使用分离线粒体从小鼠骨骼肌进行高通量微孔板呼吸测量最小数量
2015年10月30日
所提出的方法为使用来自最少量小鼠骨骼肌的分离线粒体进行一系列基于微孔板的呼吸测定提供了分步说明。这些测定能够测量常用动物模型中线粒体耗氧量的机制变化/适应。
以下实验的总体目标是使用基于微孔板的耗氧技术来评估电子传递链、TCA 循环 β 氧化途径和底物转运蛋白的功能。这是通过首先制备用于测定的底物和注射溶液来实现的。第二步是将注射液添加到先前水合的 tric 测定柱中，以校准耗氧机。
接下来，制备线粒体底物溶液并将这些溶液加载到细胞培养板中。在将板加载到 Respira 公制测定中之前，旋转细胞培养板以使线粒体很好地粘附在板上。获得的仪器结果显示每个呼吸测量测定的基于线粒体呼吸的耗氧率。
与现有方法（如 Clark 电极）相比，该技术的主要优点是，基于微孔板的技术允许使用较少的线粒体更高效、更高通量地获取耗氧量，通常，刚接触该方法的个体会遇到困难，因为准备分析溶液涉及所有移动部件在实验前一天晚上，将水合测定柱在非第二天在 37 摄氏度的 CO2 培养箱中，取出所有冷冻的茎，并在 37 摄氏度的浴或培养箱中解冻。准备所有底物溶液和注射溶液并将它们储存在冰上。下一步是将多孔耗氧量测量机编程为适当的混合重量和测量参数。
进入分析软件并选择标准模式。进入 seahorse guest 论坛，然后单击分析向导。进入分析向导后，单击实验方案以更改混合重量和测量参数。
在"反向校正"选项卡下标记背景孔，并确保突出显示。进行背景校正。首先单击 groups and labels 选项卡，然后单击 group info 选项卡来标记条件。
输入这些参数后，单击 end 后跟 save template.要开始此过程，请将注射溶液加载到分析运行柱中。注意将溶液注入适当的端口。
将检测运行小柱装入机器中，左下角有一个缺口角。首先进入分析软件，然后进入标准模式，开始校准。进入 seahorse guest 论坛。
在模板选项卡下的 XF Drive 下打开保存的模板。打开后，单击 Start 开始校准，这大约需要 30 分钟。用于此过程的线粒体从红色骨骼肌中分离出来，通过轻轻搅拌，用 200 微升移液器吸头迭代溶液，轻轻但彻底地混合线粒体底物原液，该吸头的末端已切掉约 3 毫米。
在确定线粒体原液的蛋白质浓度后，复苏每 200 微升琥珀酸腐烂已知底物混合物悬浮 10 微克线粒体蛋白。用 200 微升移液器吸头轻轻搅拌，轻轻但彻底地混合线粒体底物溶液，该吸头以相同的方式切掉了其末端约 3 毫米。Reeses Band，每 200 微升每种剩余底物混合物中含有 14 微克线粒体蛋白，将所有线粒体蛋白底物混合物置于冰上。
将 24 孔细胞培养板放在冰上，一式三份，每孔 50 μL 的线粒体底物混合物。基于微孔板的 tric 测定法的开发人员建议至少留下两个没有线粒体的空白孔，最好在细胞培养板的两侧。在 4 摄氏度下以 2000 G 离心细胞培养板 20 分钟，以在板旋转时将线粒体粘附到孔上。
在 37 摄氏度的水浴中加热底物溶液。离心完成后，小心地将 450 μL 每种底物溶液加载到其各自的孔顶部。确保在室温下加载板。
用 500 μL 底物空白加载空白孔。指定用于电子流测定的孔应加载电子流底物，而偶联测定空白孔可以加载任何偶联测定底物。向每个底物中加入 450 微升底物后，以 20 倍放大倍率观察孔中的线粒体层，以确保线粒体均匀分散在单个单层中。
如本例所示，可以在 oc 后去除似乎没有均匀分布的单层的图像孔。确认线粒体粘附后，将细胞培养板带到 Respir 公测测定仪上。单击 确定。
设备将弹出之前用于校准的工具板。取下工具板，将含有线粒体的细胞培养板放在托盘上。细胞培养板上的蓝色缺口应位于托盘的左下角。
单击 continue （继续） 开始检测运行，大约需要 40 分钟。运行完成后，按屏幕上的 eject 键弹出细胞培养板。弹出板后，取出并丢弃细胞培养板和卡盒。
打 继续 在屏幕上。运行将自动作为 XLS 文件保存在数据文件中。打开此文件，然后按 Y 1 标记下方的向下箭头，将显示从 O2 更改为 OCR。
接下来，将中间点更改为速率数据显示为选项下的点对点速率。单击 确定。要应用这些更改，请单击屏幕左下角的 well group mode（孔组模式）选项卡，将条件相似的孔分组在一起。
最后，单击屏幕中间左侧的样本均值标准误差选项卡。这些命令也可以在分析之前设置。这些轨迹代表四种偶联测定的耗氧率或 OCR 与时间的关系。
第一个面板代表状态二，呼吸或在没有 DP 的情况下的呼吸。注射 A DP 后的第二个面板代表最大耦合呼吸，也称为状态三呼吸。注射寡霉素后的第三个面板。A 代表质子泄漏引起的呼吸，也称为状态 4 oh 呼吸。
注射 FCCP 后的第四个面板代表最大非耦合呼吸，也称为状态 3 U 呼吸。注射抗霉素 A 后的第五组代表氧化呼吸的抑制。由于线粒体原液和线粒体底物混合物的彻底混合以及粘附旋转后获得单个单层线粒体，所有线粒体状态都具有最小的标准偏差。
相比之下，在每个孔中加载不相等的线粒体并且没有获得单个单层线粒体会导致每种状态的标准偏差增加，如蓝色轨迹所示，它显示 OCR 值高于每分钟 1， 500 ole，以及在测量过程中呼吸速率降低，例如点对点速率值的下降。请注意，红色轨迹显示一致的点对点速率，最大 OCR 值低于每分钟 1， 500 ole。线粒体蛋白超载也会导致孔微室内的氧气耗尽，从而阻止准确测量每次连续测量的 OCR，如蓝色轨迹所示，蓝色轨迹显示 O2 值在测量期间接近零，以及每次连续测量后起始 O2 值显着降低。
在尝试此程序时，重要的是要记住在混合线粒体和底物溶液时要有患者。一旦掌握了这些方法，就可以对其他实验进行变形，以回答其他问题，例如，某种底物转运蛋白的药物靶向治疗如何影响线粒体耗氧量？
概览
本文介绍了使用小鼠骨骼肌分离线粒体进行基于微孔板的呼吸测定分析的方法。这些分析测量线粒体氧消耗的变化，为代谢适应提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 代谢生理学
背景
- 基于微孔板的技术提高了氧消耗测量的效率。
- 骨骼肌分离的线粒体作为研究线粒体功能的模型。
- 理解线粒体呼吸对于洞察代谢疾病至关重要。
- 像Clark电极这样的传统方法对高通量分析来说效率较低。
研究目的
- 评估电子传递链和TCA循环的功能。
- 评估线粒体对不同底物的适应性。
- 为新手提供详细的方法协议。
使用的方法
- 准备分析的底物和注射溶液。
- 使用水合的分析卡片校准氧消耗仪。
- 从小鼠骨骼肌中分离和制备线粒体。
- 进行呼吸测定以测量氧消耗率。
主要结果
- 使用微孔板技术成功测量线粒体呼吸率。
- 展示了比传统方法更高的通量能力。
- 确定了线粒体粘附和底物加载的最佳条件。
结论
- 基于微孔板的呼吸测定分析对于研究线粒体功能是有效的。
- 该方法允许有效使用有限的线粒体样本。
- 详细的协议可以帮助研究人员在他们的研究中实施这些分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput assessment of mitochondrial function using minimal skeletal muscle tissue, supporting early-stage target validation in metabolic disease research. By providing quantitative oxygen consumption data from isolated mitochondria, it enhances predictive confidence in pathway modulation studies. The approach addresses a key gap in scalable mitochondrial phenotyping for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of electron transport chain, TCA cycle, and fatty acid oxidation pathways in a disease-relevant model.
- Operational Value: Requires only microgram quantities of mitochondrial protein, conserving precious preclinical samples.
- Scientific Value: Supports target hypothesis testing by linking substrate transporter modulation to respiratory output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative OCR measurements across multiple respiratory states for compound screening.
- Operational Value: Microplate format allows parallel testing of conditions, improving assay throughput and reagent efficiency.
- Scientific Value: Standardized mitochondrial adherence and substrate loading reduce well-to-well variability, enhancing data reliability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant skeletal muscle mitochondrial data to inform translational biomarker strategies.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of metabolic adaptations in preclinical models.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating mitochondrial contributions to whole-tissue phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling mitochondrial phenotyping after target identification and before efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of metabolic targets in skeletal muscle.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible OCR readouts for hit confirmation and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides state-resolved respiration metrics (basal, coupled, leak, uncoupled) to compare metabolic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial function to preclinical continuity via disease-relevant tissue model.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized mitochondrial assay platform applicable across multiple metabolic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by linking modulation to measurable respiratory changes.
- Operational Value: Reduces sample consumption through low-input, high-precision measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early metabolic liability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation and respirometry is required for reliable results.
- Access to a microplate-compatible oxygen consumption analyzer and associated cartridges is necessary.
- Standardization of mitochondrial protein quantification and substrate preparation across teams ensures reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of isolation and adherence protocols.
- Technical precision in mixing and monolayer formation is critical to minimize variability in OCR measurements.
