在生理体外模型和病理血流应用的血管细胞重塑调查

以下实验的总体目标是观察不同脉动血流病理对内皮细胞的影响。体外研究。这是通过首先对载玻片进行化学处理并用蛋白质包被以确保细胞在流式细胞暴露过程中的附着来实现的。

作为第二步，确定流速的脉动指数，这允许将体外流速与文献中描述的值进行比较。接下来，将位于细胞的载玻片连接到流式系统，以测量细胞对流式病理的反应。结果显示，使用光学显微镜和免疫荧光染色，基于流速曲线的形态和蛋白质表达发生变化。

与蠕动泵或脉动泵相比，该技术的主要优点是能够调节流量脉动以模拟患病或健康的反应。这可以帮助回答动脉疾病领域的关键问题。首先，将尺寸为 75 毫米 x 50 毫米 x 1 毫米的新载玻片放入干净的载玻片染色皿中。

然后加入足够的 20% 硫酸溶液，使载玻片完全浸入，并在第二天将它们在酸溶液中孵育过夜。将玻片浸入新鲜的去离子水中 5 分钟，每次洗涤玻片 3 次。冲洗后，将玻片浸入丙酮中 30 分钟，然后在 6%三氨基丙基三氧基粥基粥烷的丙酮溶液中过夜。

接下来，用纯丙酮冲洗玻片 3 次，每次洗涤后更换丙酮 5 分钟。然后在去离子水中洗涤玻片 3 次，每次洗涤 5 分钟，每次洗涤后更换去离子水。接下来，将玻片浸入 1.5% 戊二醛中，并浸没 60 分钟。

交联后，用去离子水洗涤玻片两次，每次洗涤后更换去离子水，然后将玻片放入 70% 乙醇中 30 分钟进行消毒。去除乙醇，让任何残留的残留物从载玻片上蒸发。干燥后，将载玻片短暂放入无菌去离子水中，使其重新水化。

接下来，取下载玻片支架并将其放入 100 毫米 x 100 毫米见方的培养皿中。在层流罩中，用 1 毫升 25 μg/mL 纤连蛋白溶液包被功能化玻片，覆盖将暴露于细胞培养室的大致区域。然后盖上培养皿，将载玻片在 37 摄氏度下孵育 1 到 2 小时孵育孵育后，吸出剩余的溶液，并将 600， 000 个内皮细胞接种在一毫升含 10%FBS 的 DMEM 中，接种到载玻片的涂层面上。

盖上腔室，然后将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 120 分钟。然后用额外的培养基覆盖细胞并继续孵育，直到它们达到 70% 至 80% 汇合。按照随附文本协议中的说明连接流路，如此处所示，确保阻尼室和超声波流量计布置在正确的流向。

接下来，用去离子水填充流量、回路和储液罐。确保储液槽出口管浸没在储液槽体积内。然后使用流量计可视化流量波形。

打开阻尼室上的放气阀以改变流体与空气的体积比。以不同的液位间隔关闭放气阀并计算脉动指数。要计算指数，请评估流量波形，因为峰值表示 VM 最大值。

波谷代表 v min 值，V 平均值是信号记录的平均值。笔记本中的脉冲指数值。使用毡尖永久性墨水笔在阻尼室上标记所得的液位和脉动指数，以备将来使用。

在准备流动室预热时，从随附文本方案中引用的病理文献中确定所需的搏动指数水平。在 37 摄氏度的水浴中补充 1% FBS 的 DMEM。一旦细胞包被的载玻片达到 70% 至 80% 汇合，从培养基中取出其中一张，并在细胞固定侧的顶部放置垫圈。

接下来，将流通室的真空通道与垫圈上的孔对齐。然后将真空管连接到真空端口，确保没有介质泄漏到真空中。将聚碳酸酯板放在载玻片下方，并在流通室的每个短边上用一个弹簧夹夹住流通室组件，沿流通室的长边用两个弹簧夹夹住。

接下来，将流通室、入口和出口连接到流动回路。将流动系统置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中，并通过用介质填充储液罐并以低脉动泵入，用预热介质填充回路。保持此流程 4 小时以预处理细胞。

然后将阻尼室中的液体体积调整到预先标记的脉动指数水平并培养。所需持续时间的单元格。此处显示的内皮细胞是无流、稳流和脉动流的培养细胞。

暴露于高脉动流 24 小时后，可以看到形态变化从典型的内皮细胞形态转变为更像纺锤体的形态。而静态流和稳态流在形态上几乎没有差异。平滑肌细胞也受到与暴露于高脉动流的内皮细胞共培养的影响，如不同水平的 α 平滑肌肌动蛋白和肌球蛋白重链所示。

在不同的流动条件下，暴露于脉动流动的细胞显示出两种蛋白质的最大量，这表明肥大和收缩。在尝试此程序时，请务必记住保持所有密封件并确保此程序后液位保持不变。可以进行其他方法，例如内皮细胞、血管细胞共培养，以回答其他问题，例如细胞间相互作用。

看完这个视频，你应该对如何组装流路、控制指标以及将内皮细胞暴露在脉动流中有了很好的了解。