Name: 从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量中分离少量高质量线粒体的方法。该技术可用于研究药物和蛋白质对线粒体氧消耗的调节作用，为生物医学研究提供可靠工具。

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弗林生命科学研究所以及弗吉尼亚理工学院的代谢表型分析核心实验室为本研究提供了支持。

动物实验是在弗吉尼亚理工学院暨州立大学机构动物护理与使用委员会批准的方案下进行的。
1. 准备（时间：约45分钟）
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻0.25%胰蛋白酶、线粒体分离缓冲液（IBM）1和IBM2的冷冻储存液。</li>
	<li>用70%乙醇冲洗玻璃器皿和解剖器械，随后用高纯度水冲洗。</li>
	<li>将0.25%胰蛋白酶原液用IBM1按1:4比例稀释，配制0.05%胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>在1.5 ml带螺帽的微量离心管中，按1:100比例将蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液加入细胞裂解缓冲液中。</li>
	<li>将5 ml（每只小鼠5 ml）0.05%胰蛋白酶分装至15 ml塑料管中。</li>
	<li>将电机驱动的组织匀浆器设定为80 RPM。</li>
</ol>
2. 骨骼肌线粒体的分离（时间：约90分钟）
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>取自股四头肌和腓肠肌的红肌组织（包括比目鱼肌，总量约为 75–100 mg），具体操作步骤如下：
	<ol>
		<li>将皮肤向小鼠身体方向剥离。</li>
		<li>去除覆盖在股四头肌起点处的脂肪垫。使用尖头剪刀剪断连接髌骨的股四头肌肌腱。 
		注意：股四头肌位于近端股骨前侧，可根据其解剖位置进行识别。</li>
		<li>缓慢剪开骨与股四头肌之间的腱膜，注意避开股动脉，使股四头肌从骨上分离。在股骨起点处用尖头剪刀剪断肌腱，完全游离股四头肌，并将其放入预冷的 PBS 中。</li>
		<li>用剪刀去除股四头肌表面可见的脂肪组织。将股四头肌翻转，使原本覆盖在股骨上的部分朝上。用镊子以扇形方式打开股四头肌组织。用尖头剪刀从每个叶中分离出两块可见的红肌部分，并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。 
		注意：股四头肌呈两个叶状结构，每个叶的外侧边缘附近均有一条红肌带。</li>
		<li>用尖头剪刀剪开覆盖在跟腱上的皮肤，并将皮肤向小鼠身体方向剥离。剪断暴露的跟腱，并将肌肉向小鼠躯干方向剥离。</li>
		<li>用尖头剪刀在股骨的外侧和内侧髁处剪断肌腱，游离腓肠肌，并将带有肌腱的腓肠肌置于预冷的 PBS 中。</li>
		<li>将腓肠肌翻转，剥离下方的比目鱼肌并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。将腓肠肌以扇形打开，用尖头剪刀分离出三块可见的红肌部分（两条外侧和一条内侧浅层红肌条带），并转移至含有 5 ml 预冷 IBM1 的烧杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠另一条腿中再取约 75–100 mg 的红肌组织（操作方法同步骤 2.2），放入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物以及细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，150 mM NaCl，1% 十二烷基硫酸钠，0.5% 脱氧胆酸钠，1% 聚氧乙烯（9）壬基苯基醚，支链型）的 1.5 ml 微量离心管中。立即用液氮对该第二份样品进行速冻，以备后续用于 Western 印迹分析（见步骤 6.1）。</li>
	<li>将预冷的平坦塑料表面置于装有冰的大桶中。在塑料表面滴加一滴 IBM1，用镊子将所有已切分的红肌组织（步骤 2.2.4 和 2.2.7）转移至该液滴中。使用三把单刃剃须刀片，每 40 秒更换一次刀片，持续剪切组织 2 分钟以充分剪碎肌肉。</li>
	<li>将剪碎的组织转移至另一含有 5 ml 新鲜 IBM1 的烧杯中：将塑料表面置于烧杯上方，用刀片刮下组织使其落入烧杯。将此溶液通过置于 50 ml 锥形管上的 100 µm 细胞滤筛进行过滤。</li>
	<li>用精细擦拭纸吸去组织表面液体，然后将其转移至 5 ml 的 0.05% 胰蛋白酶溶液中。使用镊子将组织从擦拭纸上取下。</li>
	<li>将肌肉组织在冰上孵育 30 分钟，使用 0.05% 胰蛋白酶溶液。</li>
	<li>将含有胰蛋白酶/肌肉混合物的 15 ml 锥形管在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将胰蛋白酶上清液倒入废液容器中，用 3 ml 冰冷的 IBM1 重悬沉淀。将组织转移至 45 ml 玻璃匀浆管中。用另外 1.5 ml IBM1 冲洗 15 ml 锥形管，收集残留样品并加入玻璃匀浆管中。</li>
	<li>将玻璃匀浆管放入盛有半杯冰的烧杯或塑料容器中，确保玻璃匀浆管在其中移动幅度最小。</li>
	<li>使用连接在电机驱动匀浆器上的聚四氟乙烯（PTFE）研杵，以 80 rpm 的速度进行 10 次匀浆操作，每次下压到底部后停留约 2 秒。</li>
	<li>将组织匀浆液转移至新的 15 ml 锥形管中，并用 6.5 ml IBM1 冲洗玻璃匀浆管。将冲洗液倒入含有组织匀浆液的 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>将 15 ml 锥形管在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟。小心倾倒上清液至玻璃高强度离心管中，弃去沉淀。</li>
	<li>将上一步所得上清液在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去 IBM1 上清液，通过缓慢加入 500 µl&#160;IBM2 重悬沉淀。剪去移液枪头末端，用轻柔吹打和搅拌的方式将沉淀在 IBM2 中均匀重悬。待沉淀完全悬浮后，再加入 4.5 ml IBM2。 
	注意：在分散较大沉淀块时应避免过度吹打，以免损伤线粒体膜。</li>
	<li>将 IBM2/组织匀浆液在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。 
	注意：为提高第 4 步中分离线粒体蛋白定量的准确性，可在洁净的高强度离心管中重复此步骤，因为残留的 BSA 可能影响总蛋白含量测定。</li>
	<li>弃去上清液，使用剪去尖端的移液枪头，分两次每次加入 25 µl IBM2，轻柔但彻底地重悬沉淀。每次加入 25 µl IBM2 后均需轻轻搅拌混合。将此线粒体储备液置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 全组织裂解液的匀浆处理（时间：约45分钟；可在步骤7期间进行）
<ol>
	<li>从步骤2.3中置于液氮中的组织取出，室温孵育至完全解冻。</li>
	<li>将组织置于冰上，用尖头剪刀剪碎约30秒。</li>
	<li>向步骤3.2中已装有剪碎组织的1.5 ml带螺口盖的微量离心管中加入两勺100 µl氧化锆珠。使用珠磨组织匀浆器，以4–6（中等设置）的速度进行两到三个5分钟的匀浆循环。</li>
	<li>将步骤3.3中的混合物在4 °C下以12,000 × g离心10分钟。离心后，用1,000 µl移液器吸头吸取上清液，并转移至一个新的1.5 ml微量离心管中。弃去沉淀，将上清液置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 蛋白质测定（时间：约30分钟）
<ol>
	<li>根据BCA蛋白检测试剂盒的制造商说明书，测定全组织裂解液（步骤3.4）和线粒体储备液（步骤2.17）的蛋白浓度。</li>
</ol>
5. 线粒体膜完整性；柠檬酸合酶（CS）活性检测（时间：约15分钟）
<ol>
	<li>用高纯度水分别对线粒体储备液进行1:20的两种稀释。向其中一份样品中加入0.1%的Triton 100-X，并在低功率条件下（765瓦，振幅2）进行超声处理。另一份稀释液则置于冰上保存。超声处理后，将样品放回冰上。</li>
	<li>使用分光光度法检测，对未超声和已超声的线粒体稀释液均进行柠檬酸合酶活性测定，具体方法如先前所述11,12。</li>
	<li>通过以下公式计算线粒体膜完整性的百分比： 
	（未超声CS活性 ÷ 超声后CS活性）× 100</li>
</ol>
 
         100- N（上述达到的百分比）
6. 线粒体分离质量；蛋白质印迹（时间：根据实验室方案）
<ol>
	<li>按照先前所述方法12对全组织裂解液和分离的线粒体进行蛋白质印迹分析。 
	注意：使用GAPDH一抗（以5% BSA/TBS-T溶液按1:1,000稀释）和COXIV一抗（以5%脱脂牛奶/TBS-T溶液按1:1,000稀释），随后分别使用山羊抗兔和兔抗二抗（1:10,000稀释）。</li>
</ol>
7. 呼吸测定实验运行（时间：约90分钟）
<ol>
	<li>使用基于微孔板的氧气测定法进行所需的呼吸测定实验2 消耗量测量技术，如先前所述（参见相关文章和Rogers） 等8).</li>
	<li>通过将 State 3 除以 State 4o（RCR），或 将 State 3u 除以 State 4o 来确定呼吸控制比（RCR）。可采用点对点轨迹中的中间（平均）值，或选用最高速率（State 3）与最低速率（State 4o）进行计算&#160;在确定 RCR 时。</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
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<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li>
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<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol.%3A+Respir.%2C+Envir.+and+Ex.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li>
<li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+functions%2C+mitochondrial+DNA+copy+numbers%2C+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

George Rogers 是 Seahorse Bioscience 的员工，该公司生产了本实验方案所修改仪器。

本文所述方法详细介绍了从少量（约75–100 mg）小鼠骨骼肌组织中分离线粒体的操作流程。该分离方法可获得功能良好且纯度较高的线粒体（约450 µg），其功能活性已通过O2 消耗速率、RCR 值、最大柠檬酸合酶活性以及免疫印迹分析的蛋白表达。重要的是，通过该方法分离的线粒体可用于基于微孔板的多种呼吸测定实验2 允许高通量的消耗技术。
分离骨骼肌线粒体通常需要采用较为剧烈的方法，以从周围的结缔组织和结构蛋白中释放线粒体7,16。因此，线粒体膜可能受到破坏，从而影响后续呼吸测定实验中线粒体耗氧（O2）活性的准确性。在先前报道的方法7基础上，于组织切除后增加一步使用剃须刀片对组织进行精细剪切的操作，可显著降低机械匀浆时转子的转速（80 rpm 对比 1,600 rpm）。这种更温和的匀浆与重悬技术使得具有完整膜结构的线粒体比例显著提高（92.5±2.0%），该结果通过分离后柠檬酸合酶活性测定评估得出。我们的研究结果与 Asmann et al.17</...

线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生ATP。然而，线粒体还具有许多其他重要的细胞功能，包括但不限于：活性氧的生成与解毒、细胞质和线粒体内钙离子的调节、细胞器的运输、离子稳态以及参与细胞凋亡1,2。因此，线粒体功能障碍在多种疾病的病理过程中发挥作用也就不足为奇，例如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、肥胖和糖尿病3,4。尤为重要的是，骨骼肌中的线粒体在上述许多病理过程中均发挥着作用3-5。
使用分离的线粒体进行线粒体呼吸测定，可评估电子传递链和氧化磷酸化的功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。针对多种物种的不同组织和细胞类型，已有相应的线粒体分离方法6,7。然而，这些方法通常需要大量组织或细胞，才能获得高质量且足量的线粒体，以满足经典测氧呼吸测定实验的要求。
基于微孔板的呼吸测定实验能够利用极少量分离的线粒体进行高通量检测，通常每个孔仅需几微克（µg）8。因此，我们对先前发表的方法7进行了改进，使其能够从小鼠骨骼肌的更小样本中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的呼吸测定实验。此外，本文还提供了评估线粒体分离制备质量以及线粒体膜完整性的方法。鉴于骨骼肌线粒体参与多种病理过程，氧气（O2）消耗量的测定在机制驱动型研究中的应用正日益广泛9,10。

<table><tbody><tr><td>基本脂肪酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>无酸-BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>氯化钠&lt;br/&gt; 白色晶体或结晶性粉末&lt;br/&gt; &amp;ge;99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>支化十二氧乙烯基壬基苯基醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>单刃剃须刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon-100 µm 尼龙细胞滤网</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂（Halt Protease） &amp;和磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 带螺口盖的微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧化锆珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 抗体 (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>抗 COXIV 抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>4844s</td><td>任何线粒体内膜蛋白均可满足要求</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的Donkey抗Rabbit IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>丙酮酸，98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>4°C 保存 &amp;deg;C，用于呼吸测定前用KOH调节pH至7.4</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>室温保存，使用前用KOH调节pH至7.4</td></tr><tr><td>L(-)苹果酸，BioXtra， &amp;ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>室温保存，使用前用 KOH 调节至 7.4 后用于呼吸测定实验</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>室温保存，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验，使用前用KOH调至7.4，用于呼吸测定实验</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>棕榈酰-L-肉碱氯化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>寡霉素A， &amp;ge; 95%（HPLC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>羰基氰基-4-(三氟甲氧基)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>2-8℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>苯肼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;ge;98%（薄层色谱），粉末 [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉菌属来源的抗霉素A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>腺苷5&amp;prime;二磷酸腺苷单钾盐二水合物 [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C，使用前用 KOH 调至 7.4</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>室温保存</td></tr></tbody></table>

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

功能异常的骨骼肌线粒体在衰老、肥胖和2型糖尿病中观察到的代谢改变中发挥重要作用。通过分离线粒体样本进行线粒体呼吸测定，可评估线粒体功能，并确定调节代谢的药物和蛋白质的作用机制。目前的分离方法通常需要大量组织，才能获得呼吸测定所需的高质量线粒体。本文所述方法表明，仅需少量小鼠骨骼肌组织（约75–100 mg），即可分离出高质量的纯化线粒体（约450 µg），用于高通量呼吸功能检测。我们通过分光光度法测定柠檬酸合酶活性，确定该分离方法获得的线粒体完整性为92.5±2.0%。此外，对分离线粒体进行的Western blot分析显示，胞质蛋白GAPDH表达微弱，而线粒体蛋白COXIV表达显著。分离线粒体中GAPDH条带不明显，表明分离过程中非线粒体来源的污染极少。最重要的是，氧气消耗率的测定结果表明，这些线粒体具有良好的功能活性。2 使用微孔板技术测定耗氧率并确定偶联呼吸测定实验的呼吸控制比（RCR），可显示高度偶联状态（RCR； &#62;6（所有实验均为6次）且具有功能性的线粒体。总之，在先前报道的方法基础上增加一个独立的剪切步骤，并显著降低电机驱动的匀浆速度，使得从较少量的小鼠骨骼肌中分离出高质量且纯度较高的线粒体成为可能，所得线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

柠檬酸合酶活性可作为膜完整性的检测指标，因为柠檬酸合酶位于线粒体内膜上，因此在膜完整的线粒体悬液中不应存在。图1展示了同一来源分离的线粒体样品在未超声处理与超声处理后柠檬酸合酶活性的比较。超声处理线粒体后，柠檬酸合酶活性显著升高，差异具有统计学意义（P &lt;0.01）。重要的是，分离后的线粒体中，92.5 ± 2.0% 保持完整。
图2展示了分离的线粒体以及整体骨骼肌组织裂解液中GAPDH和COXIV的表达情况。GAPDH是一种位于胞质溶胶中的蛋白质，也可在转位后存在于细胞核中；而COXIV是定位于线粒体内膜的蛋白质。在整体组织裂解液中可明显观察到GAPDH和COXIV的表达。在分离的线粒体中，可检测到COXIV的表达，而GAPDH仅有微弱条带。这些结果表明线粒体分离效果良好，分离过程中非线粒体成分的污染较少。
图3 是采用本实验方案分离得到的线粒...

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。

功能异常的骨骼肌线粒体在衰老、肥胖和2型糖尿病中观察到的代谢改变中起着重要作用。线粒体……

本视频文章的总体目标是从少量小鼠骨骼肌中分离高质量的线粒体，用于基于微孔板的三羧酸循环相关检测。该方法有助于解答生物医学研究中的关键问题，例如描述特定药物和蛋白质如何调控骨骼肌线粒体的氧气消耗。该技术的主要优势在于，相较于以往报道的方法，能够从更少量的小鼠骨骼肌组织中分离出高质量的线粒体。根据机构指南对小鼠实施安乐死。然后将小鼠侧卧放置，使用尖头剪刀在皮肤上剪开切口，切口位置位于股骨外侧髁上方。将皮肤向小鼠方向剥离，然后去除位于股四头肌起点处的脂肪垫。接着，切断连接髌骨的股四头肌腱。在股骨与股四头肌之间小心剪开肌腱膜，注意避免损伤股动脉。然后在股骨起点处切断肌腱，以游离股四头肌，并将股四头肌放入预冷的PBS中。使用剪刀去除股四头肌表面可见的脂肪组织。清理干净后，将股四头肌翻转，使原本覆盖在股骨上方的肌肉部分朝上。用镊子以扇形方式打开股四头肌。从每个叶中去除两块可见的红色肌肉部分，并将其放入含有五毫升冰冷线粒体分离缓冲液的烧杯中。接下来，用尖头剪刀剪开跟腱表面的皮肤，并将皮肤向小鼠身体方向剥离。剪断暴露的跟腱，并将肌肉向小鼠身体方向剥离。在股骨的外侧和内侧髁处剪断肌腱，以分离腓肠肌，并将附着于其肌腱上的腓肠肌置于盛有冷PBS的培养皿中。翻转腓肠肌，并剥离下方的比目鱼肌。将比目鱼肌放入盛有5 mL冰冷线粒体分离缓冲液的烧杯中。接下来，取下一个风扇，切开腓肠肌并取出三块肉眼可见的红色肌肉部分。其中包括两块侧部的红色肌肉和一块中部浅层的红色肌条。分离后，将红色肌肉转移至含有5 mL冰冻线粒体的烧杯中。缓冲液一的制备。从另一侧鼠腿中再取 75 至 100 毫克的红肌组织，重复上述操作过程。将第二条腿中解剖得到的肌肉组织放入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液以及细胞裂解缓冲液的1.5毫升微量离心管中，缓冲液的配制方法见随附的文字版实验方案。立即用液氮对第二个样本进行速冻，以用于后续的蛋白质印迹分析。将一个预先加热至平整的塑料表面置于盛有冰的大桶中。然后在塑料表面滴加一滴线粒体分离缓冲液一，用镊子将所有切好的红色肌肉组织放入分离缓冲液的液滴中。使用单刃剃刀片将肌肉组织切碎两分钟，每40秒更换一次新的锋利剃刀。将切碎的组织转移至含有5毫升新鲜线粒体缓冲液的新烧杯中。加入缓冲液一进行分离。然后将溶液通过置于50毫升锥形管上的100微米细胞滤筛过滤。用柔软的擦拭纸轻轻吸去组织上的液体，再将组织转移至5毫升0.05%胰蛋白酶溶液中。使用镊子将任务擦拭物上残留的任何组织取下，并加入胰蛋白酶中。将肌肉组织在冰上孵育于胰蛋白酶溶液中30分钟。然后在4°C条件下以200 × g离心样品3分钟。离心后，将胰蛋白酶上清液倒入废液容器中，并用 3 毫升冰预冷的线粒体分离缓冲液一重悬沉淀。然后将组织转移至 45 毫升玻璃匀浆管中。用另外 1.5 毫升线粒体分离缓冲液一冲洗 15 毫升圆锥形离心管，以收集任何残留样品，并将此液加入玻璃匀浆管中。接下来，将玻璃匀浆管放入一个装有半杯冰的烧杯或塑料容器中，使玻璃匀浆管在烧杯内移动最小。使用连接在电机驱动组织匀浆器上的聚四氟乙烯研杵对样品进行匀浆处理。使用匀浆器以80 RPM转速匀浆10次。每次通过时在底部停留约两秒钟。然后将组织匀浆转移至新的15毫升锥形管中。用6.5毫升线粒体分离缓冲液一冲洗玻璃匀浆管，将冲洗液倒入含有剩余组织匀浆的15毫升圆锥形离心管中。在4°C下以700 × g离心10分钟，然后小心将上清液倒入高强度玻璃离心管中，弃去沉淀。接下来，在 4°C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。为沉淀线粒体，弃去上清液，缓慢加入 500 µL 线粒体分离缓冲液 2，剪掉移液器吸头的末端，用吹打和搅拌动作轻轻将沉淀在缓冲液中重悬。然后加入 4.5 mL 线粒体分离缓冲液。向混合物中加入2号缓冲液。待沉淀完全重悬后，在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟，再次沉淀线粒体。弃去上清液S，用剪去尖端的移液枪头，每加入25 µL线粒体分离缓冲液2号，用移液枪头轻轻搅拌混匀，逐步且轻柔但彻底地重悬沉淀。完成操作后，将该线粒体储备液置于冰上。用高纯度水对线粒体储备液进行两份独立的一比二十稀释。向其中一份样品中加入终浓度为0.1%的Triton 100×，并在低功率条件下超声处理10秒。将另一份稀释液置于冰上，并将超声处理后的样品放回冰上。超声处理后，使用分光光度法，按照标准技术对未超声和超声处理的线粒体稀释液进行柠檬酸合酶活性检测，并根据随附文本方案中提供的公式计算线粒体膜完整性的百分比。线粒体的超声处理可导致柠檬酸合酶活性显著升高。与超声处理的样品相比，未超声处理的线粒体样品中柠檬酸合酶活性显示，在线粒体分离后，92.5%的线粒体保持完整。在全组织裂解液中可明显检测到GA DH和COX IV的表达；而在分离的线粒体中仅观察到COX IV的表达，GA DH则仅有微弱条带。这些结果表明线粒体分离效果良好，分离过程中来自非线粒体组分的污染极少。在进行该操作时，务必注意小心处理线粒体储备液，切勿涡旋震荡或剧烈混匀。还可采用其他方法，如检测活性反应物质的生成，以回答进一步的问题，例如某种干预措施是否影响分离线粒体中活性氧的产生。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体

本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al.

从骨骼肌中分离线粒体

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。...

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。...

使用小鼠骨骼肌微量组织分离线粒体进行高通量微孔板呼吸测定

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。...

通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

线粒体是骨骼肌中具有高度表型可塑性的关键代谢细胞器。细胞质蛋白的输入是细胞器生物发生的关键途径，对线粒网状结构的扩展和线粒体功能的维持至关重要。因此，蛋白质输入可作为细胞健康状况的指标。...

骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

显微解剖外植体技术是一种稳健且可靠的方法，可用于从幼年、成年或胚胎期肌肉中分离出具有增殖能力的骨骼肌细胞，以获取骨骼肌干细胞。这些细胞具有独特性，可通过克隆化培养获得骨骼肌干细胞系，用于体内移植。...

成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

从小鼠骨骼肌中通过酶解分离、表面标记及流式细胞术纯化纤维/脂肪生成和肌源性前体细胞的方法。...

从骨骼肌中纯化前体细胞

肌纤维的分离与培养是金标准 体外...

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

了解从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量中分离少量高质量线粒体的方法。该技术可用于研究药物和蛋白质对线粒体氧消耗的调节作用，为生物医学研究提供可靠工具。

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

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