使用小鼠骨骼肌微量组织分离线粒体进行高通量微孔板呼吸测定

以下实验的总体目标是利用基于微孔板的耗氧量检测技术，评估电子传递链、三羧酸循环、β氧化途径以及底物转运蛋白的功能。该目标首先通过配制实验所需的底物和注射溶液来实现；第二步是将注射溶液加入预先水化的三合一（tric）检测试剂盒中，以校准耗氧量检测仪器。

接下来，配制线粒体底物溶液，并将这些溶液加入细胞培养板中。离心细胞培养板，使线粒体在上机前充分贴附于孔板底部，然后将板放入呼吸测定仪中进行检测。仪器将获得基于线粒体呼吸的各呼吸测定实验的氧气消耗速率结果。

与现有的克拉克电极等方法相比，该技术的主要优势在于，基于微孔板的技术能够利用更少量的线粒体实现更高效、更高通量的耗氧量检测。通常，初次接触该方法的研究人员会因实验准备过程中涉及的多个步骤而感到困难。在实验前一晚，将三合一测定试剂盒置于1 mL校准液中，在37摄氏度、无CO2的培养箱中水合过夜。次日，取出所有冷冻的组织块，在37摄氏度水浴或培养箱中解冻。配制所有底物溶液和注射溶液，并将其置于冰上保存。下一步是将多孔板耗氧量检测仪器设置为合适的混匀时间、加样量及检测参数。

进入分析软件并选择标准模式。进入海马客论坛并点击检测向导。进入检测向导后，点击方案以更改混合速度和测量参数。

在“背景校正”选项卡下标记背景孔，并确保进行高亮。执行背景校正。通过先点击“分组和标签”选项卡，然后点击“分组信息”选项卡，来标记各实验条件。

输入这些参数后，单击“结束”，然后单击“保存模板”。要开始此操作，请将注射溶液加载到测定运行盒中。注意将溶液注入正确的端口。

将检测运行卡盒装入仪器中，确保带缺口的一角位于左下角。首先进入分析软件，然后选择标准模式，开始校准程序。进入Seahorse用户论坛。

在 XF 驱动器的“模板”选项卡下打开已保存的模板。打开后，单击“开始”以启动校准，校准过程大约需要 30 分钟。本实验所用的线粒体分离自红色骨骼肌，将线粒体底物储备液轻轻但充分地混合，使用末端剪去约三毫米的 200 微升移液器吸头，通过反复吹打溶液进行混匀。

在测定线粒体储备液的蛋白质浓度后，将每200 µL琥珀酸盐呼吸底物混合液中加入10微克线粒体蛋白进行重悬。使用剪去约三毫米尖端的200 µL移液枪头，轻轻搅拌使线粒体与底物溶液充分混匀。对于其余各组底物混合液，每200 µL中加入14微克线粒体蛋白，并将所有线粒体蛋白-底物混合液置于冰上保存。

将24孔细胞培养板置于冰上，并在每个孔中三份重复加入50微升线粒体底物混合液。基于微孔板的三重测定法开发者建议至少保留两个空白孔，不加线粒体，最好位于细胞培养板的两侧。在4°C条件下以2000 ×g离心20分钟，使线粒体在离心过程中贴附于孔壁。

将底物溶液在37摄氏度水浴中预热。离心结束后，小心地将每种底物溶液各450微升加至相应孔的上方。务必在室温下进行板的加样。

在空白孔中加入500微升底物空白液。用于电子传递检测的孔应加入电子传递底物，而偶联检测的空白孔可加入任意偶联检测底物。每孔加入450微升底物后，在20倍放大倍数下观察孔中线粒体层，以确保线粒体均匀分散成单层。

如本示例所示，在氧消耗检测完成后，可剔除那些未形成均匀单层细胞的成像孔。确认线粒体已贴壁后，将细胞培养板转移至细胞能量代谢分析仪中。点击“确定”。

仪器将弹出之前用于校准的工具板。取下工具板，将含有线粒体的细胞培养板放置在托盘上。细胞培养板上的蓝色缺口应置于托盘的左下角。

单击继续以开始检测运行，过程大约需要40分钟。运行完成后，在屏幕上按弹出按钮以弹出细胞培养板。板弹出后，取出并丢弃细胞培养板和 cartridge。

在屏幕上点击“继续”。运行结果将自动保存为数据文件夹中的 XLS 文件。打开此文件，通过点击 Y 轴标记下方的向下箭头，将显示从 O2 更改为 OCR。

接下来，在显示为选项的速率数据下，将中点更改为逐点速率。单击“确定”。为应用这些更改，请单击屏幕左下角的“孔板分组模式”标签，将条件相似的孔进行分组。

最后，单击屏幕左侧中央附近的“样本均值标准误”选项卡。这些命令也可以在测定之前进行设置。这些曲线代表了四次偶联测定中氧消耗速率（OCR）随时间的变化情况。

第一张图表示状态二，即基础呼吸或不存在解偶联剂（DP）时的呼吸。注射解偶联剂（DP）后的第二张图表示最大偶联呼吸，也称为状态三呼吸。注射寡霉素后的第三张图表示由质子漏引起的呼吸，也称为状态四呼吸。

加入FCCP后的第四组图像代表最大解偶联呼吸，也称为状态三U呼吸。加入抗霉素A后的第五组图像代表氧化呼吸的抑制。由于线粒体储备液与线粒体底物混合液经过充分混匀，以及在黏附离心后形成单层线粒体，所有线粒体状态的实验结果均表现出最小的标准差。

相比之下，每孔中加入的线粒体量不均，且未形成单层线粒体，会导致各状态下的标准差增加，如蓝色轨迹所示：其耗氧率（OCR）值超过每分钟1,500 ole，且在测量期间逐点速率持续下降。需要注意的是，红色轨迹显示逐点速率保持稳定，且最大OCR值低于每分钟1,500 ole。线粒体蛋白过载还可能导致微孔腔室内的氧气耗尽，从而影响后续每次测量的OCR准确读数，如蓝色轨迹所示：在测量期间氧气（O₂）值接近零，且每次连续测量后的初始O₂值显著降低。

在进行该实验操作时，务必注意在混合线粒体与底物溶液时保持耐心。一旦掌握这些方法，还可进一步拓展实验设计，以回答其他科学问题，例如：针对特定底物转运蛋白的药物治疗如何影响线粒体的耗氧量？