Name: 小鼠胚胎干细胞的聚集体的产生，显示对称破缺，极化和突发集体行为体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解小鼠胚胎干细胞聚集体生成技术，用于研究发育生物学中的自组织与轴向延伸过程。该方法可在体外模拟胚胎发育，为干细胞研究与组织工程提供重要模型。

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本工作由欧洲研究理事会（ERC）高级研究员奖（授予 AMA，DAT，TB）资助，并得到惠康信托基金（Wellcome Trust）向 AMA 提供的项目拨款、工程与物理科学研究委员会（EPSRC）向 PB-J 提供的博士生奖学金，以及 Erasmus、Stichting dr. Hendrik Muller's Vaderlandsch Fonds 和 Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te ’s-Gravenhage&#160;向 SCvdB 提供的支持。我们感谢 J. Briscoe、S. Muñoz-Descalzo、C. Schröeter 和 T. Rodriguez 提供的讨论与建设性批评，感谢 Joaquìn de Navascués 提供封片介质方案，同时感谢 A.K. Hadjantonakis 和 C. Budjan 分享其实验室关于整体胚胎染色的相关实验方案。本文的早期版本此前已在 bioRxiv 预印本服务器上发布29。

1. 聚集前的培养条件
<ol>
	<li>在 ESLIF 培养基中培养 mESCs（参见特定材料表） &amp;#38; 配制设备）置于明胶包被的 25 cm2 37 °C、5% CO₂的湿润化培养箱中培养经组织培养处理的培养瓶221-25.</li>
	<li>复苏后至少传代培养两次再用于本方案；较低传代次数的细胞通常在实验重复中更易产生可重复的特性即，培养传代次数不超过15代），但存在轻微变异&#160;不同ES细胞系之间存在差异是预料之中的（参见 表2 （针对所测试的细胞系）。</li>
	<li>将细胞培养至40–60%汇合度。不可使用过度汇合的细胞进行聚集体形成。</li>
</ol>
2. 聚集体的制备
<ol>
	<li>&#160;将 PBS（含 Ca2+、Mg2+）、ESLIF、N2B2726,27 和胰蛋白酶-EDTA 置于 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>&#160;从组织培养瓶（步骤 1.3）中吸除培养基。用 5 ml PBS 轻柔冲洗培养瓶两次，吸除 PBS 后加入 1 至 2 ml 预热的胰蛋白酶-EDTA（0.25%），以解离细胞。
	<ol>
		<li>&#160;将培养瓶放入培养箱中孵育 < 5 分钟，或直至细胞完全从瓶壁脱落。使用 1 ml 移液器反复吹打，形成单细胞悬液，以便准确计数并获得均一大小的细胞聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#160;用 5–10 ml ESLIF 中和胰蛋白酶活性；冲洗培养表面以最大程度回收细胞，并转移至 50 ml 离心管中。从离心管中取出 1 ml 样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>&#160;确定所需悬液体积，使细胞浓度达到 10 个细胞/µl（整块 96 孔板需要 5×104 个细胞溶于 5 ml 悬液中）。准确计数细胞，因为细胞数量显著偏离规定值可能会影响聚集体对刺激的反应。</li>
	<li>&#160;在新的 50 ml 离心管中，将 5×104 个细胞加入 5 ml 预热的 PBS 中，于约 170 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>&#160;小心吸除 PBS，并轻柔加入 5 ml 预热的 PBS，避免扰动管底的细胞沉淀。于约 170 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>&#160;再次小心吸除 PBS，尽可能彻底去除液体但不扰动沉淀，因残留 PBS 可能不利细胞聚集。首先使用 P1000 移液器将沉淀重悬于 1 ml 温热的 N2B27 培养基中，形成均匀的细胞悬液，随后再加入 N2B27 至所需体积（例如，为配制 5×104 个细胞/5 ml 悬液，再加入 4 ml）。</li>
	<li>&#160;将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将 40 µl 悬液滴加至未经组织培养处理的“U”型底 96 孔板各孔底部。盖上配套盖子，并使用倒置显微镜确认细胞存在（图 1B）。 
	注意：必须使用此类板以减少细胞黏附的可能性。切勿用明胶、纤连蛋白或其他促进细胞黏附的物质包被 96 孔板底部。</li>
	<li>&#160;将细胞在 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 48 小时，以促进聚集。</li>
</ol>
3. 施加刺激并更换培养基
<ol>
	<li>&#160;经过48小时的培养后，观察96孔板中每个孔内mESC的形态，以确认聚集体形成成功（图1E）。注意：聚集体呈球形，直径约为150–200 µm。若出现问题，请参阅故障排除部分（表1）。</li>
	<li>&#160;使用多通道移液器向每孔加入150 µl新鲜的继代培养基（含3 µM Chi99021（Chi）的N2B2719；Chi储存液以DMSO配制，浓度为10 mM）。移液时需施加足够力度，以使可能已开始黏附于孔底的聚集体脱落。将聚集体在继代培养基中于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续培养24小时（图1A）。 
	注意：使用该继代培养基可稳定生成伸长且具有极性的聚集体。根据实验需求，也可使用其他成分的继代培养基，示例见图&#160;3。</li>
	<li>&#160;后续更换培养基时，将多通道移液器倾斜约30°，从每孔侧壁轻轻吸出150 µl继代培养基。随后，向每孔加入150 µl新鲜N2B27培养基，移液力度应足以使可能已黏附于孔底的聚集体脱落。</li>
	<li>&#160;每24小时重复步骤3一次，直至完成预定的时间进程（典型的聚集体培养实验持续时间为120小时）。 
	注意：每次换液后应确保聚集体处于自由悬浮状态，以保证同一块及不同96孔板之间的可重复性和一致性。聚集体形成后需每日更换培养基。</li>
</ol>
4. 免疫染色及共聚焦显微镜分析用聚集体的制备
<ol>
	<li>固定与一抗孵育 
	注意：A.K. Hadjantonakis28描述的方案已作修改，以适用于mESC聚集体的免疫染色。有关本研究中常用抗体及其稀释比例，请参考先前发表的研究19,21,24,25,29及表3。
	<ol>
		<li>使用多通道移液器以约30°角倾斜持握，轻柔地从96孔板每孔侧边移除150 µl培养基。通过移液向每孔加入150 µl PBS进行两次洗涤。每次洗涤之间间隔数分钟，使聚集体充分沉降。</li>
		<li>将P1000移液器设定为释放200 µl，安装相应移液枪头，并用无菌剪刀剪去枪头末端约3 mm。将96孔板各孔中的PBS少量吸入枪头内，再推出以搅动聚集体。</li>
		<li>使用同一枪头吸取孔内全部液体（包括聚集体），移入一个小的（直径30 mm）玻璃Drosophila解剖皿中。将所有接受相同免疫染色处理的96孔板中的聚集体转移至同一个玻璃解剖皿中。 
		注意：当从不同实验条件下转移聚集体时，应使用新的剪切移液枪头，以防止聚集体交叉污染。</li>
		<li>将盛有聚集体的玻璃皿置于解剖显微镜下。轻轻旋转玻璃皿使聚集体集中至中央，用玻璃巴斯德移液管从一侧吸除PBS。在显微镜下观察，确保聚集体未被吸出。保留少量PBS覆盖聚集体，防止其干燥。</li>
		<li>加入1 ml新配制的4%多聚甲醛（溶于PBS），在设定为低速的旋转摇床上4 °C孵育2小时。注意：多聚甲醛具有致敏性、致癌性和毒性，操作时需佩戴适当的防护装备。</li>
		<li>固定完成后，参照步骤4.1.4的方法吸除多聚甲醛溶液，并在低速旋转摇床上用1 ml PBS洗涤聚集体三次，每次10分钟。</li>
		<li>参照步骤4.1.4吸除PBS，再用含10%胎牛血清（Foetal Bovine Serum, FBS）和0.2% Triton X-100的PBS（PBSFT）进行三次10分钟洗涤，每次均在低速旋转摇床上进行。 
		注意：使用胎牛血清（FBS）可获得澄清的洗涤缓冲液，相比使用脱脂奶粉可减少聚集体在操作过程中的损失。需注意的是，固定后免疫组织化学操作可采用多种不同方法，以下仅为示例，具体方案应由研究人员自行确定并优化。</li>
		<li>在低速旋转摇床上，以PBSFT于4 °C封闭聚集体1小时。本步骤可暂停，改为在4 °C下于水平旋转摇床上持续振荡过夜（O/N）进行封闭&#160;。</li>
		<li>参照前述方法（见步骤4.1.4）吸除PBSFT，加入500 µl用PBSFT稀释的一抗溶液，于4 °C低速旋转摇床上过夜（O/N）孵育。用石蜡膜覆盖以防止蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>吸除一抗溶液，随后以1 ml PBSFT（4 °C）按以下程序洗涤：两次，每次5分钟；三次，每次15分钟；再进行四至七次，每次1小时。所有洗涤步骤均在4 °C、低速旋转摇床上进行。注意：使用前应预先冷却洗涤液。切勿将样品置于冰上洗涤，以免导致聚集体破碎。</li>
		<li>吸除最后一次洗涤液，加入所需二抗溶液（溶于500 µl PBSFT）&#160;，于4 °C避光条件下在水平旋转摇床上过夜（O/N）孵育。如需，可同时加入Hoechst等核染料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片与共聚焦显微镜成像
	<ol>
		<li>参照步骤4.1.4方法，用4 °C的PBSFT洗涤聚集体。最后一次洗涤后，用含0.2% FBS和Triton X-100的PBS（PBT）按以下程序冲洗：两次，每次5分钟；三次，每次15分钟。所有洗涤步骤均在室温（RT）、避光条件下于旋转摇床上进行。</li>
		<li>参照前述方法（步骤4.1.4）吸除液体，避光孵育30分钟，加入1:1甘油:PBT溶液（1 ml）；随后再进行第二次30分钟孵育，使用7:3甘油:PBT溶液（1 ml）。 
		注意：使用旋转器在4 °C下混合甘油与PBT溶液。</li>
		<li>吸除最终的甘油:PBT溶液，替换为1 ml封片剂24。此步骤可暂停（若暂停，需用石蜡膜密封样品皿，并将染色皿在4 °C下保存），待后续封片。</li>
		<li>使用剪切过的P20移液枪头，将聚集体以17 µl液滴形式移至显微镜载玻片上进行封片（图2）。将双面胶带反向折叠四次制成垫片，贴于载玻片两端。将盖玻片（22 mm × 60 mm）置于这些垫片之上（图2）。 
		注意：此步骤必须使用剪切枪头，以免损伤样品。垫片可防止盖玻片压碎聚集体。</li>
		<li>聚集体封片完成后，采用先前报道的方案19,21,24,25进行共聚焦显微镜成像。将载玻片置于显微镜载物台上后，静置数分钟，使聚集体在封片剂中充分沉降，再开始成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在相互竞争的经济利益。

本论文所述技术能够高效且可重复地生成小鼠胚胎干细胞（mESCs）的聚集体，这些聚集体表现出有序的对称性破缺和伸长现象19，结合了Marikawa et al.14描述的悬滴培养法与拟胚体（EB）形成方法。这些聚集体进一步发育出轴向伸长结构，补充了现有由胚胎干细胞生成前部器官的方法，例如视杯11和大脑皮层13的生成。此外，这些聚集体包含具有三个胚层特征的细胞，表现出类似于原肠胚形成过程中的细胞行为，如快速细胞迁移19,21。
推测对称性破缺事件的本质是十分有趣的，因为它发生在缺乏外部模式化组织和合子不对称信号的情况下19。初级轴的自发形成可能源于起始细胞培养体系中预先存在的异质性，这些异质性构成了不对称发育的基础。事实上，在ESLIF条件下培养的细胞群体表现出自我更新细胞与分化细胞的混合状态，其相对比例可能在不同细胞聚集体之间有所差异。此外，我们实验室的初步研究表明，完全由多能性细胞组成的聚集体表现出发育延迟和模式形成缺陷，提示异质性在有序模式形成中具有重要作用（D.A. Turner &amp;#38; A. Martinez Arias，正在准备中）。还值得考虑的是，反应-扩散机制可能参与了该模式的生成，例如抑制因子从聚集体表面向外扩散。Warmflash et al.41 提出，此类机制可能负责贴壁培养中径向不对称性的建立，因此它也可能是三维模式形成的潜在机制之一。
在最初的48小时聚集期内，细胞会达到类似于植入后上胚层的状态，此时细胞具备响应次级培养基信号的能力19,21,24。通常，本文所述方案通过添加含有特定因子（如Wnt/β-Catenin激动剂）的次级培养基，短暂刺激细胞，提供足以诱导伸长的信号。Lancaster 等（使用人胚胎干细胞13）和Eiraku 等（使用小鼠胚胎干细胞11）此前描述的培养方法，均先在低黏附性的96孔板中进行短暂聚集，随后将聚集的细胞转移至Matrigel液滴中继续培养。尽管这两项研究中从聚集到植入Matrigel的时间有所不同，但均使用了大量细胞进行聚集体形成（约3,000–4,500个细胞）。相比之下，本文所述方案19使用的细胞数量显著减少（每个聚集体约400个细胞），而这一数量已被证实对伸长、打破对称性以及所观察到的极化过程至关重要19。此外，这些伸长结构可在更短的时间内生成，且无需嵌入人工基质：与Lancaster 等生成明确脑区所需时间（&#62;20–30天）13以及Eiraku 等生成视杯结构所需时间（约11天）11相比，生成极化伸长结构仅需5天。
然而，本文所述培养方法的一个局限性在于，这些细胞在接种后仅能培养约5-6天，此后细胞团块体积增大，在重力作用下会沉降至孔板底部，即使在未包被的塑料器皿上也会被迫发生黏附。后续实验若采用前述的人工基质，或许可延长观察与实验的时间窗口，目前相关研究正在进行，以明确以这种方式限制细胞团块所造成的影响。该技术的另一局限性在于，为了在不移除细胞团块的情况下更换培养基，必须在孔底保留少量培养液。这对化学遗传学实验的影响是必须考虑这种稀释效应以及前序培养基可能残留的效应：在给予3 µM Chi脉冲刺激的当天，实际递送的浓度为2.37 µM；而在后续更换培养基时，在72-96小时和96-120小时时间点之间分别会有0.499 µM和0.105 µM的药物残留。目前的研究尚未对稀释效应进行校正，仅假设每日更换培养基可将残留效应降至最低。
确保实验内和实验间可重复性的方案中有若干关键步骤。首先，mESCs 的起始培养物必须保持良好状态，不能过度汇合，且培养基应始终保持高质量。 即，新鲜且充分混匀（图5A,B）。不良的培养条件会对聚集体产生不利影响（图5Bi）。准确计数细胞以获得约400个细胞/40 µl的细胞悬液至关重要，因为细胞团过大将无法实现自我组织，且更易在每个孔中形成双细胞团。图 5Bii）而较小的聚集体无法达到能够响应刺激的合适密度图 5Biii）。一个关键的优化步骤是增加第二次PBS洗涤，以去除细胞悬液中的污染血清（步骤2.6）；这提高了聚集体的形成频率，并使聚集体的发育进程加快约24小时。接下来，需确保换液时施加足够的力度，以冲下可能黏附在孔板表面的聚集体；若未做到这一点，会导致聚集体“塌陷”（图 5Biv此外，如前所述（及下文所述），必须确保将类器官聚集体维持在悬浮培养状态，并防止其黏附于任何表面。一旦聚集体发生黏附，其基因表达模式及伸长潜能将受到破坏。
由于该技术相对简单，且在具备良好组织培养技术的人员能力范围之内，只要遵循这些关键步骤，大多数与聚集体形成相关的问题均可较快解决；完整的故障排除表见（表1）。一旦掌握，该技术可用于研究轴向发育、对称性破缺以及细胞命运决定事件。更具体而言，这些聚集体具有生成以往在体外培养中难以获得的细胞群体的潜力，例如脊髓组织和运动神经元。
伦理说明：需要谨慎指出的是，将本方案应用于人类胚胎干细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPS）培养时，可能使实验人员接近人类胚胎研究14天限制的法律界限，即原条的形成，具体规定详见英国2008年《人类受精与胚胎学法案》42。由于该法案涵盖所有活的人类胚胎，无论其生成方式如何，培养人类原肠胚样结构超过类似原条阶段将超出可许可研究的范围。

利用源自囊胚的胚胎干细胞（ESCs）培养物可研究和理解早期哺乳动物发育过程中的细胞命运决定。胚胎干细胞具有自我更新能力，并能分化为生物体的所有细胞类型。 即，它们具有多能性1,2尽管这些培养体系对于理解细胞命运决定的分子基础已经并仍在发挥重要作用，但它们无法重现原肠胚形成过程中胚胎所产生的一些空间排列结构和整体行为。在胚胎中，原肠胚形成过程将单一的上皮细胞层转化为三个不同的胚层，并赋予胚胎明显的前后轴向结构。3-5. 试图重现这些事件 离体 基于胚胎干细胞（ESCs）三维聚集体——即拟胚体（embryoid bodies, EBs）的生成，并将其置于分化条件下6,7这些聚集体可被诱导分化为多种不同的细胞类型，其中一些细胞类型在贴壁培养条件下难以获得或诱导效率极低，甚至根本无法生成； 例如，血液8 和原始生殖细胞9然而，使用EBs的一个局限性在于，它们无法表现出发育中胚胎的主要特征，如形态发生行为、胚层分布或轴向结构，从而导致空间结构紊乱6,10在一项报告中，用Wnt处理EBs可导致部分聚集体的基因表达出现微弱的极化，但未观察到明显的形态发生。7在近期的报道中，经过长时间培养的拟胚体（EBs）可发育出视网膜、大脑皮层和内耳感觉细胞等前部结构，这些结构与其胚胎中的对应组织相似，但缺乏体轴结构的发育环境。11-13.
Marikawa 的报告 等14在使用悬滴法形成的鼠P19胚胎癌（EC）细胞聚集体进行实验时，观察到起源于中胚层的伸长结构，这些结构类似于在两栖类和海胆胚胎的外胚层化胚体以及Keller外植体中所观察到的伸长现象。15-18由于小鼠胚胎干细胞（mESCs）中未观察到此现象，我们尝试通过mESCs的聚集体来重现P19 EC细胞中观察到的行为19 我们报道了可导致其对称性破缺和轴向伸长的培养条件。与P19细胞实验的一个重要区别在于，本文所述的聚集培养方案是在96孔板中进行的，类似于Eiraku所描述的方法。 等.20，而不是悬滴法。这一改变提高了聚集体回收效率以及实验内和实验间的可重复性。重要的是，将聚集体维持在独立的孔中可确保融合过程&#160;在聚集物之间（在合并悬滴中的聚集物时常见）不会发生聚集。此外，该方案的一个关键特征是在聚集后进行24小时的GSK3抑制剂CHI99021（Chi）处理，该抑制剂是Wnt/β-Catenin信号通路的强效激活剂。
本文所述方法为理解体外培养中自组织、轴向形成以及胚层特化的过程提供了基础，从而可对体内轴向发育进行推断in vivo19,21。因此，该方法有望实现对在胚胎中难以研究的发育过程进行深入的机制性分析。此外，该方法的一个潜在应用在于生成那些由于缺乏结构化的细胞微环境（如脊髓前体细胞21和运动神经元）而在贴壁培养中难以获得的组织和器官。三维细胞聚集体培养提供了一种物理结构和信号环境，这种环境可能无法通过传统方法实现，从而为以空间有序的方式获得胚胎谱系提供了一种新途径。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶</td><td>Grenier Bio-one</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>MSE</td><td>MSB020.CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>BES 缓冲盐溶液（BBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2891</td><td>通过将 50 mM BES 钠盐、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4 溶于蒸馏水中，并加入 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，再用 1 M HCl 调节 pH 至 6.96 制备 BBS+CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管（15 或 50 ml）</td><td>Greiner Bio-One&amp;nbsp;</td><td>118271 或 227261</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021（Chi）</td><td>CSCR</td><td></td><td>通过惠康信托-医学研究理事会剑桥干细胞研究所购买。储存浓度：10 mM 溶于 DMSO</td></tr><tr><td>解剖皿（30 mm 内径）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12678586</td><td></td></tr><tr><td>ESLIF</td><td></td><td></td><td>500 ml GMEM、5 ml 丙酮酸钠、5 ml 非必需氨基酸、5 ml GlutaMAX、1 ml β-巯基乙醇、50 ml FBS 和 550 &amp;micro;l LIF（1,000 单位）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biosera</td><td>FB-1090/500</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>溶于蒸馏水配制成 1%（w/v）溶液，高压灭菌后用 PBS（见下文）稀释至 0.1% 供单次使用</td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>改进型纽鲍尔血细胞计数板</td><td>Hawksley</td><td>AS1000</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（LIF），重组型</td><td>CSCR</td><td></td><td>由惠康信托-医学研究理事会剑桥干细胞研究所内部制备</td></tr><tr><td>n-丙基没食子酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370</td><td></td></tr><tr><td>N2B27/NDiff 227</td><td>Stemcells, Inc.</td><td>SCS-SF-NB-02</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>溶于水中配制成 8% 甲醛储存液，用含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 BBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 缓冲液稀释，得到 4% 工作液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>含钙和镁</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>无菌储液槽</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>无菌、未经组织培养处理、U 型底 96 孔板</td><td>Grenier Bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞聚集体的生成，展示体外对称性破缺、极化及涌现性集体行为 in vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

我们开发了一种改进现有拟胚体（Embryoid Body, EB）培养的方法，可通过悬浮培养的小鼠胚胎干细胞（mESCs）聚集体来研究自我组织、对称性破缺、轴向延伸以及细胞命运决定。将少量mESCs置于基础培养基中，在未经组织培养处理的U型底96孔板中聚集培养48小时，此后这些聚集体即具备响应实验信号的能力。经处理后，这些聚集体开始表现出极化基因表达的迹象，并在无外部不对称信号诱导的情况下，形态逐渐由球形细胞团转变为细长且高度有序的结构。这些结构不仅能表达三个胚层的标志物，还能主动呈现类似原肠胚形成过程的运动，表现为单个细胞从聚集体中定向脱离，且该过程关键性地发生于细长结构的某一特定区域。本方案详细描述了这些聚集体可重复形成的方法，以及通过激活Wnt/β-Catenin信号通路和抑制BMP信号通路等手段对其进行刺激，并利用单时间点或延时荧光显微镜进行观察分析。此外，我们还介绍了对现有小鼠胚胎整体免疫染色方法的改进，以实现对固定后聚集体中特定标志物的免疫细胞化学分析。聚集体的形态变化、基因表达模式及其长度均可进行定量测量，从而揭示信号如何影响轴向命运的决定。预计该系统不仅可用于研究轴向发育与组织等早期发育事件，还可更广泛地应用于自我组织过程及细胞命运决策机制的研究。此外，该系统可能为生成传统贴壁培养难以获得的胚胎来源细胞类型（如脊髓组织和运动神经元）提供适宜的微环境。

细胞铺板后立即观察到的形态及聚集后的形态
铺板后立即可在96孔板的每个孔中通过标准倒置组织培养显微镜观察到单个细胞的存在（图1B）。铺板后8小时内，这些细胞会因重力作用逐渐沉降至孔底，并开始聚集成独立的细胞簇（图1C）。24小时后，细胞完成初步聚集，形成界限清晰但边缘不规则的紧密聚集体，此时单个细胞彼此之间已难以分辨（图1D）。至第2天结束时（48小时），聚集体应呈现“干净”的外观，已将孔内所有细胞全部纳入（图1E）；此时孔底可能残留少量从聚集体脱落的细胞。若聚集体是在N2B27培养基中形成的，则在此时间点应呈球形，直径约为150–200 µm，并在孔内自由悬浮移动（即，不贴附于孔底）。若使用其他培养基（如，ESLIF或添加特定因子的N2B27）进行聚集，则可能改变聚集体的初始形态以及其对后续刺激的反应（Turner et al.，待发表）。
典型的形态学变化
在48至72小时之间加入含有Chi的继代培养基进行24小时脉冲处理（图1A、5A），可形成形态清晰且呈细长状的类胚体聚集体，并表现出胚层特异性标记物的极化表达19,21。Chi脉冲处理结束后（72小时），聚集体即开始脱落细胞，并在当天末期逐渐显现对这些信号的响应（图3A）。这些响应表现为基因表达和形态学上的变化，二者均依赖于聚集体在N2B27培养基中初始聚集48小时后所接受的处理方式（图3B）。若仅需终点分析，则最佳成像时间为约96–120小时。此时聚集体已发育出清晰的形态结构和基因表达模式（图3A），其大小和质量仍足够低，使用P200移液器吹打即可有效去除可能附着的聚集体。若未能有效防止聚集体与孔板的附着，将对聚集体的正常形成产生不利影响（图5Biv）。聚集体的形态结构和基因表达模式可因不同处理方式而发生改变。图中展示了在持续性或脉冲性处理条件下，单独使用或联合使用BMP4、Dorsomorphin H1（BMP受体抑制剂）、ActivinA、SB43（Activin/Nodal抑制剂）、bFGF或PD03（MEK抑制剂）等因素的代表性结果（图3B）。
聚集体成像与定量图像分析
聚集体可通过宽场显微镜成像（主要用于延时成像19），或经固定和免疫染色后用于共聚焦成像19,21（图2）。当前的实验方案及上述成像描述可从这些聚集体中获取定量信息。在完成共聚焦或宽场图像采集后，可测量聚集体直径或主轴（分别为球形或伸长形；图4A、B）的长度以及沿该轴的相应基因表达。这些分析方法同样适用于延时图像，可在不同条件下获得聚集体生长速率、大小及伸长程度的信息（图4）。
<img alt="细胞增殖阶段；延时显微成像；N2B27培养基比较；5分钟至48小时生长。" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 典型的时间进程与早期形态学特征。 (A) 聚集实验的典型时间进程。将小鼠胚胎干细胞（10个细胞/µl）在96孔板中以N2B27培养基悬浮培养，进行48小时聚集（A部分中的p1、p2）。 (B) 接种后立即观察（t = ~5分钟），可见悬浮液中的单个细胞，并在8小时时已开始形成细胞团 (C)。(D) 培养24小时后，每个孔中形成单个聚集物，直径约为100 µm。(E) 聚集48小时后，聚集物直径范围为150–200 µm。此时，移除聚集培养基（N2B27），加入第二阶段培养基，用于后续整个实验（A部分中的p1），或培养24小时后再换回N2B27（A部分中的p2）。比例尺=100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="载玻片上细胞聚集体安装示意图，显示用于显微镜设置的间隔物和盖玻片。" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 将聚集体安装到显微镜载玻片上。 聚集体经固定、免疫染色并置于封片剂中后，用移液器将每个聚集体以 17 µl 液滴的形式转移至显微镜载玻片上（A，B，B’）。在聚集体液滴之间保留足够的空间，以防止其相互融合。在载玻片的每个角落使用双面胶带制作间隔物（A，A’，B），并在其上放置玻璃盖玻片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脉冲与连续暴露条件下细胞发育；显微镜图像；分化分析。" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 不同处理方式对聚集的 ES 细胞形态的影响。 在 N2B27 培养基中培养 2 天后，ES 细胞已形成细胞团。加入特定因子，无论是 1 天脉冲处理 (A) 还是持续处理 (B)，均可改变细胞团在基因表达极性、伸长能力或整体形态方面的表型。本图中的示例为来自 Bra::GFP30 (A) 或 Sox1::GFP27 (B) 小鼠 ES 细胞的细胞团，在 120 小时后成像，并按所示条件处理。Chi：CHIR 9902131；SB43：SB 43154232；DM：DorsomorphinH133,34；PD03：PD0325901。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物生长的荧光分析；荧光、长度和圆度随时间变化的曲线图。" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 聚集体的定量分析。 在给予Chi刺激24小时后，由Bra::GFP mESCs25,30形成的典型聚集体，并在120小时时进行成像。图中显示了明场与GFP通道的合并图像，以及从A点到B点标记聚集体“脊柱”的分割线(A)，沿此线可测量聚集体的荧光强度和长度(B)。图中还展示了同一次实验中24个聚集体的长度(C)和“圆度”(D)。诸如圆度(D)、圆形度、周长和面积等形态描述参数，可利用图像分析软件FIJI35中的Image Analysis Cookbook插件进行测量。各时间点的均值以水平线表示；误差棒表示标准差；(A)中的比例尺为200 µm。由于不同报告基因细胞系之间存在细微差异，预期在给予Chi刺激后，聚集体的平均最大长度和平均最小圆度会有所不同。在不同细胞系之间，我们发现聚集体的平均最大长度范围约为~400–800 µm，平均最小圆度介于0.4至0.6之间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Cell aggregate formation diagram; typical vs. variations in quality, cell count; microscopy images." src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 聚集体形成失败的示例。 可重复生成聚集体（A）的能力取决于若干关键因素，包括：（Bi）新鲜且充分混匀的继代培养基，（Bii、Biii）初始细胞数量的准确计数，以及（Biv）确保聚集体不形成贴壁菌落 即，撞击到孔板表面。图B展示了上述每种条件下聚集体形成的典型错误示例。比例尺见图中所示；详细信息请参见故障排除表（表1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养问题排查表；问题、原因、解决方案；聚集体形成分析。" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表1. 问题排查指南。 列出了与聚集体形成实验方案相关的常见错误及其解决建议。
<img alt="包含GFP、mCherry、Cerulean标签的材料表，引用研究文献，无货号，n/a条目。" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 用于检测聚集体形成的细胞系汇总表。 多种细胞系19,22,27,30,36-40已被表征其聚集体形成能力；尽管不同细胞系之间存在细微差异且已有观察报道，但上述各细胞系在伸长行为和形态特征方面表现出相似的动力学特性。在基因表达方面，表达模式取决于所表达的基因，但在同一细胞系中，经过多次传代后其表达模式通常保持一致。为保证实验一致性，我们所用的聚集体均来自体外培养传代次数未超过15代的细胞。
<img alt="用于实验室实验的抗体试剂表格，包含公司、目录号和稀释比例。" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表3"> 
表3. 本研究中使用的代表性抗体列表。 用于聚集体免疫染色的部分抗体及其稀释倍数。

我们已开发出一种方案，用于生成表现出自我组织、对称性破缺和轴向伸长的小鼠胚胎干细胞聚集体，其过程与轴向发育平行。该技术可用于研究轴向发育过程，并生成在单层培养中难以获得的细胞类型。

小鼠胚胎干细胞聚集体的生成，展示体外对称性破缺、极化及涌现性集体行为 In Vitro

我们开发了一种改进现有胚胎体（EB）培养的技术方案，可用于研究自我组织、对称性破缺、轴向伸长……

本实验方案的总体目标是生成均匀的小鼠胚胎干细胞聚集体，使其在悬浮培养中发生自我组织和轴向伸长。该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如组织相互作用在轴向特化以及原肠运动等过程中的自我组织作用。该技术的主要优势在于，能够在胚胎外以一种全新的解构视角来研究发育事件，而无需依赖胚胎本身。将小鼠胚胎细胞或 M MECs 在明胶包被的 25 平方厘米组织培养处理过的培养瓶中，用 ES.Lift 培养基进行培养，用于聚集体的生成。从含有细胞且融合度为 40% 至 60% 的组织培养瓶开始，吸除培养基，并用 PBS 洗涤培养瓶两次。加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，于 37 °C 孵育约 5 分钟，使细胞从培养瓶上脱落。接下来，向离散的细胞悬液中加入 5 毫升 Es.Lift 培养基并充分混匀。将细胞转移至 50 毫升离心管中，取出 1 毫升等分试样用于细胞计数。取 5 × 10⁴ 个细胞加入 5 毫升预热的 PBS 中，并在 170 × g 条件下离心 5 分钟。吸取上清液时不要扰动沉淀。然后轻柔地加入 5 mL PBS，并重复离心步骤。吸取尽可能多的上清液体积，同时不要扰动细胞沉淀。为防止PBS残留，将细胞沉淀重悬于1毫升预热的N2/B27培养基中，用P1000移液器充分混匀，制成均一的细胞悬液。然后用额外的四毫升 N2B27 培养基稀释。使用多通道移液器将细胞悬液转移至无菌储液槽中。充分混匀细胞，然后从储液槽中将 40 微升细胞悬液转移至未经组织培养处理的 U型底96孔板的每个孔中。96 孔板。需使用非组织培养板，以尽量减少细胞对板的黏附。将板置于含 5% 二氧化碳、37 摄氏度的湿润培养箱中孵育 48 小时，以使细胞在 48 小时后形成聚集体。从培养箱中取出培养板，在倒置显微镜下观察细胞，并确认细胞聚集体的存在。向预热的N2B27培养基中加入适量体积的10毫摩尔/升CHI99021储备液，使终浓度为3微摩尔/升。此为用于细胞刺激的次级培养基。使用多通道移液器向每个孔中加入150微升的继代培养基，施加足够的力度以冲散任何贴壁的细胞团块。在孵育结束后，将培养板放回细胞培养箱中继续培养24小时。小心移除培养基，避免吸出细胞团块。每孔加入150 µL新鲜的N2/B27培养基，施加足够力度以冲散任何贴壁的细胞团块。每24小时重复一次，总培养时间约为5天。为固定而制备细胞团块时，首先将移液管以30度角轻轻吸出每个孔中的培养液。为防止吸走细胞团块，向每个孔中加入150 µL PBS，静置数分钟使团块沉降至孔底，然后吸除PBS。使用无菌剪刀重复此洗涤步骤两次。将 P 1000 移液器吸头在其排液端上方约三毫米处剪断。用此吸头吸取并释放少量液体至孔中。为了搅动聚集体并使其从孔板底部松脱。然后将聚集体吸入移液器吸头中，并采用相同步骤将其转移至玻璃制果蝇解剖皿中。将所有需要进行相同免疫染色处理的聚集体收集到同一个解剖皿中。将解剖孔置于显微镜下，轻轻晃动使其内的聚集体移向孔中央。然后从孔的边缘小心吸去PPS，注意不要吸走任何聚集体。为固定聚集体，加入一毫升新配制的4%甲醛溶液，将培养皿置于4摄氏度的摇床上孵育两小时，摇床速度设为低速。小心吸除甲醛溶液，避免抽吸到任何聚集体，然后向孔中加入一毫升 PBS。将培养板放回轨道摇床上孵育10分钟。吸去孔中的PBS，再重复此洗涤步骤两次。接着，加入1 mL的P-B-S-F-T溶液，并将培养板置于轨道摇床上孵育10分钟。吸去溶液，再重复洗涤两次。每孔加入一毫升 P-B-S-F-T，以阻断聚集体的非特异性免疫反应性。将酶标板置于4摄氏度的轨道摇床上，低速孵育一小时。孵育结束后，小心吸去各孔中的封闭液，加入500 µL用P-B-S-F-T稀释的一抗溶液。用封口膜密封培养板以防止蒸发，并在4 °C、低速振荡条件下过夜孵育。随后，将一抗溶液替换为预冷的P-B-S-F-T。将培养板置于轨道摇床上洗涤聚集体，在4°C下以低速振荡5分钟。重复洗涤一次。在4°C下，使用P-B-S-F-T在旋转摇床上以低速再进行两次洗涤循环。如文字方案所述，去除洗涤液后，加入500 µL用P-B-S-F-T稀释的二抗进行孵育。加入1 µg/mL的herst以显示细胞核，并在4°C下避光于旋转转子上孵育过夜。在4°C条件下，用PBS FT进行另一次洗涤，置于锡箔包裹的盒子中避光操作。随后在室温下用含有0.2% FBS和0.2% Triton X-100的PBS或PBT缓冲液进行额外洗涤。小心吸除溶液后，在室温避光条件下，用1毫升甘油与PBT按1:1比例混合的溶液孵育聚集体30分钟。然后加入1 mL体积比为7:3的甘油与PBT溶液，孵育30分钟。为进行共聚焦成像而准备样品时，吸除甘油与PBT的混合溶液，并替换为1 mL封片介质。随后将聚集体以17 µL液滴的形式封片于载玻片上。使用移液器吸头，将一小段双面胶带自身折叠四次，制备一个间隔垫。然后在载玻片上的聚集体两侧各放置一个间隔垫，将盖玻片倒置并卡在间隔垫上，随后使用共聚焦显微镜观察聚集体。接种后48小时，可形成直径约150 µm、边界光滑的聚集体。另一方面，培养基质量差、细胞接种数量非最佳或细胞贴附不良，可能导致细胞无法正常聚集成团。使用糖原合成酶激酶3抑制剂CHI 99021连续处理120小时，可使球形聚集体变为伸长形态。此外，处理后聚集体的一端会出现SOX GFP阳性细胞的明显定位。不同的处理方式会导致单个聚集体形态及荧光标记呈现不同的形态学变化。可随时间追踪细胞团内的定位情况。一旦掌握该技术，研究人员若操作得当，可在约45分钟内完成细胞团的制备。细胞团形成后，可采用Q-R-T-P-C-R等其他方法替代免疫染色，以检测细胞团内基因表达的变化。观看本视频后，您应充分了解如何从乳腺上皮细胞（MECs）形成聚集体、施加特定刺激，以及如何制备聚集体用于免疫染色和共聚焦显微镜分析。

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发育生物学

小鼠胚胎干细胞的聚集体的产生，显示对称破缺，极化和突发集体行为<em&gt;体外</em

本视频演示了如何利用悬滴法在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为类胚体。...

小鼠胚胎干细胞（mES细胞）体外悬滴法分化

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

本文介绍一种基于表观遗传重编程的实验方案，可将人类胚胎干细胞（hESCs）定向诱导为均一的骨骼肌前体细胞群体；在允许性培养条件下，这些前体细胞可形成具有收缩功能的三维肌纤维簇（肌球体），从而重现人类骨骼肌的生物学特征。...

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传统方法在启动基于悬浮聚集体的人多能干细胞（hPSCs）心肌分化时，常因聚集体的大小和形状不均一而导致培养结果存在异质性。本文介绍一种利用微孔阵列生成尺寸可控的hPSC聚集体，并在促进心肌分化的条件下进行培养的可靠心肌分化方法。...

微孔中聚集体尺寸优化用于人多能干细胞的悬浮法心肌分化

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小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

可将细胞外基质配体图案化修饰到聚丙烯酰胺水凝胶上，从而在柔性的基底上实现人胚胎干细胞在限定区域内的克隆培养。该方法可与牵引力显微镜技术及生物化学检测相结合，用于研究组织几何形态、细胞自身产生的力学力与细胞命运决定之间的相互作用。...

在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。...

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

我们介绍了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭部间充质细胞的方案，用于进行二维（2D）生长和伤口修复实验的延时成像。同时提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流的形成及定向运动能力。...

分离与原代小鼠胚胎腭间充质细胞的延时成像以分析集体运动特性

本方案描述了如何从小鼠多能干细胞（PSC）生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3（TBX3）并结合心肌肌球蛋白重链（Myh6）启动子驱动的抗生素筛选，可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”（iSABs）中起搏细胞比例超过80%，表现出显著增高的搏动频率，并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.

基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

了解小鼠胚胎干细胞聚集体生成技术，用于研究发育生物学中的自组织与轴向延伸过程。该方法可在体外模拟胚胎发育，为干细胞研究与组织工程提供重要模型。

小鼠胚胎干细胞聚集体的生成，展示体外对称性破缺、极化及涌现性集体行为 In Vitro

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