小鼠胚胎干细胞的聚集体的产生，显示对称破缺，极化和突发集体行为体外

该方案的总体目标是产生小鼠胚胎干细胞的均匀聚集体，这些细胞经过自组织和轴向伸长和悬浮培养。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如组织相互作用在通路规范和气体关系等过程中的自组织方面的作用。这种技术的主要优点是它允许在聚集之前从胚胎之外的新颖解构角度研究发育事件。

在 ES 中维持小鼠胚胎细胞或 M MEC。在经明胶包被的 25 平方厘米组织培养处理的培养瓶上提起培养基，以产生聚集体。从含有 40% 至 60% 汇合细胞的组织培养瓶开始，吸出培养基并冲洗培养瓶两次。使用 PBS，加入 1 毫升 25% 胰蛋白酶 EDTA，并在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟，以将细胞从培养瓶中分离出来。

接下来，向分离的细胞悬液中加入 5 mL Es.Lift 培养基并充分混合。将细胞转移至 50 mL离心管中，取出 1 mL等分试样对细胞进行计数。将 5 乘以 10 的剂量添加到第四个细胞中，加入 5 毫升温热的 PBS 中，并以 170 倍 G 的浓度离心细胞 5 分钟。

在不干扰沉淀的情况下吸出溶液。然后轻轻加入 5 毫升 PBS 并重复离心。吸出最大体积而不干扰细胞沉淀。

防止 PBS 的残留。将细胞沉淀重悬于 1 mL 温热的 N two B 27 培养基中。用 P 1000 移液器充分混合，以产生均匀的细胞悬液。

然后用另外 4 毫升 N 2 B 27 培养基稀释。使用多通道移液器将细胞悬液转移到无菌储液槽中。充分混合细胞，并将 40 微升细胞悬液从储液槽转移到经处理的 ubo 非组织培养物中的每个孔中。

96 孔板。非组织培养板专门用于最大限度地减少细胞对板的粘附。将板在 37 摄氏度的加湿培养箱中用 5% 二氧化碳孵育 48 小时，以便在 48 小时后让细胞聚集。

从培养箱中取出板，在倒置显微镜下观察细胞，确认聚集体的存在。加入 10 毫摩尔的 CHI 9 9 0 2 1 储备液中，使 N 2 B 27 的最终浓度为 3 微摩尔。这是用于细胞刺激的辅助培养基。

使用多通道移液器向每个孔中分配 150 μL 次级培养基。具有足够的力以去除任何粘附的聚集体。孵育后，将板放回细胞培养箱中 24 小时。

小心地去除培养基，不要吸出细胞聚集体。向每个孔中重新加入 150 微升 N 2 B 27，用足够的力去除任何粘附的聚集体。每 24 小时重复一次，总孵育时间约为 5 天。

要制备用于固定的聚集体，首先从每个孔中轻轻吸出孵育溶液，将移液器以 30 度角固定。为防止吸出细胞聚集体，请向每个细胞聚集体中加入 150 微升 PBS。等待几分钟，让聚集体沉淀在底部，然后吸出 PBS。

使用无菌剪刀再重复此洗涤步骤两次。在分液上方约 3 毫米处切割 P 1000 移液器吸头。最后，吸取吸液并将少量液体释放到孔中。

搅动骨料并将其从井底松开。然后将聚集体吸入尖端，并将聚集体转移到玻璃果蝇解剖中。使用相同的程序，将所有将经过相同免疫染色程序的聚集体收集到一次解剖中。

将解剖物放在显微镜下并旋转以将聚集体移向中心。然后小心地从孔边缘吸出 PPS。注意不要删除任何聚集体。

为了固定聚集体，加入 1 毫升新鲜制备的 4% 甲醛溶液，并将培养皿在轨道摇床中在 4 摄氏度下孵育 2 小时。以低速设置。小心吸出甲醛溶液，以防止吸入任何聚集体，然后向井中加入 1 毫升 PBS。

将板放回定轨摇床中 10 分钟。从孔中取出 PBS，再重复此洗涤步骤两次。接下来，加入 1 毫升 P-B-S-F-T 溶液，将板放在轨道摇床上 10 分钟。

吸出溶液并再重复洗涤两次。每孔添加 1 毫升 P-B-S-F-T 以阻止聚集体发生非特异性免疫反应性。将板放在轨道摇床上，在 4 摄氏度下低速放置 1 小时。

孵育后，小心地从孔中吸出封闭溶液，并加入 500 μL 以 P-B-S-F-T 稀释的一抗。用 Paraform 密封板以防止蒸发，并在 4 摄氏度下在轨道振荡器上低速孵育过夜。接下来，用预冷的 P-B-S-F-T 替换一抗溶液。

将板放在轨道振荡器上，清洗聚集体。在 4 摄氏度下以低速放置 5 分钟。再重复一次洗涤。

在 4 摄氏度下，在轨道摇床上以低速使用 P-B-S-F-T 进行两次额外的洗涤循环。如文本方案所示，去除洗涤液并与 500 μL 在 P-B-S-F-T 中稀释的二抗一起孵育。每毫升 herst 添加 1 微克，以便看到细胞核在 4 摄氏度下在避光旋转转子上孵育过夜。

在 4 摄氏度下用 PBS FT 进行另一个洗涤循环，在铝箔包装盒下避光。在室温下用含有 0.2% FBS 和 0.2%Triton X 100 的 PBS 或 PBT 缓冲液进行额外的洗涤。小心吸出溶液后，将聚集体与 1 毫升 1 对 1 甘油对 PBT 在室温下避光孵育 30 分钟。

然后将它们与 1 毫升 7 比 3 甘油一起孵育到 PBT 中 30 分钟。为了准备用于共聚焦成像的样品，将甘油吸出到 PBT 溶液中，并用 1 毫升封固剂替换。然后将聚集体以 17 微升液滴形式安装在载玻片上。

使用移液器吸头，将一块双面胶带折叠四次，以准备垫片。然后在载玻片上聚集体的两侧放置一个垫片，倒置盖子，滑上垫片，然后使用共聚焦显微镜对聚集体进行成像。电镀 48 小时后，形成直径约为 150 微米的聚集体，显示出光滑的边界。

另一方面，较差的培养基质量、非最佳细胞数量铺板或细胞粘附可能导致无法正确聚集。用 CHI 9 9 0 2 1 a 糖原合成酶激酶 3 抑制剂连续处理 120 小时会导致球形聚集体变长。此外，处理后 SOX GFP 阳性细胞在聚集体的一端存在不同的定位，不同的处理产生不同的形态变化，单个聚集体的形态和荧光标记物的变化。

可以随时间推移跟踪聚合中的本地化。一旦掌握，如果作得当，研究人员将能够在大约 45 分钟内生成聚集体。一旦形成聚集体，就可以使用其他方法（如 Q-R-T-P-C-R）代替免疫染色来研究聚集体内基因表达的变化。

观看本视频后，您应该对如何从 MEC 形成聚集体、应用特定刺激以及为免疫染色和共聚焦显微镜分析准备聚集体有很好的了解。