数据，以获得样本测序运行所得所有读段对中各 VJ 组合的匹配频率。对于同时比对到 IGH V 基因和 J 基因的读段对，计数一次，并将其等位基因加入相应 VJ 组合的计数中。</li>
	<li>将 3.1.2 步骤中获得的每个重排 VDJ 区域的计数按从高到低排序。其中读段数最多的 VDJ 区域被定义为主要重排组合。</li>
	<li>剔除比对序列覆盖度低于 3.1.3 中鉴定的主要重排区域 35% 的序列。</li>
</ol>
3.2）SHM 谱型鉴定
<ol>
	<li>统计步骤 3.1.3 中所有测序读段中的体细胞超突变（SHM）模式。将每种 SHM 模式定义为一个亚克隆。</li>
	<li>统计对应于不同唯一 SHM 模式的亚克隆数量，以及比对到各个亚克隆的读段数量。</li>
</ol>
3.3）结果的图形化表示
<ol>
	<li>根据制造商方案，使用 R 软件包“ape”中的邻接法，基于各亚克隆对应的体细胞高频突变（SHM）模式进行系统发育分析。对每一对配对样本集，基于各个独立的比对序列计算距离矩阵，以重建以相应 VJ 组合种系序列为根的亚克隆系统发育关系。</li>
	<li>将每个亚克隆的核苷酸序列作为字符向量，使用莱文斯坦距离（Levenshtein distance）度量方法，计算诊断样本和相应复发样本中主要 VJ 重排内所有亚克隆之间的近似字符串距离；数学上，两个比对序列之间的距离表示为 dx,y(i,j)，其中当 i ≠ j 时，dx,y(i,j) = 1，否则为 0，然后对该函数在对应核苷酸序列 i 和 j 的字符串长度上求和。</li>
	<li>以以下两种方式图形化展示亚克隆距离矩阵及其对应的亚克隆数量：
	<ol>
		<li>根据制造商方案，使用 R 软件包“MASS”对亚克隆距离矩阵进行多维尺度分析（multidimensional scaling），生成二维主坐标图，并将亚克隆数量的对数值作为圆的半径一同绘制。</li>
		<li>基于莱文斯坦距离构建无向图，其中每个顶点代表来自主要 VJ 重排的一个独特亚克隆。 
		注：若两个不同克隆之间的距离等于 1，则这两个顶点之间存在一条边；若距离大于 1，则两者之间无边连接。</li>
		<li>使用“iGraph” R 软件包中的 tkplot 函数，按照制造商方案采用 Kamada-Kawai 布局绘制 3.3.3.2 中的图。顶点的半径与映射到该顶点的克隆总数的立方根成正比，顶点着色使用红-蓝渐变色表示属于诊断样本（蓝色）或复发样本（红色）的克隆比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.4）异质性（熵）测量
<ol>
	<li>分析每对样本中主要 VJ 重排发生的体细胞超突变各个模式的个体数量及亚克隆计数。</li>
	<li>使用基于标准直方图的熵估计方法，计算每个样本中不同克隆数量校正后的经验熵和残差经验熵。</li>
</ol>

<ol><li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li>
<li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li>
<li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35(2014).</li>
<li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+immunology%22%5BJournal%5D)">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li>
<li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li>
<li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li>
<li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma%3A+clinical+characteristics+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li>
<li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li>
<li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li>
<li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+%3A+methods+for+querying+IMGT+databases%2C+tools%2C+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432(2014).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需披露。

由于人类B细胞IGH基因座上通过VDJ重排和体细胞高频突变（SHM）编码的序列信息具有近乎无限的多样性，通过高通量深度测序来分析整个IGH组库已被证明是描绘克隆及亚克隆B细胞群体的一种高效且全面的方法。此外，通过比较在疾病不同阶段采集的患者样本中克隆和亚克隆结构，该策略还可用于研究B细胞肿瘤发生、缓解及复发过程中的克隆演化路径。尽管使用市售引物从原始样本DNA中扩增重排的VDJ序列在实验室条件下易于实现，但扩增效率在很大程度上依赖于样本DNA的质量。特别是，从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的DNA扩增效率较低，通常只能成功扩增出较小的FR3片段，导致其不适合后续分析。由于本研究旨在了解B细胞淋巴瘤的克隆性——这是一种以一个或多个主要克隆重构整个肿瘤的克隆性疾病——我们仅收集并测序了主要的VDJ-PCR产物。对于希望对例如外周血中全部B细胞克隆群体进行系统分类的研究，可切取凝胶中包含多个VDJ-PCR产物（凝胶上呈现多条带或弥散条带）的更大区域进行测序。然而，需要特别指出的是，由于某些体细胞高频突变可能发生在引物结合区域，从而影响这些VDJ序列的扩增，因此无法完全捕获全部重排的IGH组库。此外，近期已推出一种将IGH重排扩增与...

癌症是一种克隆性疾病。自从30年前Peter C. Nowell提出癌症克隆进化模型1以来，许多研究致力于解析肿瘤样本中的克隆群体，并重建驱动肿瘤发生过程的克隆扩增与进化模式2。近年来，全基因组测序技术使研究人员能够深入探究克隆异质性及其进化过程3,4。然而，由于许多细胞类型缺乏可追踪的标记，推断精确的克隆结构和进化路径仍然困难。幸运的是，在成熟B细胞中存在一种天然的克隆性标记，而包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）在内的许多淋巴系统恶性肿瘤正是起源于此类细胞。在抗原刺激下，每个B细胞可通过从大量可变（VH）、多样性（D）和连接（JH）基因片段中各选择一个进行重排，形成唯一的功能性IgH VDJ序列。在此过程中，原始序列的部分区域可能被删除，同时可能插入非模板依赖的核苷酸，从而产生独特的VDJ重排。这种特异性的VDJ重排可在该B细胞的所有子代细胞中遗传，因而可标记单个成熟B细胞及其后代5。此外，在随后的生发中心（GC）反应中，体细胞高频突变（SHM）会作用于已重排的VDJ序列，引入额外突变，以扩大抗体库并增强抗体亲和力6。因此，通过比较和分析经历上述过程的淋巴瘤样本中的VDJ重排模式与SHM特征，可以描绘肿瘤内部的异质性，并推断疾病的克隆进化路径。
此前，VDJ重排和体细胞高频突变（SHM）的鉴定依赖于通过PCR扩增重排区域，克隆PCR产物，随后进行Sanger测序以获取序列信息。该方法通量低、产量低，仅能获得整个重排VDJ序列库中极小的一部分，限制了对特定样本中克隆群体整体分布特征的分析。为改进这一局限，研究人员建立了基于VDJ PCR产物构建NGS索引测序文库的方法，并进行双端150 bp（PE 2x150 bp）测序，使每个样本可获得超过五十万个重排的VDJ序列。此外，开发了一套定制化分析流程，用于对测序数据进行质量控制（QC）、比对、筛选VDJ读段，以识别每条读段中的重排事件和体细胞高频突变，并对各样本的克隆结构进行系统发育分析。同时，还建立了一种新方法，用于进一步表征在不同疾病阶段采集样本的克隆演化模式。
我们已将该技术应用于弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的样本。DLBCL是一种侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，高达三分之一的患者会出现频繁复发7。DLBCL的复发通常发生在初诊后的2至3年内，尽管也有部分患者在5年后才复发8。由于治疗选择有限，复发患者的预后较差，仅有10%的患者能够实现3年无进展生存。这正是迫切需要开发新型治疗策略以应对DLBCL复发的基础9,10。然而，与DLBCL复发相关的分子机制在很大程度上仍不清楚。特别是初诊时克隆异质性的作用以及DLBCL复发过程中克隆演化的动态变化目前尚未明确，这使得难以定义一种准确且具有临床价值的生物标志物来预测复发。为回答这些问题，我们对多对配对的初诊-复发DLBCL样本应用了我们的VDJ测序方法。通过比较初诊与复发样本之间的克隆结构，我们发现了两种截然不同的克隆演化模式，提示DLBCL复发可能涉及多种分子机制。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof，分子生物学用</td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&amp;middot;Cl，pH 8.0；10 mM EDTA</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>蛋白酶K&amp;nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>每种核苷酸10 mM</td></tr><tr><td>10x PCR缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>不含MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA聚合酶（含Gold缓冲液和MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 &amp;micro;l，5 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>标本对照大小阶梯</td><td>Invivoscribe Technologies&amp;nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33次反应</td></tr><tr><td>IGH体细胞高突变检测v2.0 - 凝胶检测法</td><td>Invivoscribe Technologies&amp;nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33次反应，用于IGVHFR1检测的混合液2</td></tr><tr><td>IGH基因克隆性检测 - 凝胶检测法</td><td>Invivoscribe Technologies&amp;nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33次反应，用于IGVHFR2检测的B管</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &amp;micro;l，5 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>10X Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA阶梯</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>100 bp DNA阶梯</td><td>Life Technologies</td><td>15628-019</td><td>1 &amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>UltraPure琼脂糖</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick凝胶提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50个柱</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度DNA试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0荧光计</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>重悬缓冲液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>末端修复混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A尾化混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>连接混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>DNA接头索引（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>终止连接缓冲液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR引物混合物（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR主混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示b细胞淋巴瘤的克隆演化模式

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

了解肿瘤克隆性对于理解肿瘤发生及疾病进展的机制至关重要。此外，了解肿瘤在特定微环境或治疗干预下发生的克隆组成变化，可能有助于设计更精细且有效的策略以根除肿瘤细胞。然而，由于缺乏可区分的标记物，追踪肿瘤克隆亚群一直具有挑战性。为解决这一问题，研究人员开发了一种VDJ-seq技术，利用B细胞淋巴瘤所特有的两种特征——VDJ重排和体细胞高频突变（SHM），来追踪弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）复发过程中的克隆演化模式。
在本方案中，从成对的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）初诊与复发样本中扩增的免疫球蛋白重链（IgH）VDJ重排区域构建了具有加索引能力的高通量测序（NGS）文库。测序后每个样本平均获得超过五十万条VDJ序列，这些序列包含VDJ重排及体细胞超突变（SHM）信息。此外，开发了定制化的生物信息学分析流程，以充分利用序列信息对这些样本中的IgH-VDJ组库特征进行表征。该流程还可重建并比较个体肿瘤的克隆结构，从而分析初诊肿瘤内的克隆异质性，并推断初诊与复发肿瘤配对样本之间的克隆演化模式。将此分析应用于多对初诊-复发样本时，我们发现了关键证据，表明多种不同的肿瘤演化模式均可导致DLBCL复发。此外，该方法还可拓展至其他临床应用，如微小残留病灶的检测、复发进程与治疗反应的监测，以及非淋巴瘤背景下免疫组库的研究。

VDJ测序（VDJ-seq）的整体流程，包括DNA提取、重排的VDJ区扩增与纯化、测序文库构建、读段处理以及系统发育分析，如图1所示。通常可从冷冻的实体组织切片中提取5–200 μg DNA，或从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取0.5–20 μg DNA。根据各样本的质量、重排模式及体细胞高频突变（SHM）程度的不同，可获得来自不同样本的多种VDJ PCR产物（图2），包括IGVHFR1（310–380 bp）、FR2（250–295 bp）和FR3（70–120 bp）。若某样本经VDJ PCR仅能获得FR3片段，则因产物过短、无法为后续数据分析提供足够的序列信息而被排除于后续研究之外。仅当样本在琼脂糖凝胶上可观察到主要的FR1或FR2 PCR产物时，才继续用于构建测序文库。经凝胶纯化后，主要PCR产物的总得率范围为10至50 ng。
将全部纯化的PCR产物用于后续的测序文库构建。在接头连接后，每个样本获得其独特的索引序列。在文库扩增过程中，进行10个PCR循环，可产生超过30 ng的最终文库产物。文库质量通...

本方案描述了一种通过深度测序分析淋巴瘤中重排的免疫球蛋白重链VDJ区域的方法，可获取VDJ重排及体细胞高频突变状态，以解析单个肿瘤的克隆结构。通过比较配对的初诊与复发样本之间的克隆结构，揭示淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。

VDJ-Seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示B细胞淋巴瘤的克隆演化模式

理解肿瘤克隆性对于阐明肿瘤发生及疾病进展的相关机制至关重要。此外，理解……

本实验的总体目标是对淋巴瘤样本的克隆组成进行表征，以识别淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。该方法有助于解决淋巴瘤研究领域中的关键问题，例如复发性肿瘤如何起源于原始肿瘤。本方案的主要优势在于采用了最新的高通量测序技术，能够更全面地描绘淋巴瘤的共性特征。本方案中，将从冷冻OCT包埋以及福尔马林固定石蜡包埋的正常或恶性组织的薄切片中提取DNA，以获取冷冻OCT包埋组织中的DNA。首先，在4 mL核酸裂解缓冲液中加入蛋白酶K和0.625% SDS，于37°C水浴中消化10至30片薄切片，过夜。次日，向消化混合物中加入1 mL饱和的5 mol/L氯化钠溶液，剧烈振荡15秒，然后以1,100 × g离心15分钟。在室温下，将上清液转移至新的15毫升离心管中。加入两倍体积的100%乙醇，通过倒置混匀管壁6到8次，然后在4摄氏度下以5,000 × g离心60分钟。为收集沉淀的DNA，用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，每次在5,000 × g下离心15分钟。为收集沉淀，将DNA沉淀在100至400 µL TE缓冲液中于室温下在摇床上溶解过夜，以从福尔马林固定的石蜡包埋组织的薄切片中提取DNA。首先通过将石蜡切片在1 mL二甲苯中于室温孵育两次，每次10分钟，进行脱蜡处理。然后在室温下以13,000 ×g离心5分钟，收集组织切片。接下来，将切片在1 mL 100%乙醇中于室温下孵育两次，每次10分钟，以去除残留的烯烃。在13,000 ×g下离心5分钟，收集组织切片。于室温下将切片空气干燥10至15分钟。在第二天，向样品中加入新配制的蛋白酶K溶液，终体积为50至100微升，在37摄氏度下孵育过夜。将样品在95摄氏度加热10分钟以灭活蛋白酶K。前一节所示提取方法获得的DNA产量为5至200微克，具体产量取决于组织的大小。下一步是在PCR管混合物中评估每个DNA样本的质量。取25微升TDNA聚合酶与45微升商用Ladder试剂盒中的预混液混合。向PCR管中加入5微升DNA，并通过移液器上下吹打至少5次，充分混匀。按照方案文本中详述的条件扩增DNA。随后，将20微升PCR反应产物与4微升6×上样缓冲液混合，加样至2%琼脂糖凝胶中。电泳完成后，用溴化乙锭染色AGROS凝胶，并检测PCR产物。使用凝胶成像系统，仅选择能够产生大小为 100、200、300、400 和 600 个碱基对的五条 PCR 产物的样品用于生成 VDJ 扩增子。本视频将演示从框架区一（I-G-H-V-D-J 区段）或 IGV HFR 一扩增重排的 I-G-H-V-D-J 片段的过程。从框架区二扩增重排的 I-G-H-B-D-J 片段遵循类似的操作步骤，具体方案文本已在 PCR 管混合体系中描述。45 微升标记为“mix two”的商用体细胞 IGH 超突变检测试剂盒（凝胶检测型）中的主混合液，加入 25 微升 TAC DNA 聚合酶和 5 微升样本 DNA，按照方案文本中描述的条件进行 DNA 扩增。若 DNA 扩增效果不理想，可通过延长退火时间或增加扩增循环数来调整 PCR 条件。通过电泳在 2% AGROS 琼脂糖凝胶上分离全部 PCR 产物。使用含 0.5 微克/毫升溴化乙锭溶液的 AGROS 琼脂糖凝胶染色，并检测 PCR 产物。使用凝胶成像系统，预期可观察到大小在 310 至 380 个碱基对范围内的单一条带扩增产物。切下含有该单一条带扩增产物的凝胶区域。随后根据制造商说明书，使用标准凝胶回收试剂盒从切下的凝胶中纯化 DNA。开始此操作时，将纯化的 V-D-J-P-C-R 产物转移至 PCR 管中，并加入 DNA 样本制备试剂盒中的重悬缓冲液，使总体积达到 60 微升。加入 40 微升 DNA 样本制备试剂盒中的末端修复混合液，充分混匀后，在预热至 100 摄氏度的热盖条件下，于 30 摄氏度孵育反应 30 分钟。接着，在 1.5 毫升离心管中混合 136 微升磁珠和 24 微升 PCR 级水，然后将全部末端修复反应液转移至该管中，与磁珠溶液充分混匀。将离心管置于磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。吸除上清液，并用新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。彻底吸除乙醇溶液，将磁珠在室温下静置晾干15分钟。15分钟后，将离心管从磁力架上取下，用17.5 µL重悬缓冲液重悬磁珠。将离心管重新放回磁力架上静置2分钟，使磁珠与重悬缓冲液分离。将含有末端修复产物的重悬缓冲液转移至新的PCR管中。下一步是将 A 尾添加到末端修复产物中。向含有末端修复产物的 PCR 管中加入 12.5 µL 的 A 尾反应混合液，并充分混匀。将 PCR 管置于预热至 37 °C 的热循环仪中，在 100 °C 预热的加热盖条件下孵育 30 分钟。进行接头连接时，向A尾反应中加入2.5 µL重悬缓冲液（Resus suspension buffer）、2.5 µL连接混合液和2.5 µL DNA接头索引。将反应体系在30 °C孵育30分钟，使用预热至100 °C的热循环仪并开启预热盖。30分钟后，向每个反应体系中加入5 µL终止连接缓冲液，并充分混匀。向每个反应中加入 42.5 µL 充分混匀的磁珠，并按前述方法用 80% 乙醇洗涤。加入 50 µL Resus 重悬缓冲液以洗脱接头连接产物。使用 50 µL 充分混匀的 Ampu XP 磁珠对接头连接产物进行第二次纯化，并将产物洗脱至 25 µL Resus 重悬缓冲液中，转入一支洁净的 PCR 管。为了扩增VDJ扩增子，向含有接头连接产物的PCR管中加入5 µL PCR引物混合液和25 µL PCR预混液，充分混匀后，在PCR仪中按照方案文本所述条件进行扩增。扩增完成后，使用50 µL充分混匀的磁珠纯化反应体系，并用30 µL Resus缓冲液洗脱最终产物。随后，按照方案文本所述方法对VDJ扩增子文库进行验证、合并和测序。由于VVG测序文库的复杂性较低，我们建议在已批准的测序样本中添加20%至50%的FI掺入，以实现准确的碱基识别。这些代表性凝胶图像显示了从淋巴瘤患者样本中提取的DNA扩增出的V-D-J-P-C-R扩增子产物。通过生物分析仪评估了文库构建前后V-D-J-P-C-R扩增子的质量。从334个碱基对到459个碱基对的大小变化表明已添加接头序列，用于追踪一例弥漫性大B细胞淋巴瘤复发病例的克隆进化过程。对诊断样本与复发样本之间主要重链VDJ重排的体细胞超突变（SHM）谱型进行了系统发育分析。观察到晚期分歧型克隆进化模式。开发了新的图形化方法以可视化克隆进化过程。所示模式为晚期分歧和早期分歧复发模型的多维尺度缩放图。每个圆圈的半径表示具有特定体细胞超突变（SHM）谱的亚克隆数量。蓝色代表诊断样本，红色代表复发样本。同样，无向图显示晚期分歧情况下的亚克隆数量分布与早期分歧情况不同。边缘对应于两个体细胞超突变（SHM）谱型，其字符串距离为一个字母的差异，颜色比例尺表示比对到特定SHM谱型的序列比例，其中红色代表诊断样本，黄色代表复发样本。在进行该操作时，重要的是避免样本之间的交叉污染。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估淋巴瘤肿瘤样本的特性。该方法还可用于追踪微小残留病灶并探究免疫监视对癌症的应答反应。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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VDJ-SEQ：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析，以揭示的B细胞淋巴瘤克隆演变模式

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