VDJ-Seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示B细胞淋巴瘤的克隆演化模式

本实验的总体目标是对淋巴瘤样本的克隆组成进行表征，以识别淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。该方法有助于解决淋巴瘤研究领域中的关键问题，例如复发性肿瘤如何起源于原始肿瘤。本方案的主要优势在于采用了最新的高通量测序技术，能够更全面地描绘淋巴瘤的共性特征。

本方案中，将从冷冻OCT包埋以及福尔马林固定石蜡包埋的正常或恶性组织的薄切片中提取DNA，以获取冷冻OCT包埋组织中的DNA。首先，在4 mL核酸裂解缓冲液中加入蛋白酶K和0.625% SDS，于37°C水浴中消化10至30片薄切片，过夜。次日，向消化混合物中加入1 mL饱和的5 mol/L氯化钠溶液，剧烈振荡15秒，然后以1,100 × g离心15分钟。

在室温下，将上清液转移至新的15毫升离心管中。加入两倍体积的100%乙醇，通过倒置混匀管壁6到8次，然后在4摄氏度下以5,000 × g离心60分钟。为收集沉淀的DNA，用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，每次在5,000 × g下离心15分钟。

为收集沉淀，将DNA沉淀在100至400 µL TE缓冲液中于室温下在摇床上溶解过夜，以从福尔马林固定的石蜡包埋组织的薄切片中提取DNA。首先通过将石蜡切片在1 mL二甲苯中于室温孵育两次，每次10分钟，进行脱蜡处理。然后在室温下以13,000 ×g离心5分钟，收集组织切片。

接下来，将切片在1 mL 100%乙醇中于室温下孵育两次，每次10分钟，以去除残留的烯烃。在13,000 ×g下离心5分钟，收集组织切片。于室温下将切片空气干燥10至15分钟。

在第二天，向样品中加入新配制的蛋白酶K溶液，终体积为50至100微升，在37摄氏度下孵育过夜。将样品在95摄氏度加热10分钟以灭活蛋白酶K。前一节所示提取方法获得的DNA产量为5至200微克，具体产量取决于组织的大小。

下一步是在PCR管混合物中评估每个DNA样本的质量。取25微升TDNA聚合酶与45微升商用Ladder试剂盒中的预混液混合。向PCR管中加入5微升DNA，并通过移液器上下吹打至少5次，充分混匀。

按照方案文本中详述的条件扩增DNA。随后，将20微升PCR反应产物与4微升6×上样缓冲液混合，加样至2%琼脂糖凝胶中。电泳完成后，用溴化乙锭染色AGROS凝胶，并检测PCR产物。

使用凝胶成像系统，仅选择能够产生大小为 100、200、300、400 和 600 个碱基对的五条 PCR 产物的样品用于生成 VDJ 扩增子。本视频将演示从框架区一（I-G-H-V-D-J 区段）或 IGV HFR 一扩增重排的 I-G-H-V-D-J 片段的过程。从框架区二扩增重排的 I-G-H-B-D-J 片段遵循类似的操作步骤，具体方案文本已在 PCR 管混合体系中描述。

45 微升标记为“mix two”的商用体细胞 IGH 超突变检测试剂盒（凝胶检测型）中的主混合液，加入 25 微升 TAC DNA 聚合酶和 5 微升样本 DNA，按照方案文本中描述的条件进行 DNA 扩增。若 DNA 扩增效果不理想，可通过延长退火时间或增加扩增循环数来调整 PCR 条件。通过电泳在 2% AGROS 琼脂糖凝胶上分离全部 PCR 产物。使用含 0.5 微克/毫升溴化乙锭溶液的 AGROS 琼脂糖凝胶染色，并检测 PCR 产物。

使用凝胶成像系统，预期可观察到大小在 310 至 380 个碱基对范围内的单一条带扩增产物。切下含有该单一条带扩增产物的凝胶区域。随后根据制造商说明书，使用标准凝胶回收试剂盒从切下的凝胶中纯化 DNA。

开始此操作时，将纯化的 V-D-J-P-C-R 产物转移至 PCR 管中，并加入 DNA 样本制备试剂盒中的重悬缓冲液，使总体积达到 60 微升。加入 40 微升 DNA 样本制备试剂盒中的末端修复混合液，充分混匀后，在预热至 100 摄氏度的热盖条件下，于 30 摄氏度孵育反应 30 分钟。接着，在 1.5 毫升离心管中混合 136 微升磁珠和 24 微升 PCR 级水，然后将全部末端修复反应液转移至该管中，与磁珠溶液充分混匀。

将离心管置于磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。吸除上清液，并用新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。彻底吸除乙醇溶液，将磁珠在室温下静置晾干15分钟。

15分钟后，将离心管从磁力架上取下，用17.5 µL重悬缓冲液重悬磁珠。将离心管重新放回磁力架上静置2分钟，使磁珠与重悬缓冲液分离。将含有末端修复产物的重悬缓冲液转移至新的PCR管中。

下一步是将 A 尾添加到末端修复产物中。向含有末端修复产物的 PCR 管中加入 12.5 µL 的 A 尾反应混合液，并充分混匀。将 PCR 管置于预热至 37 °C 的热循环仪中，在 100 °C 预热的加热盖条件下孵育 30 分钟。

进行接头连接时，向A尾反应中加入2.5 µL重悬缓冲液（Resus suspension buffer）、2.5 µL连接混合液和2.5 µL DNA接头索引。将反应体系在30 °C孵育30分钟，使用预热至100 °C的热循环仪并开启预热盖。30分钟后，向每个反应体系中加入5 µL终止连接缓冲液，并充分混匀。

向每个反应中加入 42.5 µL 充分混匀的磁珠，并按前述方法用 80% 乙醇洗涤。加入 50 µL Resus 重悬缓冲液以洗脱接头连接产物。使用 50 µL 充分混匀的 Ampu XP 磁珠对接头连接产物进行第二次纯化，并将产物洗脱至 25 µL Resus 重悬缓冲液中，转入一支洁净的 PCR 管。

为了扩增VDJ扩增子，向含有接头连接产物的PCR管中加入5 µL PCR引物混合液和25 µL PCR预混液，充分混匀后，在PCR仪中按照方案文本所述条件进行扩增。扩增完成后，使用50 µL充分混匀的磁珠纯化反应体系，并用30 µL Resus缓冲液洗脱最终产物。随后，按照方案文本所述方法对VDJ扩增子文库进行验证、合并和测序。

由于VVG测序文库的复杂性较低，我们建议在已批准的测序样本中添加20%至50%的FI掺入，以实现准确的碱基识别。这些代表性凝胶图像显示了从淋巴瘤患者样本中提取的DNA扩增出的V-D-J-P-C-R扩增子产物。通过生物分析仪评估了文库构建前后V-D-J-P-C-R扩增子的质量。

从334个碱基对到459个碱基对的大小变化表明已添加接头序列，用于追踪一例弥漫性大B细胞淋巴瘤复发病例的克隆进化过程。对诊断样本与复发样本之间主要重链VDJ重排的体细胞超突变（SHM）谱型进行了系统发育分析。

观察到晚期分歧型克隆进化模式。开发了新的图形化方法以可视化克隆进化过程。所示模式为晚期分歧和早期分歧复发模型的多维尺度缩放图。

每个圆圈的半径表示具有特定体细胞超突变（SHM）谱的亚克隆数量。蓝色代表诊断样本，红色代表复发样本。同样，无向图显示晚期分歧情况下的亚克隆数量分布与早期分歧情况不同。

边缘对应于两个体细胞超突变（SHM）谱型，其字符串距离为一个字母的差异，颜色比例尺表示比对到特定SHM谱型的序列比例，其中红色代表诊断样本，黄色代表复发样本。在进行该操作时，重要的是避免样本之间的交叉污染。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估淋巴瘤肿瘤样本的特性。

该方法还可用于追踪微小残留病灶并探究免疫监视对癌症的应答反应。感谢观看，祝您的实验顺利成功。