Name: 从构造到晶体 - 迈向β桶外膜蛋白的结构解析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习利用T7表达载体和特定去污剂表达纯化β桶外膜蛋白，用于X射线晶体学或核磁共振结构解析。该方法可稳定获得毫克级蛋白，助力膜蛋白折叠与转运机制研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢法国国家科学研究中心（CNRS）的 Herve Celia 提供紫外图像，以及普渡大学化学系的 Chris Dettmar 和 Garth Simpson 提供 SONICC 图像。感谢美国国立糖尿病与消化及肾脏疾病研究所和美国国立卫生研究院院内研究计划提供的经费支持。此外，我们还感谢美国国立普通医学科学研究所（A.M.S. 和 C.J.）、美国国立过敏与传染病研究所（N.N. 1K22AI113078-01）以及普渡大学生物科学系（N.N.）提供的额外经费支持。

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

β-桶状外膜蛋白（OMP）在革兰氏阴性细菌、线粒体和叶绿体中发挥着关键作用，是结构分析的重要靶点，能够提供关于这些细胞器外膜上重要分子机制的丰富信息。然而，获得足够量的样品用于结构分析并不总是容易实现，因此本文提供了一条通用的实验流程，用于制备足量的目标β-桶状OMP以进行结构解析，并详细阐述了从构建体到晶体的全过程。尽管这些实验方案已在多数来自革兰氏阴性细菌的OMP中经过测试并证明有效，但仍存在一定的局限性，即某些靶点（特别是来自线粒体和叶绿体的蛋白）可能需要采用其他方法进行表达与纯化。因此，本文所述方法适用于大多数涉及革兰氏阴性细菌来源OMP的研究项目，但具体表达水平和纯化所得样品的产量将因目标OMP的不同而有所差异。
用于结构研究的β-桶状外膜蛋白（OMP）表达主要有两种通用方法：（1） 体内 直接表达至外膜，以及(2)表达至包涵体 体外 复性。对于 体内 表达方法，β-桶状外膜蛋白被靶向至外膜 E. coli 其中它们天然折叠并直接从膜中分离。将目标蛋白表达至膜上是首选方法，因为这样更有可能获得正确折叠...

β-桶状外膜蛋白（OMP）仅存在于线粒体、叶绿体和革兰氏阴性细菌的外膜中1-3。尽管它们的功能与α-螺旋蛋白相似，但其折叠结构截然不同，由一个跨膜的中央β-桶状结构域构成，该结构域包含8至26条反向平行的β-链，每条β-链均与相邻的两条β-链紧密连接（图1和图2）。β-桶状结构域的首条和末条β-链通常以反向平行方式相互作用（线粒体VDAC除外），从而将β-桶状结构域闭合并与周围膜环境隔离。所有β-桶状OMP均具有长度和序列各异的胞外环区，这些环区在配体相互作用和/或蛋白质-蛋白质接触中发挥重要作用，有时可长达75个残基，例如淋球菌转铁蛋白结合蛋白A（TbpA）中所见4。β-桶状OMP还可具有N端或C端的周质延伸区，作为蛋白质功能所需的额外结构域（例如，BamA5-7、FimD8,9、FadL10）。尽管存在多种类型的β-桶状OMP11，以下将介绍其中两种较为常见的类型，以帮助对该领域不太熟悉的读者理解：（1）依赖TonB的转运蛋白和（2）自转运蛋白。
依赖TonB的转运蛋白（例如，FepA、TbpA、BtuB、Cir 等）对营养物质的摄入至关重要，其结构包含一个位于N端的“塞子”结构域，该结构域由约150个残基组成，并嵌入到C端一个由22条β链构成的β-桶状结构域中，后者锚定于外膜12（图3）。该塞子结构域通常阻止底物自由通过桶状结构域，但当底物结合后，会诱导塞子结构域发生构象变化，从而形成孔道（通过塞子重排或部分/完全排出），促进底物穿过外膜进入周质空间。依赖TonB的转运蛋白对某些革兰氏阴性致病菌株的存活尤为重要，例如脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis），这类细菌进化出了特化的转运蛋白，能够直接从人体宿主蛋白中劫取铁等营养物质4,13,14。
自转运蛋白属于革兰氏阴性菌的V型分泌系统，是一类β-桶状外膜蛋白（OMP），由一个β-桶状结构域（通常为12条β链，如EstA和EspP）和一个被分泌至胞外或呈递于细胞表面的乘客结构域组成15,16（图3）。这些β-桶状外膜蛋白通常在细胞存活和毒力中发挥重要作用，其中乘客结构域可作为蛋白酶、黏附素和/或其他介导致病过程的效应分子。
X射线晶体学、核磁共振波谱法和电子显微镜（EM）等结构研究方法使我们能够以原子分辨率确定外膜蛋白（OMP）的结构模型，进而揭示它们在外膜中发挥功能的具体机制。如果适用，这些宝贵的信息还可用于药物和疫苗的研发。例如，转铁蛋白结合蛋白A（TbpA）存在于Neisseria的表面，是其致病所必需的蛋白，因为它能够直接结合人转铁蛋白，并从中提取铁元素供自身生存利用。缺乏TbpA时，Neisseria无法从人类宿主中获取铁，因而失去致病能力。在解析了人转铁蛋白与TbpA结合的晶体结构4后，人们更加清楚地了解了这两种蛋白如何相互作用、TbpA中介导该相互作用的区域、TbpA提取铁所依赖的关键残基，以及如何针对Neisseria的TbpA开发治疗药物。因此，鉴于β桶状外膜蛋白在革兰氏阴性菌的存活与致病过程中的重要性，以及其在线粒体和叶绿体功能中的作用，同时考虑到目前仍需获得更多关于这类独特的膜蛋白及其功能系统的结构信息，本文提供了通用实验方案，旨在高效表达并纯化目标外膜蛋白，以便通过结构生物学方法对其进行表征。

<table><tbody><tr><td>结晶机器人</td><td>TTP Labtech, Art Robbins</td><td>-</td><td>除LCP结晶外，任何型号均可使用</td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>Eppendorf, BioRad</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>培养基摇床</td><td>New Brunswick, Infors HT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE电泳装置</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE及天然凝胶</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>离心机（低-中速）</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机（高速）</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SS34转子</td><td>Sorvall</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dounce匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP工具</td><td>Hamilton, TTP Labtech</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24孔板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>三明治板</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace结晶片</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose色谱柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>结晶筛选试剂盒</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>气密注射器（100 ml）</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

膜蛋白在细胞中发挥着重要的功能，如营养物质运输、运动性、信号传导、存活和毒力，但其已知结构仅占所有已知蛋白质结构的约1%。膜蛋白分为两类：α-螺旋型和β-桶型。α-螺旋膜蛋白几乎存在于所有细胞膜中，而β-桶膜蛋白仅存在于线粒体、叶绿体和革兰氏阴性细菌的外膜中。总体而言，膜蛋白结构研究中的一个普遍瓶颈是难以获得足够纯度的样品用于分析。为了帮助那些希望解析其感兴趣的β-桶外膜蛋白（OMP）结构的研究人员，本文提供了可用于X射线晶体学和/或核磁共振波谱法进行结构解析的、目标β-桶OMP的通用制备方案。本文概述了天然表达及形成包涵体表达的构建设计、利用亲和标签进行纯化，以及通过去垢剂筛选、bicelle（双层磁盘状胶束）和脂质立方相技术进行结晶的方法。这些方案已在多种来自革兰氏阴性细菌的OMP上测试并证实有效；然而，某些目标蛋白，特别是来自线粒体和叶绿体的OMP，可能需要其他表达与纯化方法。因此，本文所述方法适用于大多数涉及革兰氏阴性细菌来源OMP的研究项目，但不同目标OMP的表达水平和最终纯化产量会有所差异。

YiuR 是一种依赖 TonB 的铁转运蛋白，是针对 Yersinia pestis 的潜在疫苗靶点。它最初通过微阵列实验被鉴定出来。本文概述了利用 X 射线晶体学测定 YiuR 结构的步骤（图 9）。在克隆过程中，从基因组 DNA 中通过 PCR 扩增获得 YiuR 的 DNA 序列（去除 N 端信号序列），并亚克隆至一个含有 N 端 pelB 信号序列和 10×组氨酸亲和标签的载体中，其后接 TEV 蛋白酶切割位点。在表达过程中，将含有 YiuR 的质粒转化至 BL21(DE3) 感受态细胞中，并用单克隆接种 5 ml 起始培养液，培养至 OD600 ~0.5。随后，将 12 个装有 750 ml TB 培养基的锥形瓶各接种 1 ml 起始培养液，在 20 ºC 下振荡培养 3 天（转速为 220 rpm）。然后收集细胞，共获得约 150–200 g 湿菌体，迅速在液氮中冷冻，并于 -80 ºC 保存备用。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

β-桶状外膜蛋白（OMPs）在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜中具有多种功能。本文旨在通过提供相关实验方案，解决结构研究中已知的一个瓶颈问题，即大量制备β-桶状OMP蛋白，以满足通过X射线晶体学或核磁共振波谱法进行结构解析的需求。

膜蛋白在细胞中发挥着重要的功能，如营养物质运输、运动性、信号传导、存活和毒力，但仅占细胞总蛋白的约 1%……

本方法的总体目标是获得可结晶并产生衍射的毫克级外膜β-桶状蛋白质。该方法有助于解答膜蛋白折叠与转运领域的关键问题，例如β-桶状蛋白质如何插入细胞膜。该技术的主要优势在于其对β-桶状蛋白质具有良好的稳健性。通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为纯化、结晶和去垢过程中去垢剂的选择具有挑战性。来自苏珊·布坎南（Susan Buchanan）实验室的博士后杰里米·盖林（Jeremy Guerin）将与我和实验室的同事们共同演示该实验流程。请首先构建一个含有密码子优化的目标外膜蛋白（OMP）基因的T7表达载体，用于在体内将目标蛋白表达至细胞膜，具体操作如文本方案所述。将构建物转化至表达菌株中进行表达：取1微升质粒加入50微升BL21(DE3)感受态细菌中，轻轻吹打混匀。冰上孵育30分钟。孵育结束后，将样品置于42摄氏度水浴中热激30秒，然后立即放回冰上静置1分钟。加入1毫升预热的SOC培养基，在台式摇床培养箱中于37摄氏度、1000 RPM条件下振荡培养1小时。培养结束后，取100微升菌液涂布于含有适当抗生素的LB琼脂平板上，倒置后于37摄氏度过夜培养。随后，挑取单菌落接种至5毫升含抗生素的LB培养基中，进行小规模表达验证实验。重复操作5到10个菌落。在37摄氏度下振荡培养，使菌液在600纳米处的光密度达到约0.6。向每根培养管中加入5 µL 1 M IPTG，诱导目标OMP表达，并继续培养1至2小时。为了比较所有菌落的表达水平，使用微量离心机将每种培养物各取一毫升在15,000 × g下离心一分钟。弃去上清液，将菌体沉淀重悬于200 µL 1× SDS-PAGE上样缓冲液中。在100 °C加热五分钟，然后再次于15,000 × g离心五分钟。使用移液器将20微升样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的每个加样孔中，凝胶浓度为10%。在200伏恒定电压下电泳35分钟。最后，以6000 × g离心10分钟收集细胞。按每克菌泥加入5毫升裂解缓冲液的比例重悬细胞。使用高压破碎仪或细胞匀浆器裂解细胞。随后，在4°C条件下，以15,000 × g离心30分钟，去除未裂解的细胞和细胞碎片。将上清液转移至洁净离心管中，在4°C条件下以高速离心一小时。所得沉淀即为含有目标蛋白的膜组分。使用Dounce匀浆器重悬膜组分。首先，转移膜组分，然后加入不含去垢剂的2倍浓度溶解缓冲液。将重悬的膜组分倒入量筒中，并加水至溶解缓冲液的终浓度为1倍浓度。将样品转移至烧杯中，并缓慢加入去垢剂，使其终浓度约为临界胶束浓度的10倍。然后，根据目标蛋白从膜中提取的难易程度，在 4 °C 下搅拌 0.5 至 16 小时。最后，在 4 °C 下以 300,000 ×g 离心溶解后的样品 1 小时。准备一个 1 至 5 毫升的 IMAC 柱，或使用预装柱。在 4 摄氏度下进行后续层析步骤。用纯水冲洗以去除任何防腐剂残留。若使用自动化纯化系统，请根据制造商说明安装色谱柱。配制500毫升不含咪唑的IMAC缓冲液A和250毫升含1摩尔咪唑的IMAC缓冲液B。用10个柱体积的IMAC缓冲液A平衡IMAC柱。向蛋白样品中加入咪唑，使其终浓度为25毫摩尔，并混匀。然后以每分钟2毫升的流速将样品上样至已平衡的IMAC柱中。收集流穿液。随后，用缓冲液B分别以五倍柱体积、浓度递增的咪唑溶液洗涤IMAC柱，每次洗涤液收集为2 mL的组分。最后用250毫摩尔浓度的咪唑溶液洗脱样品，洗脱体积为五倍柱体积，并将洗脱组分收集为2 mL的组分。使用 SDS-PAGE 分析方法，基于 280 纳米处的吸光度分析流穿液、洗涤组分和洗脱组分。根据 SDS-PAGE 分析结果，合并含有目标 β-桶状外膜蛋白的组分。随后，向合并的样品中加入 TEV 蛋白酶，并在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜，以切除 6X 组氨酸标签。再次将样品蛋白酶溶液上样至IMAC柱，以分离目标β桶状外膜蛋白（OMP）与已切割的标签及任何未切割的样品。流出液将含有缺失标签的已切割样品。为准备结晶，将样品上样至凝胶过滤柱，并使用含有用于结晶的去垢剂的缓冲液。收集1 mL的洗脱组分，并根据其在280纳米处的吸光度，通过SDS-PAGE分析进行检测。合并含有目标蛋白的组分，浓缩至约10毫克/毫升。在制备样品前，组装凝胶装置。使用预冷的凝胶电泳缓冲液或将凝胶在冷室中进行电泳。使用0.22微米离心滤器过滤样品，以去除颗粒物和沉淀物。然后，将0.25微升样品移液至两个1.5毫升微量离心管中。将其中一个标记为“boiled”，另一个标记为“RT”。接着，向每个离心管中加入9.75微升的上样缓冲液，并通过移液混匀。再向两个样品中各加入10微升2X SDS上样缓冲液，并轻轻移液混匀。将标记为“boiled”的样品在95摄氏度下煮沸5分钟，而标记为“RT”的样品则置于室温下保存。然后，将煮沸的样品短暂离心。接着，取20 µL上述两种样品加入预先制备好的非变性凝胶中。在恒定150 V电压下电泳60分钟后，取出凝胶并浸入染色液中以显示结果。采用已发表的 JoVE 方法，在去垢剂、双分子层细胞（bi-cells）和脂质立方相（lipidic cubic phase）中进行结晶试验。使用紫外显微镜观察结晶液滴，以确认所得晶体确实为蛋白质晶体，而非盐、脂质或去垢剂晶体。通过实验室X射线源或同步辐射对初步获得的晶体进行衍射筛选，以判断晶体是否具有衍射能力。在收集到衍射良好的晶体数据后，使用数据处理软件（如HKL2000）处理数据。将所得文件转移至结构解析软件套件（如Phoenix Suite），并进行分子置换以获得初始相位并确定结构。YIUR的晶体结构即通过该方法在2.6 Å分辨率下确定。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在两周内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何表达并纯化用于结构研究的细菌外膜蛋白。

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

从构造到晶体 - 迈向β桶外膜蛋白的结构解析

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。...

利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

评估二维（2D）结晶实验以形成有序的膜蛋白阵列，是电子晶体学中一项极为关键且困难的任务。本文介绍了我们用于筛选和鉴定主要分子量在15–90...

通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究

本文介绍了一种用于膜蛋白在脂质介相中高通量结晶的机器人方法，旨在通过大分子X射线晶体学进行结构解析。文中引入了三台能够处理该方法中关键的黏稠且易粘连的含蛋白介相的机器人。...

使用机器人在脂质介相中进行膜蛋白的高通量结晶

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的实验步骤，用于收获在脂质立方相和海绵相中生长的膜蛋白晶体，并将其冷冻冷却，以用于大分子X射线晶体学方法进行结构解析。...

从脂质介相中生长的膜蛋白晶体的收获与冷冻冷却用于大分子晶体学结构测定

基于结构的药物设计在药物研发中发挥着重要作用。并行追求多个靶点可显著提高先导化合物发现的成功率。以下文章重点介绍了西雅图传染病结构基因组学中心如何采用多靶点策略，实现流感病毒A型PB2亚基从基因到结构的测定。...

流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法

我们描述了一个结合了简单生化分析与计算分析的框架，用于指导大型卷曲螺旋结构域的表征与结晶。该框架可针对球状蛋白进行调整，或进一步拓展以整合多种高通量技术。...

结合湿实验与干实验技术指导含大型卷曲螺旋结构蛋白的结晶

本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。...

结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

本方案旨在从结构层面研究TmPep1050（一种M42型氨肽酶）从二聚体到十二聚体的转变过程。该流程简明清晰，涵盖从蛋白质纯化到X射线数据处理的全过程。通过TmPep1050H60A...

X射线晶体学研究寡聚态转变 Thermotoga maritima M42 氨基肽酶 TmPep1050

数十年来，脂质单层膜一直被用作形成二维（2D）蛋白质晶体以进行结构研究的基础。它们在空气-水界面处稳定，可作为电子成像的薄层支撑材料。本文介绍了制备用于生物学研究的脂质单层膜的成熟步骤。...

使用脂单层法进行电子晶体学研究的样品制备

本方案描述了一种用于甾醇转运蛋白ABCG5/G8结晶的实验设置。将ABCG5/G8重组到双层脂质盘（bicelles）中，用于悬滴法结晶。该方案无需特殊材料或底物，因此可在任何实验室中便捷地采用和调整，以通过X射线晶体学方法测定蛋白质结构。...

ABCG5/G8 在脂质双层胶束环境中的X射线晶体学结晶

学习利用T7表达载体和特定去污剂表达纯化β桶外膜蛋白，用于X射线晶体学或核磁共振结构解析。该方法可稳定获得毫克级蛋白，助力膜蛋白折叠与转运机制研究。

从构建体到晶体——迈向β-桶状外膜蛋白的结构解析

探索更多视频