Name: 运用离体全胎儿各器官的直立滴文化的过程中鼠标研究器官发育过程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习离体直立液滴培养技术，用于研究小鼠胎儿器官发育过程。该方法通过免疫荧光显微镜观察器官结构变化，帮助研究人员探索器官发生机制。

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作者的研究得到了以下资助：CancerFree KIDS 研究基金、美国出生缺陷基金会 Basil O’Connor 新兴学者奖（编号：#5-FY14-32）、辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）董事会基金奖、CCHMC 研究创新与试点基金奖，以及 CCHMC 发展基金。作者还感谢 Capel 实验室在本技术初始优化过程中提供的支持。

本研究中使用的所有小鼠均为购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的CD-1品系小鼠。此前的培养实验也曾在其他品系（如C57BL/6J，数据未显示）上进行，但任何品系均可使用。妊娠成年雌鼠年龄约为2至3个月，在胚胎取出前通过吸入CO2实施安乐死，随后进行颈椎脱位和双侧开胸术。小鼠的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，实验方案经辛辛那提儿童医院医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
<ol>
	<li>配制70%乙醇溶液。将去离子水高压灭菌（用于制备加湿培养皿以及配制/稀释溶液）。用70%乙醇喷洒消毒解剖工具（镊子、剪刀和27 G针头注射器）。</li>
	<li>配制含钙和镁的10X磷酸盐缓冲液（PBS）（80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4、1 M CaCl2 6.75 ml&#160;、1 M MgCl2 3.75 ml&#160;）。溶于1 L无菌高压灭菌水中，搅拌至完全溶解，然后用滤纸过滤。使用时以水稀释10倍，得到1X PBS。</li>
	<li>将胎牛血清（FBS）在55 °C加热灭活30分钟，并用0.22 µm注射器滤器过滤除菌。</li>
	<li>配制38 ml&#160;1X完全培养基（称为完全DMEM，cDMEM），包含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%过滤除菌的热灭活FBS以及1/100稀释的青霉素-链霉素储备液。该培养基通常应新鲜使用，但可在4 °C保存1个月。</li>
	<li>用DMSO溶解VEGFR酪氨酸激酶抑制剂II（TKI II），配制成5 mg/ml的储备液，再用cDMEM稀释得到工作液。本研究中最终浓度为cDMEM中含1.875 µg/ml&#160;。根据厂家建议，储备液在-20 °C可稳定保存长达6个月。工作液需现配现用，当天使用。 
	注意：工作液中药物浓度应为所需终浓度的两倍（因后续在液滴中会再稀释一倍）。同时，配制相同体积的含等量DMSO的cDMEM作为“对照”处理。</li>
	<li>分别用蒸馏水配制尾部消化试剂（50 mM NaOH和1 M Tris-HCl [pH 8.0]）。</li>
	<li>将XY PCR引物（XY正向引物5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3'和XY反向引物5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3'）共同溶于无核酸酶水中，配制成25 μM的储备液。</li>
	<li>配制50X TAE缓冲液（242 g Trizma Base、57.1 ml&#160;冰醋酸、100 ml&#160;0.5 M EDTA [pH 8.5]，加水至终体积1 L）。配制1X TAE电泳缓冲液（取20 ml&#160;50X TAE，加水定容至1 L）。</li>
	<li>配制2.5%琼脂糖溶液（0.625 g琼脂糖、0.5 ml&#160;50X TAE缓冲液、24.5 ml&#160;水），在微波炉中加热至沸腾，冷却至约55–65 °C（可触碰温度）。冷却后加入2 µl&#160;1%溴化乙锭溶液，倒入制胶模具。 
	警告！溴化乙锭为诱变剂和致畸剂，操作时请佩戴腈手套并遵循适当的安全规程。也可选用其他潜在毒性较低的凝胶染色剂或显色剂。</li>
	<li>为免疫荧光实验配制封闭液（含0.1% Triton X-100、10%胎牛血清[FBS]和3%牛血清白蛋白[BSA]的PBS）。</li>
	<li>为免疫荧光实验配制洗涤液（含0.1% Triton X-100、1% FBS和3% BSA的PBS）。</li>
	<li>为免疫荧光实验配制PBTx（含0.1% Triton X-100的PBS）。</li>
	<li>准备用于培养的孵育培养皿。在大号（直径100 mm）培养皿中加入35 ml&#160;高压灭菌水，放置于解剖和培养操作区域附近。</li>
</ol>
2. 从小鼠（Mus musculus）中分离胎儿睾丸
<ol>
	<li>每天早晨检查雌性小鼠是否有阴道栓。发现阴道栓当天的中午定为 E0.5。按照批准的动物实验方案，在 E11.5 处死怀孕雌性小鼠。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠腹部。</li>
	<li>使用精细剪刀在腹部皮肤和腹膜上做 V 形切口，将组织瓣拉开以暴露内部器官。</li>
	<li>在子宫角两端找到卵巢。用剪刀剪断卵巢及其连接组织，将含有胚胎的子宫从母体中分离出来。</li>
	<li>轻轻剪开胎盘对侧的子宫壁，暴露卵黄囊。注意不要刺破卵黄囊，以免损伤或丢失胚胎。</li>
	<li>在胎盘附近剪断，取出含有胚胎的卵黄囊，并将其放入含有钙和镁离子的 PBS 溶液的培养皿中。钙和镁离子的存在有助于维持细胞黏附分子的功能，保持组织结构完整性，并防止组织黏附到解剖工具上。</li>
	<li>用镊子小心刺破卵黄囊，形成一个开口，使胚胎能够滑出，从而去除卵黄囊和羊膜。一旦胚胎脱离卵黄囊，剪断脐带。</li>
	<li>从此步骤开始，在无菌细胞培养罩内的显微镜下操作。用镊子夹住胚胎颈部两侧，捏除头部并弃去。</li>
	<li>取下尾部并放入新的微量离心管中，用于 XY PCR 分析以确定胚胎性别。 
	注意：虽然在收获后尽快培养性腺最为理想，但也可在培养前先取尾部 DNA 进行 XX/XY 基因分型，以便明确每个胚胎的性别，仅培养所需性别的样本。在进行基因分型期间，可将胚胎分开存放（以便追踪）于 4 °C 或冰上，直至准备进行培养。需注意的是，这段脱离 in utero 或培养环境的时间可能会影响胚胎在培养中的存活率或后续发育。</li>
	<li>用一对镊子夹住胚胎腋下，将其仰卧固定在培养皿底部（通常使用非优势手操作的镊子）。在整个解剖过程中保持该对镊子位置不变，以固定胚胎不动。</li>
	<li>用另一对镊子去除覆盖腹部的皮肤，并轻轻移除肝脏、肠道及其他器官，暴露背部体壁。</li>
	<li>由于性腺位于背侧体壁、沿身体中线走行的大血管——背主动脉的两侧，可用闭合的镊子从泌尿生殖嵴下方轻轻插入，然后张开镊子向上提起，将泌尿生殖嵴整体取出。由于性腺与体壁连接较松，操作时应注意不要过快上提而未完全断开连接，否则可能导致性腺被拉伸，造成器官损伤。</li>
	<li>将泌尿生殖嵴转移至含有 cDMEM 的培养皿中，使其适应培养基环境。</li>
	<li>使用 27 G 针头将性腺-中肾复合体从其余的泌尿生殖嵴组织中分离。用一根针通过下压进行切割，另一根针引导组织位置，以实现最佳分离效果。避免针头在培养皿底部来回锯动，因为锋利的针头可能产生塑料碎屑并黏附于组织上。确保中肾完全保留在性腺上。</li>
</ol>
3. 使用小分子抑制剂培养性腺
<ol>
	<li>将两个 20 µl&#160;移液器分别调节至 15 µl&#160;。使用干净且已灭菌的剃刀刀片，将其中一个带屏障的移液器吸头前端切去约 1–2 mm，用于性腺的转移和对照 cDMEM 的添加；另一个移液器则仅用于添加药物处理的 cDMEM。</li>
	<li>将性腺排列整齐，使其长轴与移液器吸头平行，以便使用切短的吸头轻松移取。注意避免性腺粘附在移液器吸头内壁上。</li>
	<li>将培养皿盖的一侧标记为对照液滴，另一侧标记为含药液滴。一个 35 mm 培养皿盖上只能放置两个液滴。确保培养皿盖上的标签与含有尾组织的微量离心管上的标签一致。</li>
	<li>用移液器将含有单个性腺的 15 µl&#160; cDMEM 加入小（35 mm）培养皿盖上的液滴中（仅使用培养皿盖，因为培养皿底部过高，无法放入加湿的培养皿培养室中）。在培养皿盖两侧分别放置两个独立的含性腺液滴，彼此之间保持足够距离。在显微镜下检查，确认性腺已成功转移至液滴中。</li>
	<li>向指定为对照的液滴中，额外加入 15 µl&#160;含 DMSO 的 cDMEM（步骤 1.5 中配制），使该液滴总体积达到 30 µl&#160;。仅使用专用于对照的移液器，避免接触药物。</li>
	<li>向另一个液滴（药物处理样本）中加入 15 µl&#160;含 TKI-II 的 cDMEM，使该液滴总体积达到 30 µl&#160;。仅使用专用于药物处理样本的移液器。</li>
	<li>使用移液器将液滴向外扩展成圆形，直至直径约为 15–18 mm，且性腺大致位于中央。调整性腺方向，使其侧向放置，以便清晰区分性腺与中肾。调整肺组织方向，使其两个叶平展。
	<ol>
		<li>尽管液滴直径可能略有差异，需确保性腺未漂浮，并依靠表面张力固定在原位。确保液滴之间互不接触，且不接触培养皿盖边缘。若缺乏表面张力，器官在培养过程中会贴附于盖面并展平，从而导致器官形态发生扭曲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将含有液滴的培养皿盖正面向上放置于大（100 mm）加湿培养皿的水面上。确保培养皿盖底部无气泡 trapped，且其平稳地浮于水面。切勿将培养皿盖倒置，并注意避免水接触到液滴所在的盖顶表面。</li>
	<li>为形成一个小型加湿培养室，应立即用较大的加湿培养皿的盖子覆盖其上，以封闭性腺培养样本。操作应迅速，以尽量减少培养基的蒸发。确保较小的培养皿与较大培养皿盖之间留有足够空间以便自由移动；否则，冷凝水可能形成密封，阻碍组织的气体交换。</li>
	<li>当两个小培养皿盖放入培养室后，立即将整个培养室放入培养箱中。在 37 °C、加湿的 CO2 培养箱中孵育 48 小时。</li>
</ol>
4. 通过聚合酶链式反应确定胚胎性别的方法
<ol>
	<li>将胚胎尾部加入到一个1.5 ml&#160;微量离心管底部。</li>
	<li>向每根离心管中加入200 µl&#160;50 mM NaOH。</li>
	<li>在95 °C条件下孵育15分钟，或直至组织完全溶解。</li>
	<li>加入50 µl&#160;1 M Tris-HCl，轻轻短暂涡旋混匀。</li>
	<li>在1.5 ml&#160;微量离心管中配制新鲜的PCR主混合液，将各组分体积乘以样品总数：0.5 µl&#160;25 µM 引物溶液、2.5 µl&#160;10× Taq 缓冲液、0.5 µl&#160;10 mM dNTPs（脱氧核苷三磷酸）、19.3 µl&#160;无核酸酶水、0.2 µl&#160;DNA Taq 聚合酶。充分混匀。</li>
	<li>向含有3 μl&#160;消化后尾部裂解液的PCR管中各加入23 µl&#160;PCR主混合液。</li>
	<li>轻弹管壁混匀，短暂离心使样品沉降至管底。</li>
	<li>运行XY（短片段）PCR程序（表1）。</li>
	<li>在1× TAE缓冲液中，将样品（含5×上样染料）和DNA标准分子量标记物加入2.5%琼脂糖凝胶中。</li>
	<li>进行琼脂糖凝胶电泳，直至X和Y条带可被清晰分辨。</li>
	<li>使用紫外光成像凝胶并采集图像。</li>
	<li>分析X染色体特异性条带与Y染色体特异性条带（X染色体=331个碱基对[bp]，XY=302 bp）13；XY（雄性）样品将显示331 bp和302 bp两条条带，而XX（雌性）样品仅显示一条331 bp的条带。</li>
</ol>
5. 器官整体免疫荧光染色
第1天：
<ol>
	<li>使用剪去尖端的1,000 µl&#160;移液器从培养物中取出性腺。如有需要，可将其置于盛有PBS的培养皿中，以洗去培养基和试剂。随后将性腺转移至0.5 ml&#160;微量离心管中的PBS内。较小的管体有助于节省试剂，并更便于追踪管内的样品。
	<ol>
		<li>务必分别将对照组和处理组样品，以及XX和XY样品置于不同的离心管中，并使用不同的移液器分别从培养物中取出，以避免潜在的药物污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用PBS清洗性腺两次。从此步骤开始，本实验方案可使用不含钙和镁的1X PBS。清洗时，让性腺依靠重力自然沉降至管底，然后吸去上清液。注意避免移液时过于靠近性腺而导致样品丢失。</li>
	<li>尽可能彻底吸除管中的PBS。加入250 µl&#160;含0.1% Triton X-100的4%多聚甲醛PBS溶液，在4 °C条件下于摇床上孵育过夜（O/N）。或者，也可在4 °C摇床上固定2小时。注意！多聚甲醛为有毒物质，操作时须遵循相关安全规程。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="4">
	<li>在室温下，用 250 µl&#160;PBTx 将性腺冲洗两次。</li>
	<li>在室温下，用 250 µl&#160;PBTx 在摇床上对性腺洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>在室温下，于摇床上用 250 µl&#160;封闭液封闭性腺至少 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 下，于摇床上用 250 µl&#160;用封闭液稀释的一抗溶液对性腺过夜染色。</li>
</ol>
第3天：
<ol start="8">
	<li>用 250 µl&#160;洗涤液将性腺冲洗两次。</li>
	<li>在摇床上，于室温下用 250 µl&#160;洗涤液洗涤性腺，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。</li>
	<li>在摇床上，于室温下用 250 µl&#160;封闭液封闭性腺 1 小时。</li>
	<li>用铝箔包裹微量离心管，以避免荧光二抗暴露于光照下。</li>
	<li>在摇床上，于室温下用 250 µl&#160;含 Hoechst 33342 的封闭液稀释的二抗孵育性腺 2–4 小时。或者，在摇床上于 4 °C 过夜孵育二抗和 Hoechst 33342。</li>
	<li>用 250 µl&#160;PBTx 将性腺冲洗两次。</li>
	<li>在摇床上，于室温下用 250 µl&#160;PBTx 洗涤性腺 3 次，每次 10 分钟&#160;。</li>
	<li>使用切口移液枪头将性腺转移至载玻片上，尽量减少液体残留。用移液器吸除多余液体，但需确保组织不干燥。</li>
	<li>用镊子将性腺按所需方向摆放，并迅速滴加一滴封片剂以封固性腺。确保封片剂完全覆盖所有样本；关键是要避免样本干燥。</li>
	<li>选用合适大小的盖玻片（1.5 号规格）轻轻覆盖样本。让封片剂自然扩散至盖玻片整个表面。如有必要，可轻轻按压盖玻片的角落，以消除较大的气泡。</li>
	<li>用透明指甲油在载玻片边缘密封，以减少封片剂的蒸发。将封片后的载玻片置于暗处，4 °C 保存。</li>
</ol>

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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li>
<li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究展示了一种ex vivo器官整体液滴培养法，该方法在研究胎儿发育方面具有多种潜在应用。该技术适用于多种器官，使研究者能够探究那些由于胚胎难以接近或存在胚胎致死风险而难以通过in vivo方法研究的生物学问题。相比其他in vitro方法（如哺乳动物细胞系培养），该培养方法具有额外优势：可直接使用完整的器官，从而保留了in utero状态下存在的关键细胞间相互作用；同时培养体系体积极小（约30 μl），因而仅需极少量稀有或昂贵的药物试剂。
液滴培养方案的关键要点包括：a）器官的洁净解剖。洁净解剖有助于维持组织结构的完整性，并尽量减少暴露的切割面或受损表面，这些表面可能附着于培养皿表面，从而干扰培养过程；b）将器官正确地定向置于液滴中，以利于器官的生长和形态发生；c）制备适当大小的液滴，使液滴能够通过表面张力固定器官位置，同时又不会过快干燥；d）根据器官选择合适的液滴体积。液滴体积应根据器官大小通过实验经验确定，但30 μl通常可作为合理的起始体积；e）选择与所研究生物学问题相关的发育阶段；以及 f）维持无菌...

器官再生 体内 在人类中非常有限；因此，组织工程——即利用宿主捐献的单个细胞开发组织和器官——正成为一种具有吸引力的潜在器官替代疗法。然而，要使这种治疗策略取得成功，必须对器官形态发生过程中涉及的因素和细胞间相互作用进行深入研究并充分理解。由于传统方法无法研究特定器官的发育过程，研究人员已转向替代性的全胚胎或全器官培养技术。Kalaskar 等1 已表明 离体 全胚胎培养在58%的培养胚胎中可获得与之相当的结果 在子宫内 发育，表明 离体 培养方法是进行器官发生研究的可行替代方案。
一种个性化的器官培养系统，例如本研究中的系统 离体 液滴培养系统，可在排除全身性影响的情况下实现对整个器官的分析，同时通过添加药理学试剂或抗体，调控特定的信号通路或细胞间相互作用。传统上，胎儿器官发育的研究主要依赖于转基因和基因敲除小鼠技术，以及经母体给予的药理学试剂。然而，这些技术与处理方法存在一定的技术难题 体内；大多数担忧集中在药物对多个器官的同时影响，这通常会导致胚胎致死。通过药理学手段干预胎儿发育的研究还存在另一个问题，即药物对母体的作用可能间接影响胚胎发育。 在子宫内 (例如， 药物在到达胚胎前的母体代谢情况，以及这些试剂是否能够穿过胎盘屏障。
此处所述的全器官培养技术改编自Maatouk首次描述的实验方案 等.2，其中完整胎儿性腺在 离体 直立液滴培养。培养胎儿性腺的一个显著优势在于，小分子抑制剂能够通过简单的扩散作用轻松渗透至整个器官。DeFalco 等 已表明利用此方法 离体 结合小分子抑制剂的液滴培养法可用于研究性腺发育过程中的信号传导过程及相互作用3；这些过程将难以观察 体内 由于技术难题（例如，通过基因或药理学方法研究药物穿过胎盘的能力或对多个器官的致死效应。
液滴培养不仅在某些方面相较于传统方法有所改进 在子宫内 实验，而且也是一种改进 体外 和 离体 系统也同样如此。利用细胞系研究形态发生极为困难，因为细胞系缺乏多样的细胞类型，缺少能够支持器官结构形成的關鍵细胞外基质（ECM）组分，并且在信号级联中可能出现人为假象。尽管组织工程在构建模拟ECM的支架方面已取得显著进展，但由于尚不明确器官发生过程中每种细胞类型所需的具体信号，构建器官系统仍然具有挑战性。 体外其他 离体 已建立的系统先前被用于研究器官发生，或更具体地说，形态发生，并且在对琼脂中胎儿器官进行活体成像方面已取得很大成功4，Transwell小室5，滤光片6以及其他支架基质7,8液滴培养系统的优点在于，它能够通过减少试剂使用量（这些试剂通常价格昂贵）来研究形态发生，同时还为器官提供了表面张力，这对于生长和信号传导能力具有重要意义9.
在小鼠中，睾丸的初始形态发生发生在胚胎期（E）E11.5至E13.5阶段；这些阶段是研究影响性别特异性分化的因素的最佳时间窗口。睾丸形成过程中发生的关键事件包括睾丸索结构的建立以及睾丸特异性血管网络的形成。利用这一 离体 全器官液滴培养系统，可通过使用小分子抑制剂阻断血管内皮生长因子（VEGF）受体的活性，从而改变雄性特异性血管化并抑制睾丸形态发生；VEGF介导的血管重塑对睾丸发育至关重要10-12该技术可成功应用于其他器官，并可针对发育过程中的特定时间窗口。整体器官成像能够可视化重要结构以及因施加各种抑制剂而引起的结构和细胞变化。重要的是，该系统具有优势，研究人员可借此避免母体给药或全身性干扰可能带来的混杂效应 体内 靶向基因策略。因此，这种全器官 离体 液滴培养系统可显著增强对胎儿发育过程中特定器官内相互作用和信号传导的理解。

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片：方形（22 mm × 22 mm，1.5号）</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen 极致耐磨指甲油，透明色</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8联排0.2 ml PCR管 &amp;和分离的扁平帽状结构</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L 1000 μL，200 μL，20 μL，10 μL，2 μL</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 ml 微量离心管</td><td>丹维尔</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 ml 微量离心管</td><td>丹维尔</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l SHARP 精准屏障吸头</td><td>丹维尔</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l SHARP 精准屏障吸头</td><td>丹维尔</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l SHARP 精准屏障吸头</td><td>丹维尔</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l SHARP 精准屏障吸头</td><td>丹维尔</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器配27号针头</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M PES 注射器滤器</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>3 级定性滤纸 标准级，圆形，185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm 易握式细胞培养皿</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿（100 mm × 15 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>中国台湾新不伦瑞克 Galaxy 14 S CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro 梯度PCR仪配备控制面板</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>配备 AlphaEase 软件的 MultiImage 光学成像柜</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>已停止</td><td></td></tr><tr><td>绝对纯度200 proof乙醇</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（二碱式，分子量 142）Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（一碱式，分子量 136）KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion 无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCR 引物&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% 溴化乙锭溶液</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合物，100 mM溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq 聚合酶（含 10x 缓冲液）</td><td>丹维尔</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），粉末，第五组分，热激分离法</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），三重100 nm过滤</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>使用前加热灭活</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>以1:100的比例使用</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO），Hybri-max，经无菌过滤</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂 II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Sox9 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>使用稀释比例：1:4,000</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 PECAM1（CD31）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>使用稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>兔源Cleaved Caspase-3（Asp175）抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9661S</td><td>使用稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>大鼠 E-钙黏蛋白 / CDH1 抗体（ECCD-2）</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>稀释使用比例：1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342，三盐酸盐，三水合物</td><td>英杰公司（分子探针）</td><td>H1399</td><td>使用浓度为 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>712-165-153</td><td>使用稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure 驴抗大鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>712-605-153</td><td>使用稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555标记</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>稀释使用比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>使用稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗大鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>使用稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647标记</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>使用稀释比例：1:500</td></tr></tbody></table>

使用 离体 直立式液滴培养法培养小鼠胎儿完整器官以研究器官发生过程中的发育机制

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

研究器官发生 在子宫内 由于胚胎在子宫内发育，难以接触到试剂，因此在有胎盘哺乳动物中进行该过程在技术上具有挑战性。一种新开发的 离体 直立液滴培养法为相关研究提供了一种颇具吸引力的替代方案 在子宫内。该 ex 体内 液滴培养可通过使用多种阻断剂和激活剂来研究并调控细胞间相互作用及多样化的信号通路；此外，还可研究各种药理学试剂对特定器官发育的影响，同时避免全身性药物递送带来的不良副作用 在子宫内与其他方法相比 体外 系统中，液滴培养不仅能够研究在哺乳动物细胞系中无法重现的三维形态发生和细胞间相互作用，而且所需试剂显著少于其他方法 离体 和 体外 方案。本文展示了正确的小鼠胎儿器官解剖与直立液滴培养技术，随后通过全器官免疫荧光染色以验证该方法的有效性。 离体 液滴培养法可形成与所观察到的器官结构相类似的组织架构 体内 并可用于研究因胚胎致死而难以开展的其他研究过程 体内 模型。作为模型应用系统，将使用一种小分子抑制剂来探究血管化在睾丸形态发生中的作用。 离体 液滴培养法可扩展应用于其他胎儿器官系统，例如肺脏及其他潜在器官，尽管每种器官均需经过深入研究以确定其特定的实验方案改良。该器官培养体系为胎儿器官的实验研究提供了灵活性，采用此技术所获得的结果将有助于研究人员深入理解胎儿发育过程。

离体液滴培养法可用于操作整个器官（如性腺），以研究细胞间的相互作用和动态过程。图1以逐步示意图展示了如何制备E11.5胚胎的性腺液滴培养。培养方案的初始步骤包括从母鼠体内取出含有胚胎的子宫（图1A和1B）。将子宫从母鼠体内取出后，切开子宫壁，将胚胎从卵黄囊中释放至PBS中，以便进一步解剖（图1C-E）。在去除内脏器官后，胚胎体壁后侧的泌尿生殖嵴清晰可见（图1F），并可将其分离出来（图1G）。随后将性腺-中肾复合体从泌尿生殖嵴上解剖分离（图1H），并置于含有小分子抑制剂的液滴培养体系中（图1I，左侧：“T”表示处理组）以及不含小分子抑制剂的液滴中（图1I，右侧：“C”表示对照组）。含有液滴的小培养皿被放入自制的加湿培养室中（图1J），于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。
<p cl...

的&#160;离体&#160;直立液滴培养是现有方法的一种替代方案&#160;体外&#160;和&#160;体内&#160;实验技术。该方案易于操作，所需试剂用量较少，同时能够操控并研究胎儿的血管形成、形态发生和器官发生。

研究胎盘哺乳动物在子宫内的器官发生过程在技术上具有挑战性，原因是发育中的胚胎难以接触试剂……

本实验的总体目标是利用离体液滴培养技术，研究小分子抑制剂对胎儿器官发育的影响。首先打开怀孕小鼠的腹膜，取出含有胚胎的子宫；随后将胚胎从子宫中分离，并去除卵黄囊和羊膜囊。然后从胚胎中解剖并分离出输尿管芽-肾复合体。最后，将输尿管芽-肾复合体在含有或不含小分子抑制剂的液滴中进行培养。最终，通过免疫荧光显微镜结合细胞类型特异性抗体，观察器官结构的变化。与细胞系培养相比，我们这种全器官离体直立液滴培养方法的优势在于，其具有三维结构，可因空间定位而产生细胞间的相互作用，以及可能对器官形成和模式构建至关重要的细胞外基质信号传导。此外，我们的直立液滴技术所需试剂更少，从而降低了成本以及因副作用引起的潜在毒性。这一优势优于其他全器官培养技术，同时仍允许药理学试剂扩散至靶器官。尽管该技术可为胎儿睾丸的血管发育提供研究依据，但也可应用于其他胎儿器官（如肺），并可用于研究多种不同的生物学过程。在胚胎发育第11.5天（E 11.5）存在其他细胞信号通路。根据文本，在处死怀孕小鼠后，使用70%乙醇喷洒腹部，并用精细剪刀剪开。做一个V形切口以打开腹部皮肤和腹膜，向后拉开组织瓣以暴露前部器官。在子宫角的两端找到卵巢，然后用剪刀在卵巢及结缔组织处剪开，将含有胚胎的子宫从母体中分离出来。接着，轻轻剪开与胎盘相对的一侧子宫壁，暴露卵黄囊。注意不要刺破卵黄囊，以免损伤或丢失胚胎。然后在靠近胎盘处剪开，取出带有卵黄囊的胚胎，并将其放入含有钙和镁的 PBS 溶液的培养皿中，这有助于维持细胞黏附分子的活性，保持组织结构，并防止组织黏附在器械上。用镊子小心刺破卵黄囊，制造一个小孔，使胚胎能够从中滑出，从而去除胚胎的卵黄囊和羊膜。一旦胚胎完全脱离卵黄囊，即剪断脐带。从此时起，使用位于无菌组织培养罩内的显微镜。用镊子夹住胚胎颈部两侧，取下胚胎头部，弃去头部；随后取下尾部，并将其放入新的微量离心管中，用于X-Y-P-C-R分析以确定胚胎性别。接着，用一对镊子固定胚胎腋下部位，将胚胎仰卧位固定在培养皿底部。去除覆盖腹部的皮肤，轻柔地移除肝脏、肠管及其他器官，以暴露位于体壁后方的泌尿生殖嵴。用镊子小心张开后从泌尿生殖嵴下方插入并轻轻上抬，将泌尿生殖嵴取出。注意避免损伤性腺。将泌尿生殖嵴转移至含有 C-D-M-E-M 的培养皿中，使其在培养基中适应环境，并使用 27 号针头将性腺-体腔上皮复合体（gonad Sphs complex）从其余的泌尿生殖桥组织中分离。用一根针通过下压进行切割，另一根针引导组织，以实现最佳分离效果，便于后续培养。使用干净且已灭菌的剃须刀片，将一对20微升移液枪的体积设置为每支15微升。将其中一支屏障移液枪头的尖端切去约1至2毫米，用于转移性腺并加入对照C-D-M-E-M。将性腺沿其长轴与移液枪头平行排列，以便可用截短的枪头轻松移取。将一个35毫米培养皿盖的一侧标记为对照液滴，另一侧标记为

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

运用<em&gt;离体</em&gt;全胎儿各器官的直立滴文化的过程中鼠标研究器官发育过程

本视频演示了从胚胎第12天的小鼠中分离和培养前脑外植体的实验方案。介绍了取出子宫、从子宫中取出胚胎以及胚胎解剖的操作步骤。此外，还展示了将这些外植体转移至专用培养膜上进行培养的方法。利用此制备方法，可在体外研究前脑的发育过程以及基因表达的变化。...

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