Name: 病原生物膜利用工程定额淬Lactonases防有毒中断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学习利用群体感应淬灭内酯酶在体外环境中破坏病原菌生物膜的方法。该技术通过直接添加工程化GKL酶，有效减少A.baumannii S1的致病性，为开发新型抗菌治疗策略提供重要依据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了新加坡教育部学术研究基金、国家医学研究理事会和国家研究基金会资助项目的资助。

1. 结晶紫定量法检测生物膜形成 A. baumannii S1
<ol>
	<li>在30 °C、220 rpm的摇床培养箱中，用5 ml的LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L）培养A. baumannii S1菌株，培养16小时。</li>
	<li>将A. baumannii S1菌液调整至OD600为0.8。使用96孔板，将菌液以1:100的比例接种至新鲜LB培养基中，并加入10 µl纯化的GKL酶（40 mg/ml），每孔终体积为100 µl。</li>
	<li>同时制备对照组培养物，该组不添加任何酶。重复上述操作以获得所需数量的重复样本。</li>
	<li>用盖子盖好96孔板，并将其放入密封的10 L塑料容器中，在30 °C下孵育3小时后，轻轻移除培养基。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl新鲜LB培养基，继续在30 °C下孵育21小时。</li>
	<li>第二次孵育结束后，轻轻移除所有培养基，用200 µl无菌水清洗浮游细菌细胞，清洗过程中应尽量减少对细胞的扰动。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl 1%结晶紫溶液，在室温下孵育15分钟。用200 µl无菌水清洗孔板以去除结晶紫溶液，重复清洗三次。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl 33%乙酸溶液，在轻微振荡条件下孵育15分钟，以溶解染料。</li>
	<li>通过测定600 nm波长处结晶紫的吸光度来定量生物膜的形成量。结晶紫的量与形成的生物膜量成正比。</li>
</ol>
2. A. baumannii S1 生物膜的共聚焦激光扫描显微镜观察
<ol>
	<li>培养5 ml的菌液 A. baumannii S1 在 LB 中，30℃ &#176;在摇床培养箱（220 rpm）中于37°C培养16小时。</li>
	<li>调整培养物 A. baumannii S1 至目标 OD600 0.8。使用35 mm玻璃底培养皿 &#181;- 培养皿，将细菌培养物（1:100 稀释）接种至含 30 的新鲜 LB 培养基中 &#181;1 毫升纯化的 GKL 酶（40 毫克/毫升）；新培养体系的终体积为 1 毫升。</li>
	<li>覆盖 &#181;-将培养皿盖好并放入密封的10 L塑料容器中。孵育 &#181;- 在30℃下培养 &#176;C孵育3小时后，轻轻移除培养基。加入30 &#181;1 ml 纯化的 GKL 酶和新鲜培养基，总体积为 1 ml。在 30 ℃ 下继续孵育 21 小时 &#176;C.</li>
	<li>重复步骤 2.3 并孵育 &#181;- 在30℃下再培养24小时 &#176;C. 然后，轻柔地移除培养基。</li>
	<li>加入500 &#181;5 分之 1 &#181;g/ml Alex Fluor 488 标记的麦胚凝集素（WGA）溶于 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中 &#181;- 将培养皿置于37℃培养箱中孵育 &#176;C 孵育 30 分钟；此步骤将对形成的生物膜进行染色。移除染色液并清洗生物膜 &#181;-加入2 ml HBSS的培养皿中。重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>加入500 &#181;l 3.7% 甲醛溶于HBSS中，37℃孵育 &#176;C 孵育 30 分钟；此步骤可将生物膜固定于 &#181;- 培养皿。清洗 &#181;用 2 ml HBSS 洗涤一次，然后完全去除溶液。 &#181;- 形成生物膜的培养皿可在4℃避光保存 &#176;C 在共聚焦激光扫描显微成像之前。</li>
	<li>对于共聚焦激光扫描显微镜成像与分析，使用63倍放大倍数，以0.21的间隔生成每幅图像97个光学切片 &#181;每堆 m 个。</li>
</ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在两组实验中，A. baumannii S1 均在不含 NaCl 的 LB 培养基中培养，因为高盐浓度可能会减少细菌形成的生物膜量15。此类人为因素的存在可能低估生物膜的形成量，以及不同处理条件下群体感应淬灭酶的作用效果。使用无催化活性的酶作为阴性对照至关重要，可排除酶对信号分子的非特异性结合（隔离）可能带来的影响。图1显示，即使无活性的酶能够结合群体感应分子，生物膜的形成也不会受到干扰。
A. baumannii S1 在 96 孔板孔内气液界面处形成精细的环状生物膜结构。因此，在去除培养基和洗涤过程中必须避免过度震荡，以防意外去除细菌生物膜。每次孵育后均需移除 LB 培养基，以清除浮游细胞。此外，将 96 孔板置于 10 L 塑料容器中，以减少气流扰动，并创造有利于生物膜形成的微厌氧环境。在 96 孔板中对生物膜进行定量时，还取决于每孔中加入的结晶紫染料的量。若某孔中加入过量结晶紫，可增加洗涤次数。结晶紫染色实验可对群体感应淬灭在生物膜破坏中的效率进行相对比较。尽管结晶紫染色法在测量生物...

由于多重耐药细菌的迅速增加，且这些细菌对多种抗生素具有耐药性，使得感染性疾病的治疗选择变得复杂1。由耐药菌引起的感染具有较高的发病率和死亡率，因此迫切需要加快药物开发进程，和/或探索更有效的抗菌替代方案，以改善治疗选择。近年来，抗毒力策略因其可通过非杀菌方式抑制细菌毒力，从而降低耐药机制出现的风险，正受到越来越多的关注2。
群体感应是细菌毒力的“主控开关”，干扰这种信号传导现象是一种有前景的抗毒力策略，可用于对抗病原体致病过程3。毒力的启动需要在细菌达到临界种群密度后，群体感应分子在胞外环境中积累。当这些分子扩散回胞内时，会与其对应的受体结合，从而激活毒力因子以及与抗生素耐药性和生物膜形成相关的基因4。通常，群体感应干扰的作用机制是抑制群体感应分子与其受体的相互作用，而不影响细菌的主要代谢通路。因此，该策略对细胞生长无直接抑制作用。由于未对细菌适应性造成压力，细菌对此类治疗产生耐药性的选择压力极小5。此外，群体感应干扰还可破坏细菌固有的保护机制，例如生物膜的形成，而生物膜可使细菌免受抗菌剂和宿主免疫反应的攻击。
据估计，地球上99%的微生物以复杂的类似生物膜的基质形式存在，这种结构为其中的微生物提供了关键的生存优势6。更重要的是，这些固着群落的形成是大多数持续性和慢性医院获得性感染的根源7。Acinetobacter baumannii 是与全球范围内医院获得性感染相关的主要人类病原体之一，其毒力主要归因于群体感应介导的生物膜形成8。群体感应淬灭酶已被成功用于通过靶向一类称为N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的化合物来干扰群体感应介导的信号转导，这类化合物由革兰氏阴性菌产生9。多项研究还进一步拓展了这些酶的应用，通过减少生物膜中毒力因子的表达和细菌数量来阻断细菌致病过程10,11。然而，目前仍缺乏对群体感应淬灭酶在抑制病原细菌生物膜形成方面有效应用的切实示范。已有研究尝试使用群体感应抑制剂（AHL类似物）而非群体感应淬灭酶来干扰A. baumannii生物膜的形成12。尽管使用小分子抑制剂是一种有效的方法，但在转化应用中维持其生物可利用性仍具挑战性。相比之下，使用催化性的群体感应淬灭酶可能规避生物可利用性问题，因为酶更易于在生物医学装置表面固定化，从而实现治疗效果。
本文介绍了一种利用结晶紫染色法和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估来自Geobacillus kaustophilus（GKL）的工程化群体感应淬灭乳酸内酯酶13对细菌生物膜形成影响的方法。该研究首次成功证明了利用群体感应淬灭酶可破坏临床相关性A. baumannii S1菌株的生物膜。本研究所描述的方法可用于评估其他群体感应淬灭酶在后续针对致病性革兰氏阴性菌的治疗开发中的有效性。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Lab-Scan</td><td>PLA00654X</td><td>注意：易燃</td></tr><tr><td>&amp;mu;-皿</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的 WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>注意：腐蚀性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT 微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用工程化群体感应淬灭乳糖酶抗毒力破坏致病性生物膜

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

多重耐药细菌的迅速出现加剧了对新型治疗手段的需求，以应对威胁生命的感染。细菌感染的持续存在通常与群体感应介导的生物膜形成有关。因此，干扰这一信号通路成为一种有吸引力的抗毒力策略。已有研究报道，群体感应淬灭乳清酸内酯酶可有效破坏群体感应回路。然而，关于这些酶在抑制细菌生物膜形成方面有效应用的报道仍极为少见。本实验方案描述了一种利用基因工程改造的群体感应淬灭乳清酸内酯酶，抑制临床相关 A. baumannii S1 菌株生物膜形成的方法。Acinetobacter baumannii 是一种重要的人类病原体，与全球范围内严重的医院获得性感染密切相关，其致病性主要归因于其生物膜的顽固性。经基因工程改造的乳清酸内酯酶处理后，显著减少了 A. baumannii S1 的生物膜形成。本研究还表明，未来有望利用基因工程改造的群体感应淬灭酶治疗由生物膜介导的细菌性疾病。最后，该方法也可用于评估具有潜力的群体感应淬灭酶的效能。

在结晶紫定量实验中，使用了两种群体感应淬灭酶来验证其干扰生物膜形成的可行性：野生型 GKL 和一种改良的 GKL 双突变体（E101G/R230C）。这两种酶均已被证明对 A. baumannii S1 所使用的主要群体感应分子 3-羟基-癸酰-L-高丝氨酸内酯（3-OH-C10-HSL）具有内酯酶活性14。为了有效评估生物膜的破坏情况，实验中还同时包含了各自对应的催化失活突变酶（此前已证实这些突变体不会结合 AHL 配体）作为直接对照（GKL D266N 突变体和 GKL E101G/R230C/D266N 突变体）。除了使用野生型 A. baumannii S1 外，还检测了 ΔabaI 突变株（缺乏 AHL 合成酶）的生物膜形成能力。结果显示，两种群体感应淬灭酶——野生型 GKL 和 GKL E101G/R230C 突变体——均能显著降低经预处理的 A. baumannii S1 培养物中的生物膜形成（n = 10；p 值 ≤ 0.0001）（<str...

群体感应淬灭酶是一种抗毒力和抗细菌的策略，可通过抑制毒力因子以及与抗生素耐药性和生物膜形成相关基因的表达，在不引发耐药性风险的情况下减轻病原性。在本研究中，我们报告了一种方法，用于验证群体感应淬灭酶在细菌生物膜破坏中的有效性。

多重耐药细菌的迅速出现加剧了对新型治疗手段的需求，以应对威胁生命的感染。

本实验的总体目标是证明群体感应淬灭酶在细菌生物膜破坏中的有效性。该方法将有助于回答抗菌治疗领域的关键问题，并帮助理解群体感应淬灭型内酯酶对生物膜环境中致病菌的作用。该技术的主要优势在于，群体感应淬灭内酯酶可直接添加至体外环境中。因此，其对生物膜破坏的效果可轻松进行定量分析。本实验操作由本实验室技术员 Terrence Tay 示范。首先，在摇床培养箱中，于 30°C 条件下，在 LB 培养基中培养 5 毫升 A.baumannii S1 菌液，培养 16 小时。将菌液调整至 OD 600 为 0.8。然后用含有 4 毫克/毫升纯化 GKL 酶的新鲜 LB 培养基将菌液稀释 100 倍，并向 96 孔板的各孔中加入 100 微升。用盖子盖住培养板，并将其放入一个10升的塑料容器中。密封容器后，在30摄氏度下孵育3小时，然后轻轻移除培养基。向孔中加入100 µL新鲜LB培养基，并将培养板在30摄氏度下继续孵育21小时。轻轻移除培养基后，用 200 微升无菌水轻轻洗涤浮游细菌细胞。将移液器枪头置于孔底部，小心吸出液体培养基，以尽量减少对气液界面处生物膜的干扰。然后向每孔中加入 100 微升 1% 结晶紫溶液，在室温下孵育 15 分钟。使用200微升无菌水洗涤各孔三次，以去除结晶紫溶液。每孔加入100微升33%乙酸，轻轻振荡孵育15分钟，以溶解染料。通过测定结晶紫在600纳米处的吸光度来定量生物膜的量。结晶紫的量与形成的生物膜量成正比。为了对鲍曼不动杆菌S1的生物膜进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析，将5毫升鲍曼不动杆菌S1菌液接种于LB培养基中，在30°C摇床培养箱中培养16小时。将鲍曼不动杆菌S1菌液的OD600调整至0.8。然后使用含有每毫升1.2毫克纯化GKL酶的新鲜LB培养基将菌液按1:100稀释，并取1毫升加入35毫米玻璃底培养皿中。用盖子盖好培养皿，放入10升塑料容器中密封，于30°C培养3小时。轻柔移除培养基后，加入含30微升纯化GKL酶的1毫升新鲜培养基，再于30°C继续培养21小时。再次轻柔地移除培养基，并替换为一毫升含有GKL酶的新鲜培养基。在30°C下孵育24小时。孵育结束后，轻柔地移除培养基，并加入500 µL含有5 µg/mL的Alexa Fluor 488标记的麦胚凝集素（溶解于HBSS中）。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，以染色生物膜。为固定生物膜，加入 500 微升溶于 HBSS 的 3.7% 多聚甲醛，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。用 2 毫升 HBSS 洗涤培养皿一次，然后完全移除溶液。在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像前，将培养皿置于黑暗环境中4摄氏度保存。进行CLSM成像与分析时，使用63倍物镜，每幅图像生成97个焦平面，每个焦平面间隔0.21微米。在结晶紫定量实验中，采用野生型GKL及一种改良的GKL双突变群体感应淬灭酶，检测其对三种羟基癸酰基-L-高丝氨酸内酯（3OHC10HSL）的乳酰酶活性，3OHC10HSL是鲍曼不动杆菌S1株使用的主要群体感应信号分子。如图所示，这两种酶均能显著减少经预处理的野生型鲍曼不动杆菌S1的生物膜形成。然而，两种酶对生物膜的破坏程度与其针对3OHC10HSL的活性效能并不成正比。如本表所示，突变型GKL对3OHC10HSL的催化转换速率比野生型GKL快六倍。然而，两种酶在生物膜破坏程度上的差异仅为两倍。本实验中，使用了改良的GKL突变酶及其儿茶酚失活酶进行比较。该微分干涉（DIC）图像显示，与无活性的酶相比，经改良的GKL突变酶处理后，生物膜尺寸减小。荧光图像分析还表明，使用改良的GKL突变酶处理后，生物膜的表面积、生物量和平均厚度均有所降低。若操作得当，掌握该技术后，不包括孵育时间，整个实验可在三到四小时内完成。在进行该操作时，重要的是要注意在洗涤步骤中尽量减少对生物膜的移除和破坏。按照本方案操作后，可进一步开展其他方法，如细胞计数和酶稳定性测定，以回答更多科学问题，例如群体感应淬灭型内酯酶对生物膜内细胞群体的影响及其作用持续时间。该技术建立后，为感染性疾病治疗领域的研究人员探索潜在的群体感应淬灭型内酯酶对致病菌生物膜作用提供了重要途径。观看本视频后，您应能够熟练掌握通过结晶紫染色定量分析生物膜破坏程度的方法，并通过共聚焦成像评估生物膜的形态学变化。请务必注意，操作致病性材料可能具有极高危险性。进行本实验操作时，应始终采取适当的生物风险防控措施，例如使用合格的生物安全防护设施。

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

病原生物膜利用工程定额淬Lactonases防有毒中断

来源：Tay, S. B., et al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。J. Vis. Exp.

量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

来源：Tay, S. B., et.al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。 J. Vis. Exp.

酶介导抑制生物膜形成的显微评估

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌...

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

生物膜感染对化学治疗表现出高度耐受性。单一检测方法无法全面反映生物膜的复杂性，因此需要采用多种互补的检测手段。我们介绍一种针对金黄色葡萄球菌（S.

适用于天然化合物库筛选的抗生物膜检测平台

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT...

量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。...

利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

本方案描述了一种结合静态与动态方法的策略，用于评估有机过氧酸在消除乳制品行业中生物膜方面的功效。该方法也可用于测试新型生物或化学制剂在控制生物膜方面的有效性。...

评估结合静态与动态方法的有机过氧酸在清除乳制品生物膜中的功效

噻吩磺酰胺类化合物是高效且特异性的抑制剂 弧菌 群体感应调控因子LuxR/HapR，可阻断其活性 体内从而抑制毒力、运动性和生物膜相关基因的转录。本方案详细描述了这些化合物的合成与建模方法 计算机模拟，并进行检测 体内 针对 LuxR/HapR...

弧菌群体感应抑制剂的合成与检测

本实验方案的目的是通过Chromobacterium violaceum ATCC...

Chromobacterium violaceum 中紫色杆菌素的定量及其被生物活性化合物的抑制

微生物生物膜通常由不同类型的特化细胞亚群构成。对这些亚群进行单细胞分析需要使用荧光报告系统。本文中，我们描述了一种利用荧光显微镜和流式细胞术对B.

使用荧光显微镜和流式细胞术对 Bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

学习利用群体感应淬灭内酯酶在体外环境中破坏病原菌生物膜的方法。该技术通过直接添加工程化GKL酶，有效减少A.baumannii S1的致病性，为开发新型抗菌治疗策略提供重要依据。

利用工程化群体感应淬灭乳糖酶抗毒力破坏致病性生物膜

探索更多视频