从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体

本视频文章的总体目标是从少量小鼠骨骼肌中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的 tric 测定。这种方法可以帮助回答生物医学研究中的关键问题，例如描述某些药物和蛋白质如何调节骨骼肌、线粒体耗氧量。该技术的主要优点是可以从比以前报道的少量小鼠骨骼肌中分离出高质量的线粒体。

根据机构指南对小鼠实施安乐死。然后将鼠标侧放，用细尖剪刀在皮肤上切开。覆盖股骨的外上髁。

朝鼠标方向剥皮，然后去除位于股四头肌原点上方的脂肪垫。接下来，切开附着在髌骨上的股四头肌肌腱。慢慢剪断骨骼和股四头肌之间的 apo 神经症，同时避开股动脉。

然后在股骨起点切开肌腱，释放股四头肌，将股四头肌放入冰镇的 PBS 中。用一把剪刀去除股四头肌上任何可见的脂肪组织。清洁后，将股四头肌翻转过来，使覆盖股骨的肌肉部分朝上。

用镊子以扇形运动打开股四头肌。从每个叶中取出两个可见的红色肌肉部分，并将它们放入装有 5 毫升冷冻线粒体的烧杯中。隔离缓冲液。

接下来，用细剪刀剪开覆盖在跟腱上的皮肤，然后朝向老鼠剥皮。切开暴露的跟腱，将肌肉剥向小鼠的身体。切开股骨外侧和内侧髁的肌腱以释放腓肠肌，并将附着在肌腱上的腓肠肌放入装满冰镇 PBS 的培养皿中。

将腓肠肌翻转过来，剥去比目鱼肌。将比目鱼肌放入装有 5 毫升冷冻线粒体的烧杯中。隔离缓冲液。

下一个风扇打开了腓肠并去除了三个视觉上红色的肌肉部分。将有两个外侧部分和一个内侧浅表红色条带。分离后，将红色肌肉转移到装有 5 毫升冷冻线粒体的烧杯中。

隔离缓冲液 1.从鼠标的另一条腿上再去除 75 到 100 毫克的红色肌肉。重复刚才显示的过程。

将第二条腿的解剖肌肉放入 1.5 毫升微量离心管中，并按照随附文本方案中的说明制备蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物和细胞裂解缓冲液。立即闪蒸，将第二个样品用液氮冷冻，用于蛋白质印迹。将预先愈合的平坦塑料表面放在一个大桶中的冰上。

然后将一滴线粒体分离缓冲液 1 倒在塑料表面上，并使用镊子将所有切片的红色肌肉放入一滴隔离中。缓冲区。使用单刃剃须刀片将肌肉组织切碎两分钟，每 40 秒更换一把新的锋利剃须刀。将切碎的组织转移到装有 5 毫升新鲜线粒体的新烧杯中。

隔离缓冲液 1.然后取溶液，通过 100 微米的细胞过滤器将其排空，放在 50 毫升锥形管上。用精致的 Task 擦拭布吸干组织，然后将其转移到 5 毫升 0.05% 试用蛋白溶液中。

使用镊子从任务刮水器中取出任何残留的组织，并将其添加到胰蛋白酶中。将肌肉组织在胰蛋白酶溶液中置于冰上孵育 30 分钟。然后将样品在 4 摄氏度下以 200 倍 G 离心 3 分钟。

离心后，将胰蛋白酶旋置物倒入废液容器中，并用 3 毫升冰冷的线粒体分离缓冲液 1 重悬沉淀。然后将组织转移到 45 毫升玻璃匀浆管中。用另外 1.5 毫升线粒体分离缓冲液冲洗 15 毫升锥形管，以收集任何剩余的样品，并将其添加到玻璃均质管中。

接下来，将玻璃均质管放入装满一半冰块的烧杯或塑料容器中。因此，玻璃均质器在烧杯内的移动最小。用连接到电机驱动组织的聚四氟乙烯杵对样品进行均质化。

10 个 80 RPM 的均质器。按住每个通道的底部约 2 秒钟。然后将组织匀浆转移到新的 15 ml 锥形管中。

并用 6.5 毫升线粒体分离缓冲液 1 冲洗玻璃匀浆管。将缓冲液倒入含有其余组织的 15 ml 锥形管中。匀 浆。将样品在 4 摄氏度下以 700 倍 G 离心 10 分钟，然后将旋后液轻轻倒入高强度玻璃离心管中，弃去沉淀。

接下来，在 4 摄氏度下以 8， 000 倍 G 旋转 snat 10 分钟。要沉淀线粒体，请去除 snat 并通过缓慢加入 500 微升线粒体分离缓冲液 2 重悬沉淀，切掉移液器吸头的末端，并以混合和搅拌动作轻轻地匀浆缓冲液中的沉淀。然后再添加 4.5 毫升线粒体分离。

缓冲液 2 到混合物中 沉淀完全悬浮后，在 4 摄氏度下以 8， 000 倍 G 旋转匀浆 10 分钟，以再次沉淀线粒体。去除 S 上清液，通过添加 2 25 微升增量的线粒体分离，轻轻但完全重悬沉淀。缓冲液 2，使用切掉尖端的移液器吸头，在每 25 微升缓冲液后轻轻搅拌和混合沉淀。

完成后，将此线粒体原液放在冰上。在高纯水中制作两个单独的 1 至 20 稀释的线粒体原液。向一个样品中加入 0.1% 的 Triton 100 x，并在低设置下超声处理 10 秒。

将另一种稀释液留在冰上，然后将超声处理的样品放回冰中。超声处理后，然后使用标准技术的光度测定法对非超声处理和超声处理的线粒体稀释进行柠檬酸盐合酶测定，使用随附文本方案中提供的方程确定完整线粒体膜的百分比。联合线粒体导致柠檬酸盐合成酶活性在统计学上显着增加。

与超声处理样品相比，非超声处理线粒体样品中的柠檬酸盐合成酶活性表明，在 ga 分离表达后，92.5% 的线粒体是完整的。DH 和 COX 4 在整个组织裂解物中很明显，在分离的线粒体中观察到 Cox 4 的表达。虽然只有微弱的 GA DH 条带很明显，但这些发现表明线粒体分离良好，在分离过程中几乎没有非线粒体成分的污染。

在尝试此程序时，重要的是要记住小心处理线粒体原液，切勿在此程序后涡旋或剧烈混合。可以执行其他方法，例如测量反应作用物质的产生，以回答其他问题，例如干预是否影响孤立线粒体中活性氧的产生。