从构造到晶体 - 迈向β桶外膜蛋白的结构解析
2016年7月4日
β桶外膜蛋白 （OMP） 在革兰氏阴性菌、线粒体和叶绿体的外膜内发挥多种功能。在这里，我们希望通过提出生产足够数量的β桶 OMP 的方案来缓解结构研究中已知的瓶颈，以便通过 X 射线晶体学或 NMR 波谱进行结构测定。
该方法的总体目标是获得毫克级的外膜 β 桶蛋白，这些蛋白将结晶和分解。这种方法可以帮助回答膜蛋白折叠和转运领域的关键问题，例如 β-桶蛋白如何插入细胞膜。该技术的主要优点是它对 β 桶蛋白很稳健。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为选择用于纯化、结晶和馏分的去污剂是具有挑战性的。Susan Buchanan 实验室的博士后 Jeremy Guerin 将与我和实验室的同事一起演示该程序。从构建包含密码子优化靶外膜蛋白或 OMP 基因的 T7 表达载体开始此过程，用于体内表达膜，如文本方案中所述。
将 1 微升质粒移液到 50 微升 BL21 （DE3） 化学感受态细胞中，并通过上下移液轻轻混合，将构建体转化为用于表达的细菌表达菌株。在冰上孵育 30 分钟。孵育后，使用水浴在 42 摄氏度下加热脉冲 30 秒，然后放回冰上 1 分钟。
加入 1 毫升预热的 SOC 培养基，并使用台式摇床培养箱在 37 摄氏度下以 1000 RPM 摇动 1 小时。孵育后，将 100 微升细胞接种到含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上，并在 37 摄氏度下倒置孵育过夜。接下来，通过用单个菌落接种 5 mL 含 LB 的抗生素培养物来进行小规模表达测试。
重复 5 到 10 个菌落。在 37 摄氏度下生长，振荡至 600 纳米处的光密度约为 0 点 6。通过向每个培养管中加入 5 微升一摩尔 IPTG 来诱导目标 OMP 的表达，并允许再生长 1 到 2 小时。
为了比较所有菌落的表达水平，使用微量离心机以 15， 000 倍 G 的速度将每种培养物的 1 毫升离心 1 分钟。去除上清液，将细胞重悬于 200 μL 1X SDS-PAGE 上样缓冲液中。在 100 摄氏度下加热 5 分钟，然后再次以 15， 000 倍 G 离心 5 分钟。
使用 SDS-PAGE 分析样品，将 20 微升移液到 10% 凝胶的每个孔中。在 200 伏特的恒定电压下电泳凝胶 35 分钟。最后，以 6000 倍 G 离心 10 分钟收获细胞。
以每克细胞糊剂 5 毫升的比例将细胞重悬于裂解缓冲液中。使用法式压榨机或细胞匀浆器裂解细胞。然后，在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 G 离心裂解的细胞 30 分钟，以去除未裂解的细胞和细胞碎片。
将上清液转移到干净的试管中，并在 4 摄氏度下再次高速离心 1 小时。所得沉淀是包含目标蛋白质的膜组分。使用 Dounce 匀浆器，重悬膜组分。
首先，转移膜，然后加入 2X 浓度的增溶缓冲液，不含去污剂。将重悬的膜倒入量筒中，加水直至达到 1X 增溶缓冲液的最终浓度。将样品转移到烧杯中，缓慢加入去污剂至终浓度约为临界胶束浓度的 10 倍。
然后，在 4 摄氏度下搅拌 0.5 至 16 小时，具体取决于从膜中提取目标蛋白的难易程度。最后，将溶解的样品在 4 摄氏度下以 300， 000 倍 G 离心 1 小时。制备 1 至 5 mL IMAC 色谱柱或使用预装色谱柱。
在 4 摄氏度下执行后续色谱步骤。用水冲洗以去除任何防腐剂痕迹。如果使用自动纯化系统，请按照制造商的说明安装色谱柱。
制备 500 毫升不含咪唑的 IMAC 缓冲液 A 和 250 毫升含 1 磨牙咪唑的 IMAC 缓冲液 B。使用 10 倍柱体积的 IMAC 缓冲液平衡 IMAC 色谱柱 A.向蛋白质样品中加入咪唑至终浓度为 25 毫摩尔并混合。然后，以每分钟 2 mL 的速度将样品上样到平衡的 IMAC 色谱柱上。
收集流出。接下来，使用缓冲液 B 用 5 个柱体积（每个柱体积递增的咪唑浓度递增）洗涤 IMAC 柱。用终浓度为 250 毫摩尔的样品洗脱 5 个柱体积，并以 2 mL 馏分收集洗脱的样品。
使用 SDS-PAGE 分析根据它们在 280 纳米处的吸光度分析流出、洗涤馏分和洗脱馏分。合并含有经 SDS-PAGE 分析验证的目标 β 桶 OMP 的级分。然后，向混合样品中加入 TEV 蛋白酶，并在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育过夜，以去除 6X 组蛋白标签。
将样品蛋白酶溶液再次加载到 IMAC 柱上，以将目标 β 桶 OMP 与裂解的标签和任何未裂解的样品分离。流出液将包含缺少标签的裂解样品。为了准备结晶，将样品加载到凝胶过滤柱上，放入含有用于结晶的去污剂的缓冲液中。
收集 1 毫升馏分，并根据它们在 280 纳米处的吸光度使用 SDS-PAGE 分析进行分析。汇集那些含有目标蛋白的级分，然后浓缩至约 10 毫克/毫升。在制备样品之前，组装凝胶装置。
使用预冷的凝胶电泳缓冲液或在冷藏室中运行凝胶。使用 0.22 微米离心过滤器过滤样品，以去除颗粒和沉淀。然后，将 0.25 μL 样品移液到两个 1.5 mL 微量离心管中。
将一个标记为煮沸"，另一个标记为 RT"接下来，向每个试管中加入 9.75 微升样品缓冲液，并通过移液混合。向两个样品中，同时添加 10 μL 2X SDS 上样缓冲液，并通过移液轻轻混匀。将煮沸的"样品在 95 摄氏度下煮沸 5 分钟，同时将 RT"样品置于室温下。
然后，短暂旋转煮沸的样品。接下来，将 20 μL 两种样品上样到预组装的天然凝胶上。在 150 伏特恒定电压下电泳 60 分钟后，取出凝胶并浸泡在染色溶液中以观察结果。
使用先前发表的 Jove 方法，在洗涤剂、双细胞和脂质立方相中进行结晶试验。在紫外显微镜下观察结晶头，以验证晶体确实是蛋白质，而不是溶解的脂质或去污剂。使用家用源或同步加速器对铅晶体进行筛选，以查看晶体是否破裂。
在收集到分解良好的晶体数据后，使用 HKL2000 等处理软件处理数据。将结果文件传输到软件套件中进行结构测定，例如 Phoenix Suit，并执行分子置换以进行初始定相和结构测定。使用该方法以 2.6 埃分辨率测定 YIUR 的晶体结构。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两周内完成。看完这个视频，你应该对如何表达和纯化细菌外膜蛋白进行结构研究有了很好的了解。
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概述
本文介绍了用于生产β-桶型外膜蛋白（OMPs）的协议，以获得足够的数量用于结构研究。该方法旨在促进这些蛋白的结晶和衍射，这对于理解膜蛋白折叠和运输至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 生物化学
- 膜蛋白
背景
- β-桶型OMPs对于革兰氏阴性细菌、线粒体和叶绿体的各种功能至关重要。
- 了解它们的结构可以提供对膜蛋白动力学的洞察。
- 这些蛋白的结晶一直是结构研究的一个重大瓶颈。
- 研究人员在纯化和结晶过程中选择洗涤剂往往具有挑战性。
研究目的
- 开发一种生产毫克量β-桶型OMPs的稳健方法。
- 通过X射线晶体学或核磁共振光谱实现结构测定。
- 解决该领域新手研究人员面临的挑战。
使用的方法
- 构建含有优化密码子的目标OMP基因的T7表达载体。
- 在体内表达OMP以促进膜整合。
- 使用特定洗涤剂进行纯化和结晶。
- 由实验室经验丰富的研究人员展示该程序。
主要结果
- 该方法成功产生适合结晶的β-桶型OMPs。
- 它提供了一种研究膜蛋白插入的可靠方法。
- 研究人员可以在指导下复制该方法。
- 经验丰富的人员的演示增强了对过程的理解。
结论
- 这种方法代表了β-桶型OMPs研究的重大进展。
- 它为结构生物学研究开辟了新途径。
- 未来的研究可以利用这种技术探索膜蛋白的功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Determining the structure of β-barrel outer membrane proteins (OMPs) is a critical bottleneck in antimicrobial target validation and mechanistic de-risking for Gram-negative pathogens. Reliable production of milligram quantities enables structure-based drug discovery and predictive confidence in target engagement. This method supports early discovery workflows by providing purified, crystallizable OMPs for downstream screening and lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing purified OMPs for structural and functional studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible expression and purification workflows.
- Predictive Value: Facilitates structure-guided target assessment and portfolio triage for antimicrobial programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces detergent-solubilized OMPs suitable for biophysical assay development and ligand screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable protein outputs enabling reproducible compound evaluation.
- Platform Reuse: Generates purified OMPs compatible with downstream biophysical and structural platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides structurally validated OMPs that bridge discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Enables structure-based understanding of OMP function in virulence and transport pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions through validated structural models of target proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, delivering purified OMPs for structural and functional characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via structural analysis of purified OMPs.
- Screening: Enables assay readiness through production of homogeneous, concentrated protein samples.
- Analytics: Yields quantifiable outputs (yield, purity, monodispersity) essential for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects structural data to preclinical continuity by validating target conformation and function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for OMP production across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through structural data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of OMP production for structural studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failure rates in downstream screening and crystallization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on structural tractability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial expression, and membrane protein biochemistry.
- Depends on access to centrifugation, chromatography, and crystallization screening infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of detergent selection and purification protocols.
- Involves adaptation considerations for OMPs from mitochondria or chloroplasts versus Gram-negative bacteria.
- Practical limitations include variable expression yields and detergent sensitivity across OMP targets.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
In Vivo Membrane-targeted Expression
3:09
Isolation from Membrane Fractions
4:41
Purification Using Immobilized Metal-affinity Chromatography (IMAC), Ion-exchange, and Gel Filtration
7:09
Heat Modifiability Assay
8:35
Results: Crystals to Structure Determination for the Putative Vaccine Target YiuR from Yersinia pestis
9:29
Conclusion
