一种快速定量荧光方法蛋白靶向小分子药物筛选
2015年10月16日
这种新的荧光测定药物筛选方法的总体目标是通过在载药蛋白模板内形成荧光金纳米簇来确定小药分子与靶蛋白的结合亲和力。该方法可以帮助回答蛋白质靶向药物发现领域的关键问题，例如药物分子的显示强度如何影响蛋白质的稳定性，使其不去折叠，从而导致不同强度的荧光金纳米簇的形成。这种 tenix 的主要优点是我们可以将蛋白质靶标转化为荧光生物传感器，以实现小分子药物的快速筛选，而无需复杂的仪器和繁琐的标记步骤。
结合我自己的知识以及合著者，她发现 li 加载了这种蛋白质，对等离子体有明显的稳定作用。纳米粒子激发了这种方法的想法。按照文本方案中的详细说明，从制备用于药物筛选的化学试剂开始此过程，以制备人血清白蛋白或 HSA 模板化金纳米簇，将两个玻璃瓶（每个玻璃瓶包含一个微型磁力搅拌棒）放在两个单独的温度可控磁力搅拌器上。
将一次磁力搅拌的温度设置为 60 摄氏度。接下来，在不断搅拌下向每个小瓶中加入 200 微升人血清白蛋白溶液、200 微升超纯水和 200 微升氯化金溶液，以使金离子封装在蛋白质模板内，两分钟后，向每个小瓶中加入 20 微升氢氧化钠溶液，以激活人血清白蛋白的还原能力，告知金纳米簇。开始记录每 20 分钟零分钟的反应时间。
每个样品抽取 50 微升，然后转移到 384 孔黑色板中。用酶标仪测量发射光谱。100 分钟后停止磁力搅拌。
在水槽中的流水下冷却玻璃瓶。始终绘制每个样品的光发射光谱，以获得不同温度条件下金纳米团簇的形成动力学。要制备牛血清白蛋白或 BSA 模板化金纳米簇，请将包含微磁力搅拌棒的玻璃瓶放在磁力搅拌的顶部。
将温度保留为室温。在玻璃瓶中混合 200 微升 BSA 溶液、200 微升尿素和 200 微升氯化金溶液，并不断搅拌。2 分钟后，加入 20 μL 氢氧化钠溶液。
激活 BSA 的还原能力，形成金纳米簇，并开始将反应时间记录为零分钟。每小时测量反应混合物的光发射光谱。将五个玻璃样品瓶放入每个玻璃样品瓶中，每个样品瓶都包含一个磁力搅拌棒，并预先用药物或纯 HSA 标记，放在温度可控的多点磁力搅拌上。
向每个小瓶中加入 200 μL HSA。然后将先前制备的每种药物溶液添加 1 微升到四个相应的文件中。此外，将 1 微升 DMSO 添加到搅拌器上的控制开关中。
将旋转速度设置为 360 RPM 并孵育 1 小时，以便在一小时后在每个小瓶中加入 200 微升毫 Q 水和 200 微升氯化金溶液，在不断搅拌下使药物与 HSA 结合。将温度设置为 60 摄氏度，不断搅拌 10 分钟。10 分钟后，将 20 μL 1.5 mol 氢氧化钠加入每个文件，并在零分钟开始记录反应时间。
用于测量的联合反应溶液应遵循与添加药物相同的顺序，并应尽快练习，以尽量减少时间滞后效应 从每个小瓶中快速吸取 50 μL 溶液。转移到 384 孔黑板中并测量发射光谱。每 10 分钟记录一次每个样品的发射光谱，在 4 个不同时间收集至少 4 个光谱。
重复这些步骤几次，以获得趋势一致的结果。绘制每个样品的时间分辨光发射光谱。确定所有样品的峰强度并绘制与时间的关系图，以比较不同载药蛋白模板中金纳米簇的形成动力学，以测量每种药物与 HSA 之间的结合常数。
用四种不同浓度的布洛芬溶液代替药物溶液。10 分钟后，在水槽中的流水下冷却玻璃瓶。从每个小瓶中吸取 50 微升上述溶液到 384 孔黑板中，并测量发射光谱。
在停止磁力搅拌之前，再重复这些步骤两次，以获得不同药物浓度的另外两组结果。然后绘制发光光谱并分析在每个单独批次中获得的原始结果。在 Origin Pro 等软件中绘制每个样品的光发射光谱并确定峰强度。
计算并绘制相对荧光强度与药物浓度的关系图。然后通过将数据拟合到单个位点绑定模型来计算绑定常数。使用 Mics cementin 方程在 Origin Pro 等软件中执行此作。
选择菜单 分析拟合非线性曲线拟合，然后从设置函数选择页面上的生长 S 类别中选择 hail 函数。单击 fit to display。此处显示的拟合结果是在不同蛋白质变性条件下产生的金纳米簇的时间分辨光发射光谱的代表性结果。
可以观察到金纳米团簇在较高温度下形成得更快。尿素变性条件还可以促进使用 BSA 蛋白作为模板直接合成金纳米簇。使用载药 HSA 作为模板，基于金纳米簇荧光强度的快速荧光指标药物筛选的典型结果如下所示。
荧光强度越高，药物分子与 HSA 的结合强度越弱。这些光谱显示了药物负载浓度对负载布洛芬的 HSA 内部荧光金纳米簇形成速率的影响。药物浓度越高，所得金纳米簇的荧光信号越低，此处显示的是蛋白质药物结合常数测定的代表性结果。
它是通过使用 MICU 骨质蛋白方程拟合预加载不同浓度布洛芬药物的 HSA 模板中合成的金纳米簇的相对荧光强度来计算的。一旦掌握，如果执行得当，该技术可以在 30 分钟内完成，用于并行筛选多种药物。观看此视频后，您现在应该对如何合成载药蛋白中的缰绳、纳米簇以及确定药物与靶蛋白的结合亲和力（可通过产生的金纳米簇发出的荧光信号来检测）有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种新颖的药物筛选方法，该方法利用了药物负载蛋白模板内部原位合成荧光金纳米簇（Au NCs）。该方法允许通过可见荧光确定药物与目标蛋白的结合亲和力，从而简化了筛选过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 药物发现
- 蛋白质化学
- 纳米技术
背景
- 理解药物-蛋白质相互作用对于有效的药物设计至关重要。
- 传统的药物结合筛选方法可能复杂且耗时。
- 荧光生物传感器可以为分子相互作用提供快速的洞察。
- 金纳米簇具有可以用于检测的独特光学特性。
研究目的
- 开发一种简单有效的小分子药物筛选方法。
- 利用蛋白质模板合成荧光金纳米簇。
- 增强对药物结合亲和力及其对蛋白质稳定性影响的理解。
使用的方法
- 准备药物筛选的化学试剂。
- 使用人血清白蛋白（HSA）作为金纳米簇合成的模板。
- 实施磁力搅拌以控制反应。
- 测量荧光强度以评估药物结合。
主要结果
- 该方法成功地在蛋白质模板内产生了荧光金纳米簇。
- 荧光强度与药物分子的结合亲和力相关。
- 该方法展示了在不使用复杂仪器的情况下进行快速药物筛选的潜力。
- 观察到药物负载蛋白的稳定化效应。
结论
- 这种新颖的筛选方法提供了一种简单的方法来评估药物-蛋白质相互作用。
- 它可以促进生物医药领域中更快的药物发现过程。
- 使用荧光生物传感器代表了药物筛选方法的重大进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, label-free assessment of small molecule binding to target proteins using fluorescence readout from in situ synthesized gold nanoclusters. It supports early-stage target validation by providing quantitative, reproducible binding affinity data without sophisticated instrumentation. The approach improves screening throughput and reduces mechanistic ambiguity in lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding strength of drug candidates to albumin proteins via inverse correlation of fluorescence intensity with binding affinity.
- Operational Value: Enables parallel screening of multiple compounds in 384-well format with results obtainable in approximately 30 minutes.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by identifying compounds with higher binding affinity through lower fluorescent signal output.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence intensity outputs that correlate with drug-protein binding constants (KD) when drug concentration is varied.
- Reproducibility: Uses standardized denaturing conditions (60°C or urea) to ensure consistent nanocluster formation kinetics across replicates.
- Scalability: Compatible with high-density microplate formats for parallel compound evaluation in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides binding affinity data that can inform preclinical dose selection and target engagement studies.
- Mechanistic De-risking: Links drug-induced protein stabilization to reduced nanocluster formation, offering insight into binding effects on protein conformation.
- Platform Reuse: Adaptable to other serum albumin models (e.g., BSA) and extensible to additional drug-target systems beyond the validated ibuprofen-HSA model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting lead identification by delivering binding affinity measurements that precede functional assays and medicinal chemistry optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of drug-target interactions through direct fluorescence readout of binding-induced changes in protein nanocluster templating.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs suitable for primary screening campaigns requiring affinity ranking of compound libraries.
- Analytics: Produces time-resolved fluorescence emission spectra and peak intensity measurements that allow kinetic and equilibrium binding analysis.
- Translational Research: Supports advancement decisions by providing KD estimates alignable with orthogonal biophysical methods.
- Enterprise Reuse: Represents a portable, low-infrastructure capability for binding affinity assessment across multiple projects and protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by correlating fluorescence signal with binding affinity through a physical transduction mechanism.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling or complex detection systems, reducing assay development time and reagent costs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of compounds based on binding strength before investing in downstream characterization.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by delivering early, quantitative binding data that inform lead optimization paths.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and nonlinear regression for binding constant calculation.
- Dependent on access to temperature-controlled magnetic stirrers, microplate readers with emission scanning capability, and 384-well black plates.
- Necessitates standardization of denaturing conditions (temperature or urea concentration) across laboratories to ensure reproducible nanocluster formation.
- Adaptation to non-albumin proteins may require optimization of reducing conditions and nanocluster templating efficiency.
- Practical limitation: Method assumes drug binding alters protein’s reducing microenvironment; may not apply to targets where binding does not affect nanocluster nucleation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Synthesis of Protein-templated Gold Nanoclusters (Au NCs)
3:17
Screen Relative Binding Affinity of Different Small Molecular Drugs to HSA
5:19
Measure the Binding Constant of a Specific Drug to HSA
6:41
Results: Studying Protein-drug Binding by Forming Fluorescent Gold Nanoclusters (Au NCs) using Drug-loaded Serum Albumen as Template
7:53
Conclusion
