Name: 研究微生物群落在体内:主机之间介互动的典范白色念珠菌和铜绿假单胞菌在航空 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 了解如何使用小鼠模型研究白色念珠菌与铜绿假单胞菌在呼吸机相关肺炎中的相互作用。该体内模型通过鼻内接种和支气管肺泡灌洗技术，揭示病原体间的免疫应答机制，为临床治疗提供具有临床相关性的数据。

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作者谨此致谢里尔大学和里尔巴斯德研究所，特别是负责动物饲养、繁殖安全与管理的 Thierry Chassat 和 Jean-Pierre Decavel。本工作得到法语感染病学会（Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française，SPILF）的支持。

该方法已获得动物实验区域伦理委员会批准，符合国家和国际关于实验研究中动物护理与使用的指南。
1. 样本采集
<ol>
	<li>样品储存
	<ol>
		<li>收集所有样品，并立即在 -20 °C 或冰上保存，直至转移至冷冻储存，以避免样品降解。将无菌磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上，以提高支气管肺泡灌洗（BAL）的操作效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>使用高压灭菌器对所有手术器械进行灭菌。 
		注意：如有可能，建议分别使用两套不同的器械进行腹部和胸部操作，以避免交叉污染。所需解剖器械详见图4A</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠、细菌和酵母菌株
<ol>
	<li>根据当地实验动物使用管理委员会指南，在通风笼架中饲养小鼠，每笼不超过5只，并提供食物和水 随意摄取，由于使用了生物安全等级2级的微生物，实验需在生物安全等级2级的设施中进行： P. aeruginosa 和 C. albicans</li>
	<li>将菌株保存在 -80 °C 的 40% 甘油培养基中。
	<ol>
		<li>使用10 µl接种环从冻存菌种中直接取菌，接种于含有3 ml无菌LB肉汤的培养管中，过夜培养&#160;37 °C下以轨道振荡（400 rpm）培养至接种前一天。</li>
		<li>以 2,000 × g 离心 5 分钟收集细菌。</li>
		<li>吸弃上清液至适当的密闭生物危害废物容器中。观察培养管底部的白色贴壁沉淀。</li>
		<li>用5 ml PBS洗涤并重悬沉淀。</li>
		<li>重复步骤 2.2.2 至 2.2.3，进行第二次洗涤。</li>
		<li>用1 ml PBS重悬菌体沉淀，并短暂涡旋振荡。</li>
		<li>使用光密度计在600 nm处通过光学密度测定仪确定接种物密度。密度为0.9时对应109 根据PAO1的CFU/ml，相应稀释。 
		注意：该结果需通过测定已校准接种物的连续稀释液的密度，针对每种使用的菌株分别获得。</li>
		<li>通过连续对倍稀释法验证接种物，取每种稀释液100 µl接种于溴百里酚紫琼脂（BCP）平板和过夜培养物上。每只小鼠经鼻腔给予50 µl含1 x 10的溶液8 至 2 × 108 每毫升菌落形成单位（5 × 106 至 1 × 107 每只小鼠的菌落形成单位（CFU）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 C. albicans 以SC5314作为参考菌株。将菌株保存于含40%甘油的培养基中，置于-80°C保存。
	<ol>
		<li>在酵母-蛋白胨-葡萄糖肉汤中添加0.015%阿米卡星，以避免细菌污染并便于后续计数。</li>
		<li>使用10 µl接种环将酵母接种至已添加阿米卡星的YPD液体培养基中，37°C过夜培养。</li>
		<li>通过离心收集酵母，2,000 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将上清液移除至适当的生物危害废物容器中。培养管底部应可见白色贴壁沉淀。</li>
		<li>用5 ml PBS洗涤菌体沉淀，并通过短暂涡旋重悬。</li>
		<li>重复步骤 2.2.2 至 2.2.3，进行第二次洗涤。</li>
		<li>用1 ml PBS重悬沉淀，并短暂涡旋振荡。</li>
		<li>使用标准显微镜在40倍放大倍数下，通过Mallassez血细胞计数板计数以确定接种物的浓度。 
		注意：浓度（CFU/ml）通过以下公式计算得出：（酵母数量 × 105)/(血细胞计数板上计数的网格方格数)</li>
		<li>通过连续对数稀释至10验证-5 和 10-6 以确认溶液中含有 2 x 106 CFU/ml</li>
		<li>在添加了0.015%阿米卡星的YPD琼脂平板上划线接种。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 气道定植由 C. albicans
注意：环境适应后，小鼠每天称重两次。
<ol>
	<li>在通风橱内，将 500 µl 七氟烷滴加到一块 4 cm × 4 cm 的纱布上（开放式滴加法）14。
	<ol>
		<li>立即将纱布放置于约 750 ml 诱导室底部，并在纱布上方放置一个带网格的抬高平台，以避免动物与纱布直接接触。</li>
		<li>盖紧密闭盖子，等待 1 至 2 分钟，使七氟烷在诱导室内充分扩散。</li>
		<li>将小鼠从笼子转移到网格平台上，然后盖上盖子。约 30 至 45 秒内应达到浅麻醉状态，同时保留自主呼吸。</li>
		<li>通过观察翻正反射消失来监测肌肉松弛情况，此时可将小鼠从诱导室中取出并进行滴注。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鼻内滴注（训练有素的操作者可在 10 秒内完成）。
	<ol>
		<li>单手握住小鼠，使其仰卧并保持直立姿势（图 4B）。</li>
		<li>用食指支撑头部，并用拇指保持下颌闭合，以防止溶液咳出（图 4C）。</li>
		<li>如步骤 2.3.8 所述，确保制备好的 C. albicans 溶液浓度为每毫升含 2 × 106 CFU，滴注体积为 50 µl。 
		注意：第二个关键点是滴注体积。若体积低于 50 µl，可能导致定植不足或气道分布不均；若体积过大，则可能引起溺水/窒息并导致死亡。</li>
		<li>将移液器靠近小鼠鼻孔，进行鼻内滴注。</li>
		<li>用移液器滴加 50 µl 溶液，在鼻孔处形成气泡，由自主呼吸的小鼠将其吸入。</li>
		<li>将小鼠置于恢复区域（例如，一个宽敞、通风良好且配有上方加热灯的空笼子）。必须持续监测小鼠直至完全苏醒。在小鼠恢复足够的意识、能够维持胸卧位并恢复翻正反射之前，不得无人看管。此时，可将小鼠放回正常的饲养笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. P. aeruginosa 诱导的急性肺部感染
注意：在接下来的四天内对小鼠进行称重。通常情况下，小鼠在白色念珠菌（C. albicans）介导的呼吸道定植期间体重会增加（图 2A）。
<ol>
	<li>在接种当天，经过过夜培养后（第2.2节），制备含有 P. aeruginosa 的菌悬液。</li>
	<li>采用吸入式七氟烷进行短暂麻醉，方法如上所述（第3.1节）。 
	注意：进行急性肺部感染实验时，推荐的细菌接种量见表1。</li>
	<li>按照上述方法进行小鼠接种（第3.2节），并特别注意接种后的恢复情况。</li>
</ol>
5. 肺损伤指数的测定
<ol>
	<li>配制含有FITC标记的白蛋白的溶液。在动物处死前2小时注射该溶液。
	<ol>
		<li>使用适当的设备称取0.2 mg的白蛋白-FITC。</li>
		<li>加入0.2 mg至1 ml PBS中。短暂涡旋。如不立即使用，需将溶液置于铝箔中以避免暴露于环境光下。</li>
		<li>每只小鼠腹腔注射 200 µl FITC 标记的白蛋白溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安乐死
	<ol>
		<li>记录小鼠的最终体重数据。</li>
		<li>根据当地实验动物使用委员会指南，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠对一只小鼠实施安乐死：注射300 µl浓度为5.47%的戊巴比妥钠。</li>
		<li>将小鼠从笼中取出，由操作人员实施致死注射。</li>
		<li>注射后，将小鼠单独转移至另一笼具，避免与其他动物接触。观察小鼠直至其完全停止活动。通过观察无任何运动（特别是呼吸运动）及无脉搏来确认死亡。</li>
		<li>对死亡动物进行手术取样，因此无需使用麻醉剂或镇痛剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外科样本采集：胸部阶段 
	注意：为维持无菌条件，所有手术均在生物安全二级环境中使用无菌器械进行。
	<ol>
		<li>用乙醇擦拭皮肤。使用剪刀从胸骨沿中线至腹部中段做一皮肤切口。从中线分别沿两侧肋骨边缘切开。将胸部两侧的皮肤向后翻开，以暴露肋骨。</li>
		<li>在肋骨两侧各做一个垂直切口，向上延伸至锁骨，以便将包含胸骨的整个前胸壁向后翻折，从而充分暴露心脏和肺部图5A、5B).</li>
		<li>使用预加肝素的注射器穿刺心室间动脉附近的心脏部位采血，采集量不少于500 µl&#160;以获得至少 100 µl 血浆。将血液样本置于冰上。</li>
		<li>做颈部正中切口以暴露气管（图5B和5C). 仔细解剖气管周围的筋膜。在气管后方放置一根缝线（图5C和5D随后将缝线在插管针周围结扎，以确保灌洗到位。</li>
		<li>使用20号改良灌胃针对气管进行插管图5D和4A用先前放置的缝线在套管化的气管周围打一个外科结。</li>
		<li>进行支气管肺泡灌洗（BAL）时，将500 µl预冷的PBS缓慢且逐步地注入肺部，随后抽出。将样本置于冰上，以避免细胞裂解。</li>
		<li>重复步骤 5.3.6，共 3 次，以获得总量为 1,500 µl 的 BAL 液体，并将灌洗样本汇集至一个 2 ml 离心管中图5E).</li>
		<li>从胸腔中取出肺组织，取一段肺组织（大小应相当于一侧肺的一半或一个肺叶）放入1.5 ml离心管中，迅速置于-80°C保存。</li>
		<li>将肺组织片段置于预先称重并含有磷酸盐缓冲液（PBS）的溶血管中，用于测定细菌载量，并置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外科样本采集：腹部阶段
	<ol>
		<li>在腹部左侧再做一个切口。通过腹膜观察脾脏。</li>
		<li>取出脾脏并放入含有1 ml PBS的第二个溶血管中，置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺损伤指数 
	注意：通过检测血管腔室向肺泡-间质腔室渗漏的FITC标记白蛋白，评估肺泡-毛细血管膜通透性。
	<ol>
		<li>离心血液样本和支气管肺泡灌洗液，1,500 × g 离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中。沉淀物为募集的血浆或支气管肺泡灌洗细胞，应置于冰上。</li>
		<li>向96孔透明板（300 µl 孔）中每孔加入100 µl血液上清液（血浆，黄色）或BAL上清液。若不立即使用，用铝箔覆盖板。</li>
		<li>使用荧光微孔板读数仪（激发波长487 nm，发射波长520 nm）测定血浆和支气管肺泡灌洗液上清中的荧光水平。</li>
		<li>通过计算荧光强度比值 [(BAL 上清液/血液上清液) × 100] 确定肺损伤指数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞分类计数 
	注意：使用步骤 5.5.1 中通过离心 BAL 液体获得的细胞沉淀。
	<ol>
		<li>如有需要，使用红细胞裂解缓冲液。向含有细胞沉淀的离心管中加入 500 µl 红细胞裂解缓冲液，短暂涡旋混匀，冰上孵育 10 分钟。加入 500 µl PBS 以终止红细胞裂解。</li>
		<li>通过离心（1,500 × g，10 分钟）收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 ml 无菌 PBS 中。使用 Malassez 血细胞计数板对细胞进行计数。. 使用血细胞计数板计数细胞。使用细胞离心涂片机将细胞浓缩至载玻片上。</li>
		<li>使用染色试剂盒对细胞进行染色，以识别和计数细胞（巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺部细菌载量及细菌播散 
	注意：为评估肺部细菌载量及细菌播散情况，分别采集肺脏和脾脏组织，置于预先称重并含有1 ml PBS的溶血管中（步骤5.3.9）。
	<ol>
		<li>称量含有1 ml PBS的溶血管，管内分别加入肺组织或脾组织。使用组织匀浆器匀浆样品，得到肺组织匀浆液和脾组织匀浆液。</li>
		<li>将100 µl组织匀浆液加入含有900 µl无菌PBS的离心管中，制备系列对数稀释液。</li>
		<li>接种最后两个适当稀释的样品（10-3 和10-2) 在 BCP-琼脂上 P. aeruginosa 或添加阿米卡星的YPD琼脂 C. albicans 肺和脾脏载菌量测定</li>
		<li>37 °C 培养过夜。次日计数平板上的菌落。</li>
		<li>将结果按肺脏重量进行标准化，以获得每克肺组织的菌落形成单位（CFU）。由于肺组织样本大小不同，结果应以每克肺组织的CFU表示。 
		指数的计算公式为：[CFU] × [溶血管与肺组织的重量] - [溶血管的重量]。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

动物模型，尤其是哺乳动物模型，在免疫学领域研究宿主与病原体之间复杂相互作用机制方面具有重要价值。当然，只有当所需信息无法通过其他方法获得时，才必须使用动物模型；否则，应以体外（in vitro）模型替代动物实验。本动物模型所展示的研究视角，唯有通过动物模型才能实现，因为病原体之间的相互作用是由宿主多组分免疫反应所介导的。目前用于研究此类宿主-病原体相互作用的小鼠通常为6至10周龄的年轻成年个体，其免疫系统已发育成熟且未受干扰。在专注于先天性免疫反应的研究时，优先选用C57Bl6/J品系背景的小鼠。为避免性别及激素周期（特别是雌激素）对免疫反应的影响，雄性小鼠是最佳选择。为达到统计学显著性，实验结束时每组至少应包含5只个体，但正如所有动物实验指南所建议的那样，应将动物使用数量减少并优化至绝对最低限度。
从提供动物的繁育单位运输到研究机构会对小鼠造成应激。其后果是促炎性细胞因子分泌增加，可能影响后续实验（如我们的实验）的结果。此外，新的环境和新的&#34;笼内同伴&#34;也会加剧应激反应。因此，小鼠在进入新饲养环境后，必须至少适应七天才能开始实验。该饲养环境需严格控...

动物模型，尤其是小鼠，已被广泛用于研究针对病原体的免疫反应。尽管啮齿类动物与人类在先天性和获得性免疫方面存在差异7，但由于小鼠繁殖简便，且可针对大量基因构建基因敲除模型，因此成为研究免疫反应的优良模型8。免疫反应十分复杂，是病原体、定植微生物群以及多种免疫细胞（如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞）和非免疫细胞（如上皮细胞、内皮细胞）相互作用的结果2。体外研究无法观察这些复杂的相互作用，主要局限于单一细胞与病原体之间的相互作用。尽管动物模型必须谨慎使用，并仅限于特定且相关性高的科学问题，但小鼠模型仍能有效揭示哺乳动物在体内的免疫反应特征，并有助于解答某些重要的临床问题7。
在呼吸道中，微生物群落结构复杂，包含大量不同的微生物6. 虽然什么构成一个 &#34;正常&#34; 气道微生物组的具体构成仍有待明确，定植的微生物群落常为多菌种共存，且来源于多种不同的生态来源。患有化脓性慢性肺病（如囊性纤维化、支气管扩张）或接受机械通气的患者，由于环境来源的微生物定植气道，表现出特定的菌群特征。9. 铜绿假单胞菌 和 白色念珠菌 均为问题病原体5，常从气管支气管样本中共同分离获得，并可导致这些患者发生严重的机会性感染，尤其在重症监护病房（ICU）中4.
在重症监护病房（ICU）中急性肺炎期间分离到这些微生物时，通常会针对P. aeruginosa进行抗微生物治疗，但酵母菌通常不被认为在此部位具有致病性5。体外研究表明 P. aeruginosa 与 C. albicans之间存在广泛相互作用，显示这些微生物可相互影响彼此的生长与存活，但相关研究尚无法确定C. albicans的存在对宿主是有害还是有益10。已有小鼠模型被用于探讨P. aeruginosa&#160;和C. albicans&#160;在体内的相关性，但微生物之间的相互作用并非这些研究的重点。实际上，该模型的建立旨在评估C. albicans在宿主免疫反应及疾病转归中的作用。
Roux 等人先前建立的模型已采用先用C. albicans进行初始定植，随后通过P. aeruginosa诱导急性肺部感染的方法。利用该模型，作者发现先前的C. albicans定植具有不利作用11。然而，Roux 等人在其模型中使用了高负荷的C. albicans，即连续3天每天给予每只小鼠2 × 106 CFU。我们建立了一种持续4天的C. albicans气道定植模型，或至少是无肺损伤情况下的持续存在模型。在该模型中，单次给予每只小鼠105 CFU后，可在长达4天内回收到C. albicans（图2B）12,13。4天后，未观察到炎性细胞募集、炎性细胞因子产生或上皮损伤的证据。在24–48小时，即C. albicans存在的高峰期，尽管观察到了细胞和细胞因子介导的先天免疫反应，但仍无肺损伤迹象。令人意外的是，与仅感染P. aeruginosa的小鼠相比，在鼻内接种P. aeruginosa前48小时已定植C. albicans的小鼠其感染程度减轻。事实上，这些小鼠表现出较轻的肺损伤和较低的细菌负荷12,13。
多种假说可以解释先前定植所产生的这种有益效应 C. albicans 开启 P. aeruginosa介导的急性肺部感染。首先，涉及各微生物群体感应系统的种间交叉对话，基于高丝氨酸内酯的 P. aeruginosa 系统和基于法尼醇的 C. albicans 系统进行了评估。其次， 白色念珠菌 作为 &#34;诱饵&#34; 铜绿假单胞菌的靶点研究旨在使该病原体偏离肺上皮细胞，但这两个假设均被否定（未发表数据）。第三个假设是 &#34;引物&#34; 先天免疫系统的 C. albicans 负责增强后续对病原体的先天免疫反应 P. aeruginosa这一假设最终得到了证实。事实上 C. albicans 定植通过主要由天然淋巴细胞分泌的IL-22引发先天免疫的预激活，从而增强细菌清除能力并减轻肺损伤12.
总之，宿主是微生物与先天免疫反应相互作用过程中的核心参与者，并涉及多种炎症细胞类型。尽管这些复杂的免疫相互作用可以被解析 体外 最初的假设只能由适当的 在&#160;体内 模型。以下方案提供了一个示例 在体内 宿主介导的病原体相互作用研究，可推广至其他微生物。

<table><tbody><tr><td>七氟烷，七氟醚</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml 塑料瓶</td></tr><tr><td>荧光读板仪 Mithras&amp;nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>参考第一列</td><td>无备注</td></tr><tr><td>溴甲酚紫琼脂</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>每单位 20 次使用</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml 塑料瓶</td></tr><tr><td>双头阀&amp;nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>无备注</td></tr><tr><td>无菌接种环 10 &amp;micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>每 1,000 个包装</td></tr><tr><td>胰岛素注射器 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>每 100 个包装</td></tr><tr><td>双位培养管 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>无备注</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&amp;nbsp;</td><td>通用电气生命科学</td><td>80-2116-30</td><td>无备注</td></tr><tr><td>溶血试管 13 x 75 mm&amp;nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>每 100 个</td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>500 ml 包装</td></tr><tr><td>阿米卡星 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>每 10&amp;nbsp;支</td></tr><tr><td>肝素 10,000 UI/2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>每单位 10 支</td></tr><tr><td>RAL 555 染色试剂盒</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 瓶，每瓶 100 mL</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>透明 300 &amp;micro;l 96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>无备注</td></tr><tr><td>酵母-蛋白胨-右旋糖肉汤</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>荧光素异硫氰酸酯标记白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Luria Bertani Broth）</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>粉末状</td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>Terumo 或 unisharp</td><td>A231</td><td>每 100 个包装</td></tr><tr><td>细胞离心涂片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>无备注</td></tr></tbody></table>

研究微生物群落 体内宿主介导的相互作用模型 白色念珠菌 和 铜绿假单胞菌 在气道中

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

研究宿主-病原体相互作用有助于我们理解微生物感染过程中致病性的潜在机制。宿主的预后取决于针对病原体所启动的适应性免疫反应1。免疫反应十分复杂，是病原体与多种免疫或非免疫细胞类型相互作用的结果2。体外研究无法全面表征这些相互作用，通常仅聚焦于细胞与病原体之间的相互作用。此外，在呼吸道3，特别是在患有化脓性慢性肺病或接受机械通气的患者中，存在多微生物群落，使宿主-病原体相互作用更加复杂。铜绿假单胞菌和白色念珠菌均为重要的问题病原体4，常从气管支气管样本中分离得到，并与严重感染相关，尤其在重症监护病房患者中更为显著5。已有报道指出这两种病原体在体外存在微生物间的相互作用，但这些相互作用的临床意义仍不明确6。为研究C. albicans与P. aeruginosa之间的相互作用，本研究建立了一种小鼠模型，先诱导C. albicans在呼吸道定植，继而引发P. aeruginosa介导的急性肺部感染。

如先前在实验方案描述中所述，本实验需要5天时间完成（图1：实验时间线）。整个实验过程中需配备一名操作人员，其最多可处理10只小鼠。若需要更多动物，则需两人协作，尤其是在手术取样阶段。这是因为所有样本必须在2小时内完成采集，以避免在最后处理的小鼠中出现FITC标记的白蛋白经肺泡-毛细血管屏障被动渗漏增加的情况。
第一步是制备C. albicans接种物并通过鼻内接种建立C. albicans的呼吸道定植。通过每只小鼠鼻内接种5 × 105 CFU的C. albicans，可建立持续4天的定植模型（图2B）。在此4天期间，小鼠体重增加（图2A），且接种5×105 CFU不会引起肺损伤（图2C）。尽管在此模型中C. albicans可定植长达4天，但其定植量在48小时后开始下降。因此，在C. albicans定植48小时后...

尽管 体外 宿主-病原体相互作用的研究有助于表征特定的免疫应答， 体内 需要使用模型来观察复杂反应的影响。 白色念珠菌 暴露后 铜绿假单胞菌-介导的肺部感染，我们建立了一种用于研究呼吸机相关性肺炎致病过程中微生物相互作用的小鼠模型。

研究宿主与病原体相互作用有助于我们理解微生物感染过程中致病性的潜在机制。疾病的预后……

本实验的总体目标是建立一种模型，用于研究单个细菌与单个真菌之间的相互作用。该方法有助于回答病原体互作领域中的关键问题，例如哪些因素参与了跨物种交流及种间“对话”。该技术的主要优势在于，由此体内模型所产生的数据具有临床相关性。为了进行真菌的鼻内接种，首先将每毫升含有两乘以十的六次方个菌落形成单位的白色念珠菌用无菌磷酸盐缓冲液稀释。接着，在确认成年低张力小鼠已丧失翻正反射后，用200微升移液器吸取至少50微升的真菌悬液。然后，用一只手抓住小鼠，将其翻转，使其仰卧，腹部朝上。当小鼠处于合适位置时，用握持小鼠的手的食指托住其头部，拇指固定下颌使其闭合，将移液器枪头移至靠近小鼠鼻部的位置。然后，小心地将50 µL真菌液滴加至小鼠鼻孔处，使液滴随小鼠的自主呼吸吸入体内。随后将小鼠单独放置于笼中，直至其完全恢复。在接种白色念珠菌4天后，剃除安乐死动物的腹部毛发，随后用乙醇对暴露的皮肤进行消毒。接着，用剪刀从胸骨处沿中腹部切开皮肤。然后，沿中线两侧的肋骨区域延长切口，并将胸廓两侧的皮肤向外翻开。当可见肋骨时，在胸部两侧向锁骨方向做垂直切口，利用胸骨将整个前胸壁向后倾斜，以暴露心脏和肺。然后，使用预先用肝素处理过的注射器，在室间动脉旁穿刺心脏，抽取至少500微升血液。将血液样本置于冰上。然后，沿颈部正中做一切口以暴露气管。仔细分离气管周围的筋膜，随后在气管下方穿过一根缝线。接着使用20号改良灌胃针进行气管插管，并用预先放置的缝线固定套管。进行支气管肺泡灌洗时，将500微升预冷的PBS轻柔地注入肺部。然后吸出灌洗液，并将液体转移至预冷的2毫升离心管中。在收集另外两份500微升的灌洗液样本后，取出肺组织，并取一小块肺组织放入1.5毫升离心管中，立即于-80摄氏度保存。然后，将另一块肺组织放入预称重的含有 PBS 的溶血管中，并置于冰上。最后，在腹部左侧做一切口，取出脾脏放入第二个含有 1 毫升 PBS 的溶血管中，并将该管置于冰上。通过鼻内接种每只小鼠五乘十的五次方CFU的白色念珠菌，可建立持续四天的模型。在这四天期间，小鼠体重增加，但未表现出肺损伤。然而，随着接种菌量CFU的增加，肺损伤也随之加重。感染后24至36小时观察到肺损伤程度最严重。相比之下，细菌负荷每24小时下降1个对数单位（CFU/毫升），且每日观察到细菌播散程度逐渐累积增加。从感染小鼠获取的支气管肺泡灌洗液中可见大量中性粒细胞被募集，细胞分类计数显示，浸润的免疫细胞群体中90%为中性粒细胞，10%为巨噬细胞和淋巴细胞。完成此操作后，还可采用其他方法，如支气管肺泡灌洗液分析，以进一步探究炎症反应的特征。观看本视频后，您应能够充分掌握如何建立铜绿假单胞菌的定植模型。请务必注意，操作发光型念珠菌时可能存在极高风险，因此在进行该操作时，必须始终采取预防措施，例如穿戴防护装备，以避免液滴污染。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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来源：Montefusco-Pereira, C. V. 等. 铜绿假单胞菌...

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Candida albicans 在小鼠体内的生物膜形成模型

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长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

我们描述了一种用于感染气道的三维共培养模型的实验方案，该模型在气液界面处建立，使用CFBE41o-细胞、THP-1巨噬细胞和Pseudomonas...

P. aeruginosa 感染的支气管上皮细胞与巨噬细胞在气液界面的三维共培养模型用于抗感染药物的临床前评价

我们建立了一种与C.albicans相关的导管相关性感染（CRI）小鼠模型，该模型中导管表面可形成生物膜，且C.albicans与宿主之间的相互作用与临床CRI具有良好的相关性。该模型有助于筛选针对C.albicans生物膜相关CRI的治疗方法，为临床转化奠定基础。...

小鼠导管相关性Candida albicans感染模型

本方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。aPDT 采用水溶性姜黄素类化合物混合物结合蓝光 LED...

姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

本方案描述了一种与囊性纤维化（CF）肺部相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探究细菌种间相互作用的影响。...

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

该方法可用于建立囊性纤维化中的多微生物生物膜模型，以供科研和临床实验室进行抗菌敏感性测试。该模型在多种检测指标下均能提供准确且可靠的结果。...

开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

本研究概述了一种构建多微生物聚集性生物膜模型的框架，并优化了RNA提取方案，以评估反映囊性纤维化肺部环境的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

用于研究感染相关基因表达的囊性纤维化聚集生物膜模型

本方案提供了利用地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）作为模式系统研究真菌感染过程中宿主-病原体相互作用的优化且详细的指南。该方法在先前使用人类真菌病原体感染涡虫的实验流程基础上进行了改进。...

一种优化的实验方案 Candida albicans 感染在 Schmidtea mediterranea 研究真菌致病机制与宿主防御

了解如何使用小鼠模型研究白色念珠菌与铜绿假单胞菌在呼吸机相关肺炎中的相互作用。该体内模型通过鼻内接种和支气管肺泡灌洗技术，揭示病原体间的免疫应答机制，为临床治疗提供具有临床相关性的数据。

研究微生物群落体内宿主介导的相互作用模型白色念珠菌和铜绿假单胞菌在气道中

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