病原生物膜利用工程定额淬Lactonases防有毒中断

本实验的总体目标是证明群体猝灭酶在细菌生物膜破坏中的功效。这种方法将有助于回答抗菌治疗学领域的关键问题，并有助于了解群体猝灭内酯酶对生物膜环境中病原菌的影响。该技术的主要优点是群体猝灭内酯酶可以直接添加到体外环境中。

因此，它对生物膜破坏的影响很容易量化。演示此程序的是 Terrence Tay，我们实验室的技术人员。首先，在 30 摄氏度的 LB 中，在摇动培养箱中培养 5 毫升的鲍曼不动杆菌 S1 培养物 16 小时。

将培养物调整至 OD 600 为 0.8。然后使用每毫升含有 4 毫克纯化 GKL 酶的新鲜 LB 将培养物稀释 1 至 100。并向 96 孔板的孔中加入 100 微升。

用盖子盖住板，然后将它们放入 10 升塑料容器中。密封容器并在 30 摄氏度下孵育 3 小时，然后轻轻取出培养基。向孔中再加入 100 μL 新鲜 LB 培养基，并在 30 摄氏度下孵育板 21 小时。

轻轻去除培养基后，使用 200 微升无菌水轻轻洗涤浮游细菌细胞。将移液器吸头放在孔底部，小心地去除液体介质，以确保空气和液体界面之间的异物对生物膜的扰动最小。然后向每个孔中加入 100 微升 1% 结晶紫溶液，并在室温下孵育 15 分钟。

使用 200 微升无菌水清洗孔 3 次，去除结晶紫溶液。向每个孔中加入 100 微升 33% 乙酸，轻轻摇动孵育 15 分钟以溶解染料。通过测量 600 纳米结晶紫的吸光度来定量生物膜的量。

结晶紫的量与形成的生物膜的量成正比。为了对鲍曼不动杆菌 S1 生物膜进行共聚焦激光扫描显微镜或 CLSM，在 30 摄氏度的 LB 中，在摇动培养箱中培养鲍曼不动杆菌 S1 的 5 毫升培养物 16 小时。将鲍曼不动杆菌 S1 的培养物调整为 OD 600 为 0.8。

然后使用每毫升含有 1.2 毫克纯化 GKL 酶的新鲜 LB 稀释培养物，1 到 100，并将 1 毫克添加到 35 毫克玻璃底微培养皿中。用盖子盖住微培养皿，将其放入 10 升塑料容器中密封，然后在 30 摄氏度下孵育培养皿 3 小时。轻轻去除培养基后，加入一米含有 30 微升纯化 GKL 酶的新鲜培养基，然后在 30 摄氏度下再孵育 21 小时。

第二次轻轻去除培养基，并在新鲜培养基中更换另一毫升 GKL 酶。在 30 摄氏度下孵育 24 小时。孵育后，轻轻去除培养基，并加入 500 微升（每毫升 5 微克）溶解在 HBSS 中的 Alexa Fluor 488 共轭小麦胚芽凝集素。

将微培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，以对生物膜进行染色。要固定生物膜，请加入 500 微升溶于 HBSS 中的 3.7% 甲醛，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。用两毫升 HBSS 清洗微培养皿一次，然后完全去除溶液。

CLSM 成像之前，将培养皿存放在 4 摄氏度的黑暗中。对于 CLSM 成像和分析，使用 63X 物镜为每个图像生成 97 个堆栈，每个堆栈的间隔为 0.21 微米。在结晶紫定量实验中，野生型 GKL 和改进的 GKL 双突变群体猝灭酶用于对三种羟基癸酰 l 高丝氨酸内酯或 3OHC10HSL 的内酯酶活性，S1.As A.baumanii 使用的主要群体分子，两种酶都能够显着减少预处理的野生型 A.baumanii S1 中的生物膜形成。两种酶破坏生物膜的程度与它们对 3OHC10HSL 的功效不成正比。

如此表所示，突变型 GKL 的周转率比野生型 GKL 对 3OHC10HSL 快六倍。然而，酶之间生物膜破坏程度的差异只有两倍。本实验采用改良的 GKL 突变酶及其儿茶酚失活酶进行比较。

该 DIC 图像显示，与失活酶相比，用改进的 GKL 突变酶处理导致生物膜大小减小。荧光图像分析还显示，当用改进的 GKL 突变酶处理时，生物膜的表面积、生物量和平均厚度减少。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 3 到 4 小时内完成，不包括孵育时间。

在尝试此程序时，重要的是要记住在洗涤步骤中尽量减少生物膜的去除和破坏。按照此程序，可以进行其他方法，如细胞计数和酶稳定性测定。这将回答其他问题，例如群体猝灭内酯酶对生物膜内细胞群的影响及其作用持续时间。

开发后，这项技术为传染病治疗领域的研究人员探索病原菌产生的生物膜中潜在的群体猝灭内酯酶的影响铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何通过结晶紫染色量化生物膜破坏以及通过共聚焦成像评估生物膜的形态变化有很好的了解。不要忘记，使用致病材料可能非常危险。

执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的生物风险控制设施。