从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

本视频文章的总体目标是从少量小鼠骨骼肌中分离高质量的线粒体，用于基于微孔板的三羧酸循环相关检测。该方法有助于解答生物医学研究中的关键问题，例如描述特定药物和蛋白质如何调控骨骼肌线粒体的氧气消耗。该技术的主要优势在于，相较于以往报道的方法，能够从更少量的小鼠骨骼肌组织中分离出高质量的线粒体。

根据机构指南对小鼠实施安乐死。然后将小鼠侧卧放置，使用尖头剪刀在皮肤上剪开切口，切口位置位于股骨外侧髁上方。

将皮肤向小鼠方向剥离，然后去除位于股四头肌起点处的脂肪垫。接着，切断连接髌骨的股四头肌腱。在股骨与股四头肌之间小心剪开肌腱膜，注意避免损伤股动脉。

然后在股骨起点处切断肌腱，以游离股四头肌，并将股四头肌放入预冷的PBS中。使用剪刀去除股四头肌表面可见的脂肪组织。清理干净后，将股四头肌翻转，使原本覆盖在股骨上方的肌肉部分朝上。

用镊子以扇形方式打开股四头肌。从每个叶中去除两块可见的红色肌肉部分，并将其放入含有五毫升冰冷线粒体分离缓冲液的烧杯中。

接下来，用尖头剪刀剪开跟腱表面的皮肤，并将皮肤向小鼠身体方向剥离。剪断暴露的跟腱，并将肌肉向小鼠身体方向剥离。在股骨的外侧和内侧髁处剪断肌腱，以分离腓肠肌，并将附着于其肌腱上的腓肠肌置于盛有冷PBS的培养皿中。

翻转腓肠肌，并剥离下方的比目鱼肌。将比目鱼肌放入盛有5 mL冰冷线粒体分离缓冲液的烧杯中。

接下来，取下一个风扇，切开腓肠肌并取出三块肉眼可见的红色肌肉部分。其中包括两块侧部的红色肌肉和一块中部浅层的红色肌条。分离后，将红色肌肉转移至含有5 mL冰冻线粒体的烧杯中。

缓冲液一的制备。从另一侧鼠腿中再取 75 至 100 毫克的红肌组织，重复上述操作过程。

将第二条腿中解剖得到的肌肉组织放入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液以及细胞裂解缓冲液的1.5毫升微量离心管中，缓冲液的配制方法见随附的文字版实验方案。立即用液氮对第二个样本进行速冻，以用于后续的蛋白质印迹分析。将一个预先加热至平整的塑料表面置于盛有冰的大桶中。

然后在塑料表面滴加一滴线粒体分离缓冲液一，用镊子将所有切好的红色肌肉组织放入分离缓冲液的液滴中。使用单刃剃刀片将肌肉组织切碎两分钟，每40秒更换一次新的锋利剃刀。将切碎的组织转移至含有5毫升新鲜线粒体缓冲液的新烧杯中。

加入缓冲液一进行分离。然后将溶液通过置于50毫升锥形管上的100微米细胞滤筛过滤。用柔软的擦拭纸轻轻吸去组织上的液体，再将组织转移至5毫升0.05%胰蛋白酶溶液中。

使用镊子将任务擦拭物上残留的任何组织取下，并加入胰蛋白酶中。将肌肉组织在冰上孵育于胰蛋白酶溶液中30分钟。然后在4°C条件下以200 × g离心样品3分钟。

离心后，将胰蛋白酶上清液倒入废液容器中，并用 3 毫升冰预冷的线粒体分离缓冲液一重悬沉淀。然后将组织转移至 45 毫升玻璃匀浆管中。用另外 1.5 毫升线粒体分离缓冲液一冲洗 15 毫升圆锥形离心管，以收集任何残留样品，并将此液加入玻璃匀浆管中。

接下来，将玻璃匀浆管放入一个装有半杯冰的烧杯或塑料容器中，使玻璃匀浆管在烧杯内移动最小。使用连接在电机驱动组织匀浆器上的聚四氟乙烯研杵对样品进行匀浆处理。

使用匀浆器以80 RPM转速匀浆10次。每次通过时在底部停留约两秒钟。然后将组织匀浆转移至新的15毫升锥形管中。

用6.5毫升线粒体分离缓冲液一冲洗玻璃匀浆管，将冲洗液倒入含有剩余组织匀浆的15毫升圆锥形离心管中。在4°C下以700 × g离心10分钟，然后小心将上清液倒入高强度玻璃离心管中，弃去沉淀。

接下来，在 4°C 条件下以 8,000 × g 离心 10 分钟。为沉淀线粒体，弃去上清液，缓慢加入 500 µL 线粒体分离缓冲液 2，剪掉移液器吸头的末端，用吹打和搅拌动作轻轻将沉淀在缓冲液中重悬。然后加入 4.5 mL 线粒体分离缓冲液。

向混合物中加入2号缓冲液。待沉淀完全重悬后，在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟，再次沉淀线粒体。弃去上清液S，用剪去尖端的移液枪头，每加入25 µL线粒体分离缓冲液2号，用移液枪头轻轻搅拌混匀，逐步且轻柔但彻底地重悬沉淀。

完成操作后，将该线粒体储备液置于冰上。用高纯度水对线粒体储备液进行两份独立的一比二十稀释。向其中一份样品中加入终浓度为0.1%的Triton 100×，并在低功率条件下超声处理10秒。

将另一份稀释液置于冰上，并将超声处理后的样品放回冰上。超声处理后，使用分光光度法，按照标准技术对未超声和超声处理的线粒体稀释液进行柠檬酸合酶活性检测，并根据随附文本方案中提供的公式计算线粒体膜完整性的百分比。线粒体的超声处理可导致柠檬酸合酶活性显著升高。

与超声处理的样品相比，未超声处理的线粒体样品中柠檬酸合酶活性显示，在线粒体分离后，92.5%的线粒体保持完整。在全组织裂解液中可明显检测到GA DH和COX IV的表达；而在分离的线粒体中仅观察到COX IV的表达，GA DH则仅有微弱条带。这些结果表明线粒体分离效果良好，分离过程中来自非线粒体组分的污染极少。

在进行该操作时，务必注意小心处理线粒体储备液，切勿涡旋震荡或剧烈混匀。还可采用其他方法，如检测活性反应物质的生成，以回答进一步的问题，例如某种干预措施是否影响分离线粒体中活性氧的产生。